Способ получения трасформированных клеток двудольных растений

СОЮЗ СОВЕТСНИСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК 9) (И) Т К ПАТЕНТУ М 28 ни (ПЯ)Фралей, Роберт джерс (цЯ) 2 (088.8)пс 1 Эдгес 1 ей Се аг В 1 о 1 о 8 у ог КаЬ 1 апс 1 С.Б 7-548. ОВАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ НЫХ КЛЕТОК ДВУДОЛЬ (57) Изобретение ои, в частности ИУ. ТРАНСФОРМРНХ РАСТЕНИЙносится кк генетиче биотехно ской инлоги Изоб биотехноческой инение относится астности к ген и ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗО(72) Роберт ТомасХорш, Стиви Гэри Ро(56) Т 1. р 1 авшЫв аЕп 81 пеегп 8 Мо 1 есц 1Р 1 ап 1 Рцшог, изд. СБсЬе 11, 1982, р. 53 женерии растении.Целью изобретения является повышение выхода нормальных трансформирован,ных растительных клеток.Конструируют ряд плазмид,рМОИ 41, с правым краем Т плазмиды нопалинового типа и 5 участком ге- .на нопалинсинтазы (ИОБ), РМОЯ 109 с3 участком БОЯ гена, и селектируемыммаркерным геном /Ярс/Бйг/, которыйпозволяет осуществлять селекцию клеток А, гцшейас 1 епв, содержащих коинтегративные Тд плазмиды с химерическими генами, рМОИ 113, с участкомДНК, последовательность которой иден 5 С 12 Н 15/00 п-ц 3 аженерии растений, Целью изобретенияявляется повышение выхода нормальныхтрансформированных растительных клеток, Способ заключается в том, чтоконструируют плазмиды РМОБ 4 1, рМОИ113, рМОБ 109, расщепляют их эндонуклеазами до образования целевых фрагментов, лигируют полученные фрагменты с образованием промежуточного вектора рМОМ 120. Плазмиду рМОВ 128 (илилюбую другую плазмиду, полученную путем включения химерного гена рМОИ 120вводят в А 8 гоЪасСег 1 цш гцшеЙасепв,содержащие Т плазмиды, Контегративные плазмиды переносят в растительныеклетки, отбирают трансформированныерастительные клетки и выращивают трантрансформанты на среде до образованияприростков. тична последовательности в участкеТ-ДНК Т плазмиды октопинового типа.Каждую плазмиду расщепляют эндонуклеазами до получения целевого фрагмента, Лигируют полученные фрагментыи получают промежуточный векторРМОИ 120,Плазмида рМОИ 120 обладает следующими характеристиками,Имеет три уникальных сайта рестрикции (Есо 21, С 1 а 1, Н 1 по 111), реплицируется в нормальных клеткахЕ, со 1 Однако не реплицируется внормальных клетках АдгоЬасгегжш,без коинтеграции с другой плазмидой,например Т. плазмидой, которая реплицируется в клетках АдгоЪасгегхцш.ную жидкость декантируют и хлопья осторожно повторно суспендируют в промывочном растворе, Эту суспензию выливают в склянки Бэбкока. Склянки заполняют на 2-3 см над основанием гор 5лышка. 1 мл растительной среды МБ 9осторожно помещают слоем поверх про."мывочного раствора.Склянки Бэбкока сбалансируют и ценОтрифугируют при 500-1000 об/мин в течение 10-20 мин, Протопласты образуюткомпактную полоску в горлышке у поверхности раздела. Эту полоску извлекают пипеткой, приняв предосторожности, чтобы не прихватить излишек раствора. Протопласты разбавляют МБ 9, Вэтот момент протопласты промывают МБ 9или разбавляют для культивированиябез промывки.Протопласты суспендируют в МБ 9среде до 5 х 10 на мл и помещают вТколбы по 6 мл в колбу, Колбу инкубируют на уровне поверхности прислабом рассеянном свете или в темноте при 26-28 С. На третий день послеудаления ферментов из тканей листа вкаждую колбу добавляют МБО (среду,которая не содержала маннитола), используя количество, равное половйнеИсходного объема. То же к:оличествосреды МБО добавляют снова на 4 день,Это снижает концентрацию маннитоладо около 0,33 М после первого разбав,пения и до около 0,25 М после второго разбавления,П р и м е р 10, На пятый деньпосле выделения протопласта, пяти-семидневные табачные суспензионныекультуры табака (ТХЭ клетки) разбавляют при необходимости МБ 2 С средойдо тачки, когда 1 мл легко распределяется по поверхности агарной средыв 100 х 15 мм чашках Петри, т.е. до10-15 ь суспензии (вес/объем). Агарную среду получают, смешивая 0,8 Еный агар со средой МЯ-ЕБ обрабатывая смесь в автоклаве и охлаждая дотех пор, пока она не отвердилась вчашках. Один мл ТХО суспензии распределяют на питательной среде (25 мл),8,5 см диск ватманской Фильтровальнойбумаги кладут на ТХД клетки и разгла 4живают, 7 см диска той же бумаги кладут в центр большего диска,55Отдельно аликвотные части культурыклеток А, Сцшейасепв клегок добавляют в склянки, которые содержат растительные клетки. Один набор аликвотных частей содержит клетки с рМОЮ 128Т коинтегративными плазмидами, содержащими химерические МОБ-БРТ 11-11 ОБ ге.гены, Другой набор аликвотных частейсодержит клетки с рМ 011 120: Т коинтегративными;плаэмидами, которые несодержат химерический 11 ОБ-АРТ 11-110 Бген.Бактерии добавляют в склянки приплотности 10 клеток/мл. 0,5 мл сме 8си клеток распределяют в тонком слоена поверхности 7 см диска Фильтровальной бумаги, Затем пластины герметиэируют паропленкой или в пластиковыхпакетах и инкубируют при прямом флуоресцентном освещении не более чем по5 пластин в стопке,Через 7 дней колонии стали различимы. Через 14 дней 7 см диски с прилипшими к ним колониями переносят нановую МБО агарозную среду (без питающих клеток), содержащую 500 мкг/млкарбенициллина, а также 50 мкг/мл канамицинсульфата. Через две неделинаблюдают интенсивно растущие зеленыеколонии на пластинах, которые содер -жат растительные клетки, совместнокультивированные с А. йщпеЕасхепзштаммаи, содержащими коинтегративную г 10 БРТ 11 плаэмиду рМ 011 128, Напластинах не наблюдают трансформиро "ванные колонии, которые содержат растительные клетки, совместно культивированные с А, шпейасепв штаммами9содержащими коинтегративную плаэмиду,рМ 011 120, Канамицинустойчивые транс-форманты сохраняют рост в культуральной среде, содержащей канамицин. Эксперименты Саузерна подтверждают, чтоэти клетки содержат химерический ИОБ 11 РТ 11 ген,Оба набора трансформированных клеток (и третий набор клеток, которыебыли трансформированы таким же способом химерическим геном, кодирующимфермент БРТ типа 1), исследуют наустойчивость к канамицину.П р и м е р 11, Трансформированные канамицинустойчивые колонии содержат как опухолевые, так и неопухолевые клетки, Отделяют неопухолевыетрансформированные клетки от опухолевых трансформированных клеток и осуществляют регенерацию дифференцированных растительных тканей из неопухолевых клеток,1Колонии выращивают на МБ 104 агароэной среде, содержащей 30 мкг/мл21 22 1582990 Формула изобретения СоставительРедактор В, Середа Техред Л.Олийнык Корректор О. Кравцова Заказ 2099 Тираж 494 ПодписноеРчИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 канамицинсульфата и 500 мкг/мп карбенициллина, до тех пор, пока они не достигают около 1 см в диаметре, Опухолевые колонии, которые имеют не 5 сколько более бледный оттенок зеленого и являются более рыхлыми нежели неопухолевые колонии, удаляют из МЯ 104 среды и помещают на МЯ 11 сре" ду, содержащую 30 мкг/мл канамицина и 500 мкг/мл карбенициллина. По мере роста колоний те из них, которые были бледно-зелеными и имели рыхлую структуру, удаляют и выбрасывают. 15МЯ 11 среда, содержит зеатин, фитогормон, который вызывает спонтанноеобразование ростков в неопухолевых ко-.лониях, Обнаруживают несколько ростков, развивающихся из канамицинустойчивых колоний, Эти ростки выращиваютдо нужного размера и срезают острымлезвием, а затем вводят в агароэнуюсреду без фитогормонов, например МЯО,где они могли развить корни. При же в . 25лании среду дополняют нафталинуксусной кислотой для того, чтобы вызватьобразование корней. Растения выращивают до нужного размера в агарозной. среде, а затем переносят в почву. При 30правильном уходе растения растут дозрелости и дают семена,Способ получения трансформированных клеток двудольных растений путем совместного культивирования раститель ной клетки и бактерий А 8 гоЬасгегцш ГцшеЕасепв, о, т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода нормальных трансформированных растительных клеток, конструируют плазмиду рМРБ 128 путем включения в вектор рМОИ 120 гена устойчивости к антибиотикам, вносят полученную плазмиду в штамм бактерий А 8 гоЬасгегцш ТцшеГасепв СЧ 3111-С 58 С 1/рТ 3. В 65 33 ф конъюгацией трех штаммов бактерий ЕвсЬегксМа со 1/рМОИ 128, ЕвсЬегдсЫа со 11 НВ 101 рКК 2013 и А 8 гоЪасГ.егхцш г.цшеЕасепв СЧ 3111, отбирают штамм бактерий А, цшеГасдепв с ксан" тегративной плаэмидой рМОИ 128:рТ). В 65 3 ггаф на селективной среде, содержащей 25 мкг/мп хлорамфеникола и по 100 мкг/мл спектиномицина и стрептомидина, ген устойчивости к антибиотикам вводят в растительные клетки в результате совместного культивирования протопластов с бактериями А. 1 цшеЕасепв, содержащими коинтегративную плазмиду, и отбирают трансформированные растительные клетки на селективной среде, содержащей соответствующий антибиотик,Несет маркерный ген, который кодиурет Фермент, придающий устойчивость к двум антибиотикам, спектиномицину (Брс) и стрептомицину (Б 1 г)Этот ген, названный Брс/Бйг ген, экс 5прессируется в Е. со 1 х и А. цшеГасепв, но не в растительных клетках,не несет генов, которые кодируют устойчивость к ампициллину или тетрациклину,Содержит последовательность, которая гомологична последовательности вучастке Т-ДНК октопинового типа Т 1плазмиды.А. 1 цшеХасепз. Эту последовательность называют "левый внутренний гомологический" (1.1 Н) участок,Этот участок гомологичности промотирует акт скрещивания, в результатекоторого рМОИ 1.20 или такая производная рМОБ 120, как рМОБ 128, образуеткоинтеграт с Тх плазмидой, если обеплазмиды существуют внутри одной итой же клетки А. 1 цшеЯасепз. По определению "коинтегративная плазмида."образуется при простом акте скрещивания. Она содержит все последовательности ДНК, которые ранее существова. -ли либо в Т плазмиде, либо в плазмиде, полученной из рМОИ 120,Содержит "правый крайний участок"Т-ДНК нопалинового типа т.е. последовательность, которая способна Функ ционировать, как один конец (для удобства обозначаемый, как правый край)Т-ДНК последовательности, которая перенесена из Т 1 плазмиды,и включена вхромосому растительной клетки в процессе трансформации клетки при помощиА. СцшеЕасепз.Несет ген(включая промотор), кото "0рый кодирует экспрессию Фермента, нопалинсинтазы (БОБ), Будучи введен врастительную клетку БОБ фермент ката"лизирует продуцирование нопалина, типа опина.45Часть коинтегративной Т плазмиды(модифицированньй участок Т-ДНК) включается в растительный геном, т.е. только часть полученной из рМОН 120 пла.змиды включается Ь растительный геном.,50Эта часть начинается с крайнего участка Т-ДНК и простирается в одном направлении только до участка гомологич-ности.Размер плазмиды рМОИ 120 составля 55ет около 8 тыс, оснований,Нопалинового типа Тх плазмиду,обозначенную как рТ 1 137 плазмиду,расщепляют Н 1 пй 111 эндонуклеазой дополучения различных фрагментов, включая фрагмент размером 3,4 тыс, оснований, который обозначен как Нпс 1111-23 фрагмент. Этот фрагмент содержит целиком ЮБ ген и правый крайнийучасток Т-ДНК, Включают Нп 111-23фрагмент в плазмиду рВВ 327, Полученную плазмиду обозначают РМОИ 38 ирасщепляют ее, В результате получаютфрагмент размером 2,3 тыс, оснований,который содержит правый крайний участок нопалинового типа и 5 участокБОБ гена (включая промоторный участок, 5-нетранслированный участок ичасть структурной последовательности).Этот фрагмент размером 2,3 тыс. оснований включают в плазмиду рВР, 327,которую заранее расщепляют Нпй 111и Ваш Н 1. Полученную плазмиду обозначают рМОИ 41.Плазмнда рМОИ 109 включает Брс/Б 1 гселектируемый маркерный ген и 3 участок ЮБ гена до рМОМ 120, Ее конструируют следующим образом,Ппазмиду рМОБ 38 расщепляют Кза 1,в результате чего получают тупые концы, как указано: 5 -С ТАС, САТ С.Выделяют фрагмент размером 1,1 тыс.оснований и расщепляют Ваш Н 1 до получения фрагментов размером 720 и400 пар оснований, каждый из которыхимеет один тупой Вза конец и липкийВаш Н 1 конец, Эти фрагменты добавляют к двуннтевой ДНК из фага М 13 шр 8,которую расщепляют Бша 1 (которая дает тупые концы) и Ваш Н 1. Полученнуюсмесь лигируют, трансформируют вклетки, Рекомбинантные фаги ДНК, которые содержат фрагмент размером720 пар, идентифицируют размером .вставки Ваш Н 1-Бша 1.Один из этих фагов обозначают какМ, Фрагмент размером 720 пар оснований содержит 3 -нетранслированныйучасток (включая сигнал поли-аденилирования) 1 ЮБ гена и 3 участок структурной последовательности БОБ гена,Фрагмент размером 720 пар основанийокружена в МЕсо К 1 и Рзс 1 сайтами расщепления, которые присутствуютв М 13 шр 8 ДНК. Бактериальный транспозон Тп 7, как известно содержит Брс/Б 1 г ген, упомянутый ранее, Тп 7 транспозон содержит также ген, который вызывает у клеток хозяина устойчивость к антибиотику триметоприму. Точное располо1582990 6жение и ориентация Брс/Б 1 г гена ина и ге- Т плазмидой, Участок гомологичностина устойчивости к триметоприму в Тп 7неизвестны. Транспозон Тп 7 выделяютвыбирают иэ Т плазмиды октопинового.А С Еиз штамма . СцшеЕасхепе, в которомтипа. В Т плазмиде он расположеныл включн в участо Н п,1 111 23 5 в лизи левог Т ДНК краинего участкаплаэмиды РТд Т 37,внутри Т"ДНК участка Т плазмиды.Ппаэмиду РС 7 3106 расщепляютЭтот участок гомологичности обозначаячНпй 111 и фрагменты клонируют вют как левыи внутренний участок гомоРВВ 327 плазмиды расщепленную Р йВ п 1 Ологичности" (ЫН) .111; Полученные плаэмиды включают в Участок гомологичности получаютЕ. со 1 клетки, отбирают клетки, ко- иэ любого типа плазмиды, способнойторые были устойчивы к ампициллину - трансформировать растительные клетки,(благодаря РВЕ 327 гену) и устойчивы КонстРуируют промежуточный вектор,к триметоприму (благодаря гену Тп 7), который может образовывать коинтегПлаэмиду, полученную из одной коло- Ративную пла миду с тем типом плазмиДнии, обозначают как РМОМ 31. В этой ды, из которой бып получен участокпла э миде содержится вставка 6 тыс оснований Нхпй 111. Вставка содержала Получают Е. со 1 х культуру с РВР,ген Брс/БСг - устойчивости,и ген ус- производной плаэмидой содержащей209тойчивости к триметоприму иэ Тп 7 и Вашфрагмент Т плазмиды октопино 13 участок гена КОБ (который попал из вого типа, Вашфрагмент размеромрТх Т 37 плазмиды), 7,5 тыс. оснований содержит левыйРазмер плаэмиды рМОМ 31 уменьшают кРайний участок и ЫН участок Т.дважды. Вначале уменьшение размераи аплазмиды, Вашфрагмент включают впроизводят за счет расщепления плаз- плазмиду РВЕ 327, которую расщепляютмиды Есо Р 1, удаляют фрагмент разме- Ваш Н 1ром 850 пар оснований и осуществляют Плазмиду РМОИ 90 расщепляют В 81 11заново сшивку крупного фрагмента, По- и фрагмент размером 2,6 тыс, основа-,лученную плаэмиду обозначают как ний, который содержит участок 1,1 Н, ноРМОН 53 вьщеляют иэ трансформирован 30 не др лый краиний Участокных клетоквыбранных по их устойчи выдл фрагмент размером 2,6 тыс,вости к ампициллину и стрептомицину,оснований обрабатывают полимеразойУстойчивость к триметсприму не опре- Кленова для превращения липких концовд .яют,. Размер плазмиды РМОИ 53 умень тУпье концы и полУченный фРагментшают путем расщепления плаз,ды С 1 а 1 35 расщепляют Н 1 па 1 П до получения фраи удаления фрагмента размером 2 тыс. мента размером 1,6 тыс. оснований (цепар оснований и сшивки заново крупно- левон Фрагмент) и Фрагмента размеромго Фрагмента, Полученную плазмиду 1 тыс. оснований, Оба Фрагмента смеразмером 5,2. тыс, оснований обозна- шивают с РВР. 322 плазмидой, которуючают как РМОМ 54. Эта плазмида содер зараее Расщепляют Рчп 11 и Нпй 111,жит Брс/Яг ген,Полученную смесь смешивают и включаютв клетки Е, со 1 д, Клетки отбирают наПлазмиду рМОК 54 расщепляют Есо К 1 Устойчивость к ампициллину и проводяти Ре 1 и вьделяют фрагмент размером поиск Бша 1 сайта, который находится4,8 тыс. оснований, содержащих во фрагменте размером 1,6 тыс, осноБрс/Бг ген. МДНК расщепляют Есо К 1 ваний и которого нет во фрагменте рази Ре 1 и выделяют фрагмент размером мером 1 тыс. оснований. Колонию.с це 740 пар оснований, содержащий БОБ 3 - левой плаэмидой идентифицируют и плазнетранслированный участок. Эти фраг- миду иэ этой колонии обозначаютменты сшивают вместе до образования 5 О РМОИ 113,РМОЫ 64, Плазмиду с нужной ориентаци- Плазмиду РМОБ 41 расщепляют Рчп 1ей идентифицируют путем расщепления и Ваш 1 и выделяют фрагмент 1,5 тысЕсо Р 1 и Ваш Н 1, Их обозначают как оснований, содержащий правый крайнийРМОМ 109, участок нопалинового типа и 5 участокПлазмида рМОИ 113 содержит участок 55 БОБ гена. Плазмиду РМОМ 109 расщепляютгомологичности с РМОИ 120, который Ваш Н 1 и Есо Р 1 и выделяют фрагментпозволяет РМОГ 120 образовывать коин,4 тыс. оснований, содержащий ген "тегритивную плазмиду, если она при- Брс/е и 3 участок гена ГОБ. Плаэмисутствует в А, цшеГасепе вместе с ду РМОИ 113 расщепляют Рчп 1 и Есо Р,1и выделяют фрагмент размером 3,1 тыс.оснований, содержащий участок ЫН.Эти три фрагмента смешивают вместеи сшивают до образования рМОЕ 120.Культуру бактерий Е, со 1 т., содержащуюрМОЕ 120, депонируют н Американскойколлекции типовых культур под О 39263.Способ применения рМОЕ 120.Плазмида рМОИ 120 имеет три уни -10кальных сайта расщепления (Есо Г 1,С 1 а 1 и Нпй 111), которые пригодныдля включения любого необходимого гена. Эти сайты расщепления расположеныв участке рМОЕ 120, который долженбыть включен в растительньй геном,так что включенный ген также будетвключен в растительный геном.Конструируют разлиные химерныегены, которые способны к экспрессиибактериальных полипептидон и полипеп,тидон млекопитающихся н растительныеклетки.Конструируют химерный ген, которыйвключает следующие ДНК последовательности.Промоторньй участок и 5 нетранслированньп участок, полученный из генанопалинсинтазы (ЕОБ), Структурную последовательность, полученную из генанеомицинфосфотрансферазы П (МРТ 11)3 нетранслированньп участок, полученньп из гена ЕОБ.Этот химерньй ЕОБ-ЮТ 11-БОБ генвыделяют на ДНК фрагменте, содержащемЕсо Г 1 концы. Включают его в Есо К 135сайт плазмиды рМОЕ 120 и полученныеплазмиды (с вставками химерическогогена противоположной ориентацией)обозначают как рМОМ 128 и рМОЕ 129.40Плазмида рМОЕ 129 имеет дне копии химерного гена, Каждук плазмиду исполь-зуют для трансформации растительныхклеток. Культуру Е. со 1, содержашуюрМОЮ 128, депонируют н Американскую45коллекцию типовых культур, Этой культуре бьпт присвоен регистрационныйномер 39264,Плазмиду рМОЕ 128 (или любую дру-угую плазмиду, полученную путем вклю-.чения целевого гена в рМОЕ 120) вводят в микроорганизм, который содержитТт. плазмиду октопинового типа (илидругую подходящую плазмиду). Подхоцящие микроорганизмы включают А, цше 55.хаст.епз и А, хМхо 8 епез которые содержат Т. или 2 плазииды.Плазмиду вставляют в микроорганизмтрансформации или конъюгацией с клетками, которые содержат рМОИ 128 илидругие плазмиды, Плазмида, такая какрМОЕ 128 имеет участок, который гомологичен последовательности н Тх плазмиде, Этот участок Ь 1 Н гомологичностипозволяет осуществлять единичный актскрещивания, в результате которогорМОЕ 128 и Т плазмида октопиновоготипа объединяются с образованием коинтегративной плазмиды, Обычно зто происходит с клеткой А. цшеЕасхепз после того, как рМОЕ 128 бывает включенан клетку. В другом варианте коинтегративную плазмиду создают в клетке другого типа или п х 1 хо, включают нА, цшехасхепз или клетку другого типа, которая способна перенести коинтегративную плазмиду в растительныеклетки,Плазмиду, такую как рМОЕ 128, объединяют с Тх плазмидой с получениемкоинтегративной плазмиды б, КультуруА. цшеГасхепз СЧ 3111, содержащуюкоинтегратинную плазмиду, полученнуюиз рМОМ 128 и Тд плазмиды дикого типа рТт 8653,депонируют в Американскойколлекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39266,Если коинтегративную Тх плазмидувключают и растительную клетку, то нрастительный геном может войти любойиз двух участков ДНК, Т-ДНК,участок14 или Т-ДЕК 16,Разрабатывают альтернативньй способ, н котором избегают необходимостиотделять опухоленые клетки от неопухолевых клеток. Выделяют некоторыемутантные штаммы А, цшеГасхепз, которые неспособны вызывать заболеваниеверхушечной галловой опухоли. Такиештаммы обычно называют "безоружные"Т. плазмиды. Т или Г,х плазмиды могутбыть "обезоружены" н результате одного или более типов мутаций.После того, как рМИ 128 включаютв А. цшехасхепз клетки, нужный актскрещивания будет происходить в опре -деленных участках клетки. Клетки, которые соцержат коинтегративные плазмиды (незанисимо от того, вирулентныеили обезоруженные) отбирают от другихклеток, н которых скрещивание не происходит, следующим образом. ПлазмидарМОЕ 120 и ее производные содержат.маркерньй ген (Брс/зхх), которьй экспрессируется н А хцшехасхепз, Однакоэти плазмиды не реплицируются в А, хц 4шехасепз. Поэтому зрс/зсх маркерныйген не наследуется стабильно в А. 1 цшеГасепя, если только включеннаяплазмида не объединится с другой плазмидой, которая может реплицироватьсяв А. гцшейасепв, Наиболее вероятной5такой комбинацией за счет участкагомологичности является коинтеграцияс Тх плазмидой. Клетки А. гцшейасепв, которые содержат такую коинтегративную плазмиду, идентифицируют иотбирают при выращивании клеток насреде, содержащей либо Брс, либо вйг,либо оба вместе,Возможен вариант, когда коинтегративная Та плазмида претерпевает по;.следовательный акт скрещивания, в котором два участка Ь 1 Н будут рекомбинироваться, Такой акт нежелателен,так как он может привести к делениюДНК между ЫН участками, содержащей20химерический ген. Однако это повидимому не приводит к серьезным затруднениям по двум причинам, Во-первых,такой акт повидимому происходит с относительно невысокой вероятностью,примерно около 10 , Во в втор, плазмиду рМОГ 120 и ее производные конструируют таким образом, что селектируемый маркерный ген (ярс/вГг) расположен в области ДНК, которая будетисключена при акте скрещивания. Поэтому селективные условия, которыеиспользуются для идентификации икультивирования клеток А 8 гоЬасгегдцш35содержащих коинтегративные плазмиды,должны быть достаточно жесткими длятого, чтобы убить поколения клеток,которые претерпевают последующий актскрещивания, который исключает химерический ген из Тх плазмиды.40Только один из ЫН участков в коинтегративной Т плазмиде будет включен в растительный геном.Эта ватная особенность определяет" 45 ся конструкцией рМОГ 120 и именно она отличает эту коинтегративную плазмиду от нежелательных коинтегративных плазмид, которые получали ранее, Учао 1 Р, ктарый расположен вне 5 Т-ДНК крайних участков, не будет включен в растительный геном. Это . приводит,по крайней мере,к двум важным преимуществам. Во-первых, наличие двух участков 1 Н, включенных в расти 55 тельный геном, может привести к актам скрещивания, которые приведут к потере включенных генов в трансформиро ванные клетки и их потомство. Во-вторых, наличие двух участков ДНК гомо-.глогичности может значительно затруднить попытки анализа,ННК вставок врастительный геном.Клетки А. СцшеГас 1 епв, которые содержат коинтегративные Т плазмиды схимерическими генами, идентифицируюти вьделяют. Коинтегративные плазмидывключают в растительные клетки, которые подлежат трансформированию, под-вергают контактироваьию с ферментами,которые удаляют клеточные стенки. Этопревращает растительные клетки в протопласты, которые представляют собойжизнеспособные клетки, окруженныемембранами. Эти ферменты удаляют ипротопласты начинают регенерироватьматериал клеточных стенок. В подходящий момент времени клетки А. ГцшеГасепв (которые содержат коинтегративные Т плазмиды с химерическимигенами) смешивают с растительными протопластами. Эти клетки совместнокультивируют в течение промежуткавремени, который позволяет А; гцшеГасепв инфицировать растительные клетки. После соответствующего периодасовместного культивирования клеткиА. гцшейасдепя убивают и продолжается рост растительных клеток,Трансформированные растительныеклетки отбирают различными способами,в зависимости от типа гена (генов),которые быпи включены в растительныйгеном,1П р и м е р 1. Конструирование плазмиды рГОБ 41Используют культуру Е, со 1 д, содержащую рВН 325 плазмиду с Нжй 111- 23 Фрагментом рТ 1 Т 37, включенным по Нпй 111 сайту. 10 мкг плазмиды из этого клона расщепляют О ед, Нпй 111 эндонуклеаэы в течение 1 ч при 37 С, Фрагмент 3,4 тыс. оснований Най 111- 23 вьделяют адсорбцией на стеклянных шариках после отделения от других Нкпс 111 Фрагментов электрофорезом на 0,87-ном агарозном геле, Вьделенный 3,4 тыс, оснований Ндпй 111 Фрагмент (1,0 мкг) смешивают с 1,0 мкг плазмиды рВН 327 ДНК, которую заранее расщепляют Нхпй П 1 эндонуклеазой (2 ед., 1 ч, 37 С) и щелочной фосфатазой теленка (0,2 ед., 1 ч, 37 С), депротеинизируют фенолом, осаждают этанолом и повторно суспендируют в 10 мкл ТЕ (10 мМ трис НС 1, рН 8 г, 1 мМ ЭДТА). Сдну единицу Т 4 ДНК лига0 12предварительно расщепляют Вша 1 иВаш Н 1 (каждой по 2 ед. 1 ч, 37 С и0,2 ед. телячей щелочной фосфатазы) .После сшивки со 100 ед. Т 4 ДНК лигазыи трансформации Е. со 1 ь Ю М 101 клеток, трансформированные клетки смешивают с мягким агаром и высевают вчашки в условиях, которые позволяютидентифицировать рекомбинантный фаг,Отобрали двенадцать клеток, продуцирующих рекомбинантные фагин получаютмини-препарат ВР плазмид, КР ДНК расщепляют Ваш Н 1 и Бша 1 для доказательства наличия Рва 1 - Ваш Н 1 фрагмента размером 720 пар оснований. Однуиз рекомбинантных ЕР ДНК, несущую .нужный Фрагмент, обозначают М 13 мр 8М.П р и м е р 3. Двадцать мкг пла"змиды рСЧ 3106 расщепляют Нпй 111эндонуклеазой (20 ед., 2 ч, 37 фС) исмешивают с 2 мкг рВН 327 расщепленной Ньпй 111. После лигирования (Т,ДНК лигаза, 2 ед.) и трансформацииЕ. со 1 д клеток, как описано ранееполучают одну колонию, устойчивую ктриметоприму (100 мкг/мл) и ампициллину, Обработка плазмидной ДНК изэтой клетки демонстрирует наличиеНпй 111 Фрагмента размером 6 тыс.оснований, Эту плазмиду обозначаютрМОЕ 31,Плазмиду рМО 1 31 расщепляют Есо 21оэндонуклеазой (1 ед., 1 ч, 37 С), Эндонуклеазу инактивируют нагреванием(Т 4 ДНК лигаза, 1 ед.) и используютдля трансформации клеток Е, со 1 д сотбором устойчивых к ампициллину истрептомицину (25 мкг/мл) колоний.Плазмидный мини-препарат ДНК из шести клонов расщепляют Есо К 1 для определения потери фрагмента 850 пароснований. Одну плазмиду, у которойне было Есо 21 фрагмента 850 пар оснований обозначают рМОИ 53. Эту плазмиду вводят в Е. со 1 СМ 42 дам-клетки (Ва 1 еса 1, 1979) описанной трансФормацией.Плазмиду рМОМ 53 (0,5 мкг) из ми"ни-препарата, полученного из клеток,расщепляют С 1 а 1 и рециркулируют вразбавленном растворе. После трансформации Е. со 1 х СМ 42 клеток и отбора устойчивых к ампициллину и спектиномицину (50 мкг/мл) клонов, получают 11 158299зы добавляют к фрагментированной смеси. Одну единицу определяют, как концентрацию, достаточную для полученияболее чем 907, циркуляризации одногомикрограмма Н 1 пй 111 линеаризованной5рВК 327 плазмиды за 5 мин при 22 ССмешанные фрагменты помещают в полныйобъем 15 мкл 25 мМ трис НС 1 рН 8,10 мМ МЕС 1 , 1 мМ дитиотреитола,200 мкМ спер мидина НС 1 и 0,75 мМ АТР(лигазный буфер).Полученную смесь инкубируют при22 С в течение 3 ч, а затем смешиваютос клетка Е. со 11 С 600 гес А 56, оторые получают трансформацией путемобработки СаС 1,. Для отбора трансформированные клетки распределяют на ЕВпластины с твердой средой, содержашиеампициллин при 200 мкг/мл, После инкубирования при 37 С в течение 16 ч получают несколько сотен клоновПлазмидные мини-препараты выделяют из 24клонов и полученные аликвоты плазмидной ДНК (0,1 мкг) расщепляют Нхпй 1 П 25для того, чтобы продемонстрироватьналичие 3,4 тыс. оснований Н.пй 111Фрагмента, Однако из плазмид демонстрируют ожидаемую структуру и обозначают рМОЫ 38ДНК получают с помощью тритон Х лизиса и градиента СэС 1, 50 мкгрМОИ 38 ДНК расщепляют Нпй 111 и Ваш Н 1(1 мкг) смешивают с 1 мкг фрагментаНхпй 1 П-Ваш Н 1 размером 2,9 тыс. оснований рВВ 327 вектора. После лигирования (Т 4 ДНК лигаэа, 2 ед,) и трансформации Е. со 1 клеток получают4050 ампицилинустойчивых колоний. ДНКиэ двенадцати плазмидных мини-препаратов расщепляют Нпй 111 и Ваш Н 1 дляустановления наличия фрагмента размером 2,3 тыс, оснований, Одну плаз 45миЛУ нужной структурЫ выбирают и обозначают рМОИ 41.П р и м е р 2. Тридцать мкг плазмиды рМОИ 38 расщепляют Рза 1 (30 ед. 502 ч, 37 С) и 1100 пар оснований Каа 1.)фрагмент выделяют после разделенияэлектрофорезом на агарозном геле, используя метод стеклянных шариков,Нва 1 - Еаа 1 фрагмент 1100 пар оснований (1 мкг) расщепляют 2 ед. Ваш Н 1эндонуклеазы и Ваш Н 1 инактивируютнагреванием. Эту ДНК смешивают с0,2 мкг Фага М 13 мр 8 КР ДНК которыйпятьдесят колоний. Расщепление плазмидных мини-препаратов ДНК из шестиколоний показывает, что во всех отсутствует фрагмент размером 2 тыс.основании С 1 а 1. Одну из этих плазмидЪ5обозначают рМОН 54. Получают плазмидную ДНК,Плазмиду рМОМ 54 ДНК (20 мкг) расщепляют Есо 21 и Рз 1 эндонуклеазами (20 ед. каждого, 2 ч, 37 С) и фраго0мент размером 4,8 тыс, оснований очищают на агарозном геле, используямембраны ИА,Очищенный фрагмент размером4,8 тыс. оснований (0,5 мкг) смешивают 0,3 мкг фрагмента размером740 пар оснований Есо Н 1 - Рзй 1, полученного из М 13 мр 8 МЕР ДНК, которую очищают, используя мембрануМА. После лигирования (Т 4 ДНК ли 20газа, 2 ед.), трансформации Е. со 11. СМ 42 дам-клеток, и отбора клеток,устойчивых к спектиномицину, получают 20 колоний, Плазмидный мини-препарат ДНК, полученный из 12 клонов,расщепляют Рз 1 1 и Есо В 1 для демонстрации наличия фрагмента 740 пар оснований, Одну плазмиду, несущую этотфрагментобозначают рМОН 64.ДНК (0,5 мкг) рМОБ 64 расщепляютС 1 а 1 (1 ед 1 ч, 37 С), затем С 1 а 1инактивируют нагреванием и фрагментзаново присоединяют Т 4 ДНК лигазой(1 ед.) После трансформации и отбораклеток, устойчивых к спектиномицину,получают мини-препарат из 12 колоний,ДНК расщепляют Ваш Р 1 и Есо К 1 дляопределения ориентации фрагмента2 тыс. оснований С 1 а 1. Половина клонов. содержит С 1 а 1 фрагмент в обрат 40ной ориентации нежели в рМОИ 64. Однуиз этих плазмид обозначают рМОМ 109,П р и м е р 4. Принимают плазмиду рай 31 С - 8,29 С. Плазмида несетрТ А 6 7,5 тыс. оснований Ваш 8 фраг 45мент, Ваш,фрагмент выделяют из50 мкг Ваш Н 1 - расщепленной плаэми"ды р 1 Я 31 С - 8 290, используя НА мембрану, Очищенный ВашФрагментразмером 7,5 тыс. оснований (1,0 мкг)смешивают с 0,5 мкг рВК 327 векторнойДНК, которую предварительно расщепляют эндонуклеазой Ваш Н 1 (2 ед) таки 0,2 ед, щелочной Фосфатазы теленкав течение 1 ч при 37 С, полученную55смесь депротеинизируют и повторно суспендируют. Смешанные фрагменты обрабатывают Т 4 лигазой (2 ед.), используют для трансформации Е, со 1 С 600ГЕСА клеток, отбирают колонии, устойчивые к ампициллину, Мини-препаратдля получения плазмидной ДНК вьщеляютиз двенадцати этих клонов, ДНК расщепляют с Ваш Н 1 для 1 ого, чтобы продемонстрировать наличие рВК 327 вектора и Вашфрагментов размером7,5 тыс, оснований, Одну из плазмид,в которой имелись оба эти фрагмента.,обозначают рМОМ 90,25 мкг рМОИ 90 ДНК расщепляютВя 1 11 (25 ед., 2 ч, 37 С) и Вя 1 11фрагмент размером 2,6 тыс. основанийочищают, используя ИАмембрану.Для создания тупых концов фрагмент(буфер Кленова). 4 деоксинуклеозидтрифосфатазы (ЙАТР, ЙТТР, ИСТР и ЙСТР)добавляют до конечной концентрации1 мМ и добавляют одну единицу большого фрагмента Кленова ДНК полимеразы1 Е. со 1. После инкубирования в течение 20 мин при 22 С, полимеразуКленова инактивируют нагреванием идобавляют 10 ед. Нпй 111Расщепление Нпс 1 111 проводят в течение 1 чопри 37 С и затем фермент инактивируютнагреванием, Добавляют тупые фрагменты Нпй 111 - В 81 11 (1 мкг) к 0,25 мкгНпй 111 - Рчц 11 фрагменту размером2,2 тыс, оснований рВР, 322, которыйполучают путем расщепления Нпй 1 Пи Рщ 11, и затем обработки щелочнойфосфатазой теленка. После лигированияс использованием 100 ед, Т 4 ДНК лигазы, трансформации Есо 1 д 2 Е 392 клеток .и отбора устойчивых к ампициллину колоний, получают девятнадцатьколоний, Плазмидные мини-препаратыполучают из двенадцати колоний и расщепляют Н.пй 111 для определения размера рекомбинантной плазмиды и Яша 1для определения правильности включения фрагмента. Одну плазмиду с правильной структурой обозначают рМОИ 113. П р и м е р 5Двадцать мкг плаэмиды рМОИ 109 расщепляют Есо 21 и Ваш Н 1 (по 20 ед, каждой, 2 ч, 37 С) и Ваш Р 1 - Есо Р 1 фрагмент размером 3,4. тыс, оснований очищают, используя БАмембрану, 20 мкг плазмиды рМО 11 41 расщепляют Ваш Н 1 и Рчп 1 (20 каждой, 2 ч, 37 ОС) и Ваш Н 1 - Рчи 1 фрагмент размером 1,5 тыс, ос 1582990нований очищают, используя ИАмем-брану,20 мкг рМОИ 113 ДНК расщепляютРц 1 и Есо Р 1 (по 2 ед. каждой, 2 ч,37 С) и Ркц 1 - Есо Н 1 Фрагмент разо 5мером 3, 1 тыс, оснований очищают,используя ИАмембрану; Для сборкиплазмиды рМОИ 120 Есо 21 - Рчц 1фрагмент размером 3,1 тыс. основанийрМОИ 113 (1,5 мкг) смешивают с1,5 мкг Фрагмента Есо 21 - Ваш Н 1размером 3,4 тыс. оснований изрМОИ 109. После обработки Т 4 лигазойРЗ ед.) в течение 16 ч при 10 С лигазу инактивируют нагреванием (11 мин70 С) и добавляют 5 ед, Ваш Н 1, Расщепление продолжают в течение 30 минопри 37 С и в это время Ваш Н 1 эндонуклеазу инактивируют нагреванием каки ранее. Затем 0,75 мкг Рчц 1 -ВашН 1фрагмента размером 1,5 тыс, основанийиз рМОИ 4 1 добавляют вместе с Т 4 ДНКлигазой Р 2 ед.) и свежим АТР до конечной концентрации 0,7.5 мМ. Окончательное взаимодействие с лигазойпроводят в течение 4 ч при 22 С исмесь используют для трансформацииЕсо 1 х ЕЕ 392 клеток споследующимотбором клеток, устойчивых к спектиномицину, как описано ранее, Плазмидные мини-препараты из двенадцати изнескольких тысяч колоний скринируютдля получения плазмид размером приблизительно 8 тыс, оснований, содердащих одиночные сайты Ваш Н 1 иЕсо Н 1. Одну плазмиду, которая имеланужную структуру, обозначают рМОИ 120,рМОИ 120 ДНК получают аналогично примеру 1,Культуру Е. со 1., содержащуюрМОИ 120, депонируют в Американскойколлекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39263.П р и м е р 6. Плазмида рМОИ 75"содержит химерический ИОБ-ИРТ 11-ИОБ45ген. Эту плазмиду и рМОИ 128 расщепляют Есо К 1 и очищают фрагмент размером 1,5 тыс. оснований, содержащийИОБ-ИРТ 11-ИОБ-ген.5 ОПлазмиду рМОИ 120 расщепляют Есо Р 1и обрабатывают щелочной фосфатазойтеленка. После фенольной депротеинизации и. осаждения этанолом Есо Р 1,отщепленную рМОИ 120, линейную ДНК55смешивают с 0,5 мкг размером 1,5 тыс,оснований Есо Н 1 химерическим геннымфрагментом рМОИ 75 или 76, Получе:нную смесь обрабатывают 2 ед, Т 4 ДНК лигазы в течение 1 ч при 22 С, Послетрансформации Е, со 1 клеток и отбора колоний, устойчивых к спектиномицину Р 50 мкг/мл), выявляют несколькотысяч колоний. Несть из них отбирают,выращивают и готовят плазмидные минипрепараты. Плазмидные ДНК расщепляютЕсо Н 1 для проверки на включение химерического гена размером 1,5 тыс.оснований и Ваш Н 1 для определенияориентации включения. Ваш Н 1 расщепление показало, что в плазмидерМОИ 128 химерический ген транскрибируется. в том же самом направлении,что и интактный нопалинсинтазный генрМОИ 120. Культуру Е. со 1, содержа":щую рМОИ 128, депонируют в Американской коллекции типовых культур и присваивают регистрационный номер 39264,Ориентация вставки в рМОИ 129 противоположна ориентации в рМОИ 128, появление дополнительного фрагмента Ваш Н 1размером 1,5 тыс. оснований Ваш Н 1при расщеплении плазмиды рМОИ 129,свидетельствует о том, что плазмидарМОИ 129 несет тандем дупликацией хи,мерического ИОБ-ИРТ 11-ИОБ гена.П р и м е р 7. Плазмиду рМОИ 128переносят в хлор амфениколустойчивыйАдгоЬасгеггцш СцшеГасепя штаммС 7 3111-С 58 С 1, несущий Тх плазмидуРТ 1 В 65 3 гга., используя методикускрещивания на пластине трех родителей, следующим образом. 0,2 мл культуры Е. со 1, несущей рМОИ 128,. смешивают с 0,2 мл культуры Е, со 1 хштамма НВ 101, несущего рВК 2013 плазмиду и 0,2 мл СЧ 311 клеток, Полученную смесь клеток культивируют в бульоне Луриа Р 1 В), помещенном на т В пластину, н инкубируют в течение 16-24 чпри 30 С, чтобы дать возможность осуществиться переносу плазмиды и образованию коинтегративных плазмид. Клетки повторно суспендируют в 3 мл 10 мММАМБОи затем 0,2 мл аликвотной частираспределяют на 1,В пластине, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и по100 мкг/мл спектиномицин и стрептомнцина, После инкубирования в течение48 ч при 30 С получают приблизительно10 колоний. Выбирают одну колонию ивыращивают при 39 С в 1,В среде, содержащей хлорамфеникол, спектиномицин и стрептомицин в указанных вышеконцентрациях,Готовят отдельный тип коинтегративной пла,змиды для использования вЗаявители использовалрастворы в расчете на 1Смесь ферментовЦеллюлизинМакерозимАмпициллинКГ 10 зСас 1,МАМБО 7 Н ОК 1СцЯО 5 Н ОМаннитолМБ 9 МЯ солиСахарозаВитамины В 5МаннитолФитогормоныБензиладенин (ВА)2,4-ДМЯ - ЕБ МЯ солиСахарозаВитамины В 5МаннитолКарбенициллинФитогормоныИндолуксуснаякислотаМЯО МЯ солиСахарозаВитамины В 5Питательная среда плаМБ солиСахарозаВитамины В 5МаннитолФитогормоны и следующиел. 15 5 г0,7 г0,427,2 мг1011,48 г246 мг0,16 мг0,025 Ъг110 г4,330,0 г1 мл90,0 г 20 25 30 0,5 мг1 мг4,3 г30 г.1 мп30 г10 мг 35 О, 1 мг4,3 г30,0 г1 млстин4,3 г30,0 г1 мл30,0 г 40 45 0,5 мг4,3 г30 г1 мп ВАМБ 2 С МБ солиСахарозаВитамины В 5ФитогормоныХлорфеноксиуксуснаякислотаМЯ 104 МБ солиСахарозаВитамины В 5 50 55 2 мг4,3 г30,0 г1 мп контрольном эксперименте путем включения рМОЫ 120 в клетки А, йцшейасепз и отбора клеток с коинтегративными плазмидами, исгользуя спектиномицин и стрептомицин. Аналогично рМОГ 1 120 эти плазмиды не содержат химерический Г 1 ОЯ-Г 1 РТ-Г 1 ОБ ген.П р и м е р 8, Растворы, которые используют при культивировании растительных клеток, Фитогормоны ВАГАМААМЯ 11 Г 1 Я солиСахарозаВитамины В 5ФитогормоныЗеатин 1 мгИсточники витамина В 5Миоинозитол 100 гТиамин НС 1 1 О гНи ко тинов аякислота 1 г, Пиродоксин НС 1 1 гПромывочный составМЯ соли 0,43 гСахароза 171,2 гРЧР - 40 40,0 гМЯ соли поступают в виде предварительной смеси в виде сухого порошка,П р и м е р 9, Растения петуньиМитчелла выращивают в камерах ростас двумя или тремя группами флуоресцентных ламп и двумя группами лампнакаливания (около 5000 лк). Температуру поддерживают постоянной при21 С и освещают растения в течение12 ч в день. Растения выращивают всмеси 50/50. вермикулита и РМ о смеси,Растения поливают раз в день питательным раствором Хогланда, Тканиберут с темно-зеленых растений с компактным кустистым ростом. Листья стерилизуют в растворе 10%-ной коммерческой хлорной извести и небольшогоколичества детергента Тюееп 20 в течение 20 мин с периодическим помешиванием, Листья смачивают, два или трираза в дистиллированной воде. Из листьев вырезают тонкие полоски (около1 мм) перпендикулярно основной жилке.Полоски помещают в смесь ферментов,взятых в отношении около 1 г тканина 10 мл ферментов. Чашки герметизируют парапленкой и инкубируют в темноте или в слабом рассеянном светепри этом непрерывно осторожно перевмешивают (около 40 об/мин) на ротор-ном шейкере. Инкубирование с ферментами обычно проводят в течение ночи,т.е, около 16-20 ч,0,1 мг1 мг4,3 г30,0 г1 мл Расщейленную смесь сеют через сита 68, 74 и 88 меш для удаления крупных осколков и лиственного материала, Фильтрат центрифугируют при 70 - 100в течение 5 мин до образования конгломератов протопластов, Надосадоч