Способ получения полипептидов

Ь" 1Г ( ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет15992/70 18706/70 (43) Опубликовано 2 Государственный кометеСовета Министров СССРпо делам изоорвтеннйи открытий 53) УДК 547,964. 4(72) Авторы изобретени Иностранцыан Гуттманн, Янос Плесс и Хейнц Боссерт (Швейцария) ностранная фирм"Сандос АГ" (Швейцария) Заявитель ПЕПТИДОВ идной химии налогов уп рм гормонов Иэвест иэ-лейли-Хкальцитонина: ческого гормонаН-Бис-сер-асн-л -гли-лиз-лей-се ос е-ц с-в лей-гис ей-сер-тр -глн-глу -арг-тре 4 ф эакл ал-лей- -лиз-лей- ре-глийся в том ют обшеста ок валина, а Устаток алании-глн-тре-т -сер-гли-тр н ющи о 0 чтоиэ занный го рмон синтеэи мии пептидов тными в риемам о- тб ь ро и(45) Дата опубликован(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 Изобретение относится к области полуения новых физиологически активных пеп в, являющихся аналогами природных пособ синтеза гипокальцеми например аэидной конденсацией фрагментов: (1-9) + (10-16) +(17-23) + (2432). В ходе синтеза для зашитый-амигруппы используют карбобензокси (Кбз)и трет. - бутоксикарбонильную (БОК)группы, БОК - группу для-аминогрупплизина, нитрогруппу для гуанидиновогоазота аргинина, Кбз-группу для гидрокснцй группы тирозина и бензильную (Бз)группу для тиольной группы цистеина. Пчие функции не защищают.В соответствии с предложенным изобретением описывается основанный на пр менении известных методов пепт способ получения двух новых а мянутог кал итонина с общей/Н-Ц с-сер-асн-лей-сер-трегли-лиз-лей-сер-глн-асп-лей-г глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-т ,-гли-У-про- МНе,где Х - остаталанина или Х -о остаток валинаили их кислотно-аддитивных солей или комплексов с тяжелыми металлами. Оба пептида получают по одинаковым схе,мам, предусматривающим создание необходимой пептидной цепи конденсацией .соответствующих фрагментов, подходящим образом защищенных пептидных последовательностей, полученных ступенчатым синтезом. Для защитыс(-аминогруппы приме,няют Кбз- и БОК - группы, для с- ами,ногрупп лизинов - БОК - группу, Кбз - группу для гуанидинового остатка аргинина я трет. - бутиловый эфир (Обут) для -карбоксильной группы аспарагиновой кислоты. Прочие функциональные группы не защища4 93061 Составитель В, НаэинаТехред М. Левицкая Корректор С;юлдижар Редактор Т. ЗагребельнаяФ Тираж 576 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Заказ 72 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 мостик и переводят карбоксильную группу конечного пролильного остатка в амидцую группу, а затем, если необходимо,полученные пептиды переводят известными приемами в их кислотно-аддятивные солис органическими или,Неорганическими кислотами или в комплексы с тяжелимп мс -таллами.Приоритет по признакам: 20 10,70 ирпХ - остаток валина, У - остаток алпнцпп;17.12,70 при Х - остаток аланпца,У - остаток валина.бзл БОК трт ОТБ ОНФ ОХФ Оме Оэт 502 сер всн этокси митро-глицил всп лей тре ввл врг глн гис про 3ют. Конденсацию фрагментов проводят с помощью дициклогексилкврбодиимида в присущ:твин Я- оксисукцинимида, начиная с М- конца в той же последовательности, что и для упомянутого кальцитонина, причем фрагменты (10-16), (17-23) и (24- 32) получают вэидной конденсацией (10- .12) + (13-16), (17-20) + (21-23) и ;(24-28) + (29-32) соответственно. Возможно использование альтернативного спо-собв получения фрагмента (17-32) иэ сле- дующих "блоков": (17-20) + (21-23) +24)Ф К 25-28) + (29-32) с использованием тех же методов конденсации. После создания необходимой пептидной последовательности защитные группы удаляют трифторуксусной кислотой.Согласно настоящему изобретению возможно также применение других общеизвестных защитных групп и методов конденсации для получения целевых соединений.Для получения кислотно-вддитивных солей предлагаемых соединений могут быть использованы органические кислоты: уксусная, молочная, янтарная, бензойная, салициловвя, метансульфокислотв, толуолсульфокислота, твннин, кврбоксиметилцеллюлоза в также неорганические кислоты: соляная, серная, фосфорная, Под комплексом с тяжелыми металлами подразумеваются производные с кальцием, магнием, алюминием, кобальтом, в особенности с цинком.В примерах температура указана в градусах Цельсия; величина (с) для оптического вращения составляет 1; сокращения применяют следующие;кврбобензилокси7-трет.-6 утил лиз фвл цис влаОсут,бут,По 3. Ь -алв-гли-вал-про- лщ,Растворяют 92 г-гли-вал-про- ун в 2000 мл метанола, прибавляют 27 мл уксусной кислоты и гидрируют в присутсто вии паллвдия на угле при 20 и нормальном давлении. фильтруют, выпаривают досуха в вакууме, остаток растворяют в 1000 мл диметилформвмидв, прибавляют 100 г-ала-ОХф, встряхивают и в течелучение исходного материала,Частичная последовательность А 1;Н-вал-гли-ала-про- ИН3.Суспендируют 27,5 гЯ -вал-глн-апа-про-ЯНр 550 мл метанола и после прибавления 3 мл 96 о-ной серной кислоты гидрируют в присутствии 4,1 мл ледяной уксуснойкислоты и 3,1 г 10%-ного палладия на угле. После фильтрации и выпаривания раствора продукт (сульфат) в тонкослойной хроматограмме на силикагеле имеете =0,2.)Частичная последовательность А 2:Н-влв-гли-вал-про- ИН.1. г -вал-про-ЯНРастворяют 75 г Н-про-ЯНв 850 млдиметилформамидв, прибавляют 312 г -ввлОХф и затем раствор в течение 16 чвс оставляют стоять при кол 1 нвтной температуре.После выпаривания в вакууме остаток пере:криствллизовыввется из сложного уксусногоэфира, Получают Е -вал-про- ЯН т,пл. 130 е Ф131 ф = - 41 в диметилформамиде.3 ц2,-гли-ввл-про-МНРастворяют Е -вал-про-ЯНр 2200 млметанола, прибавляют 85 мл 6 н, солянойкислоты в метаноле, гидрируют в присутстовии пвллвдия на угле при 20 и нормальномдавлении, затем отфильтровывают от катализатора. Продукт выделяют простым эфиром,промывают и затем высушивают. 120 гполученного Н-ввл-про-ЯНКМ(.пл. 217218 С;0 оЦ = - 57 в метаноле) суспендируютв 1800 мл диметилформамидв, прибавляют 196 г-гли-ОХф, затем 67 мл триэтиламина и в течение 17 чвс встряхиввоют при 20, Вьщеленный гидрохлоридтриэтилвмина отфильтровывают и фильтрвтупвриввют в вакууме. Остаток растворяютв смеси этилацетатв и воды. После высущиввния нвд сульфатом натрия и выпаривания получают Ь -гли-ввл-про-Щт.пл. 82ние 17 час раствор оставляют стоять прио20 . Затем выпаривают в вакууме досухаи остаток кристаллизуют из этилацетатаи эфира, Получают -ела-"тли-вал-про-ЯНо1т,пл. 80 . (с разложением);оЩ = - 31 в диметилформамиде.4. Н-ала-гли-вал-про-ЯНСуспендируют 27,5 гХ -ала-гли-вал-про-ЯНр 550 мл метанола и после прибавления 3 мл 96%-ной серной кислотыгидрируют в присутствии 4,1 мл ледянойуксусной кислоты и 3,1 г 10%-ного палладия на угле. После фильтрации и выпаривания раствора продукт (сульфат) в тонкослойной хроматограмме на силикагелеимеетй = 0,4.Система;хлороформ и метанол 7:3 +0,5% воды.Частичная последовательность В 1:Й -тре-асн-тре-гли-ЯНИН,Растворяют 98 гЕ -тре-асн-тре-гли,-оэт в 1000 мл диметилформамида и прибавляют 100 мл гидразингидрата. Послестояния в течение 16 час при комнатнойтемпературе отфильтровывают и дополни,тельно промывают водой и простым эфиром. Получают указанное в заглавии сое,динение; т.пл, 221;А= - 9 и диметил; формамиде.Частичная последовательность С 1.Н-арг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про ЯН .Растворяют 13,5 г БОК-ерг-тре-аснтре-гли-ЮКЯЯр 270 мл диметилформамида и воды (8:2), охлаждают до -15,прибавляют 40 мл 4 н, раствора солянойкислоты в диоксане и 2,5 мл трет-бутилиитрита. Перемешивают в течение 10 минопри -15, прибавляют 28 мл триэтиламина, отфильтровыиают, прибавляют 10,5 г,16 час при 0 . Затем выпаривают досуха,оостаток промывают простым эфиром и высушивают. Остаток оставляют в метаноле,прибавляют десятую часть объема воды исемикратное количество хлороформа н полученный раствор пропускают через колонку из 500 г силикагеля. После элюироиания метанолом получают после выпариванияБОК-арг-тре-асн-тре-гли-иал-гли-ала-профПоследний суспендируют в 200 млф 4 й растиора соляной кислоты в диоксанеои в течение 2 час перемешивают при 25 .Выпаривают досуха, остаток растворяютв 0,2 н, уксусной кислоте, обрабатываютамберлитомЦ - 410 (в виде ацетата) иводный раствор лиофилизуют, Затем остаток промывают простым эфиром, этилацетатом и опять простым эфиром и и,еу:.,- вают над стружками глдроохиеи натрия,Получают указанное в заглавии соею л еп .:в виде диацетата; т,пл, 19 э (е ра,з;тс же 5, нием),щ = - 64 в диметилформа,",д,11 Л(,1)Частичная последовательность(:3 --тре-асн-тре-гли-ала-гли-.вал-про- Ц-"Ф" Аналогично способу получения частичщ ,ной последовательностн 6,получают изОК-арг-тре-асн-тре-гли-КЮИ и Н-"ала -гли-иал-про-МЦчастичная последовательностьЯ) указанное в заглавии соединениеов виде диацетата; т.пл. 155 ( с разложе 20 Оу нием),Ив = - 38 и диметилформамидеЧастичная последовательность С,:3 -тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-йН,.оК охлажденному до -15 раствору 11 гЕ-тре-асн-тре-гли- МИЙО частичная пос.:, - щ довательностьВ) в 350 мл диметилформамида прибавляют 47 мл 1,85 н. рл;твора соляной кислоты в диоксане и 2,2 м;трет.-бутилнитрита. Перемешивают т .еч-о.в диметилформамиде. После 90 мин и.:ре;,ошивания при 0 сгущают в вакууме, к,и.30 бавляют хлороформ и вьщеленный матери.ал отфильтровывают и высушивают. Раствор этого сырого продукта в воде метанолефильтруют через дауэкс, доводятамберлитом 1 ЯАдо нейтрального ЗЬ состояния и затеьр выпаривают в вакууме.Остаток растирают в ацетонитриле, нагревают, фильтруют и высушивают. Получаютуказанное в заглавии соединение т,пл.о220 (с разложением).зЕО о40 Ф".1) = - 28 в диметилформамиде.Частичная последовательность ( .Ь-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-поо- ИК.Аналогично способу полученич частичной последовательности С получают из ф Ж-тре-асн-тре-гли-ИНИН(частичная последовательностью) и Н-ала-гли-вал-про-ИН(с разложением);щ,г "дооФ 3 = - 25 в диметилформамидеЧастичная последовательность С .Я -арг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-проВНа35: Растворяют 10 гВ -тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-ЙН (частичная последовательность С ) в 800 мл метанола - воды,йрибавляют 0,5 г угля на палледии и гщрируют при нормальном давлении, Отфильт ровывают от катализатора и выпаривают вЭ.Ьакууме. Полученное масло Н-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ела-про- Й Н растворяют в100 мл диметилформамида, прибавляют10 гЕ -арг-Осу и в течение 16 час остав 3олают стоять при 20 . Затем раствор сгушают в вакууме, продукт выделяют с помощью ацетона и отфильтровывают. Остаток суспендируют вацетоне, нагреваютдо всВипания фильтруют и высушивают.Получают указанное в заглавии соединение, 10ао от,пл. 201 (с разложением);ВЦО = - 15в диметилформамиде.Частичная последовач ельность С,-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про-КН, 15Аналогично способу получения частичной последовательностиСбпопучают из 1 -тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про-ф(частичная последовательность С) и,Еарг-Осууказанное в заглавии соединение; т.пп. 185 2020 о-гис-лиз-( БОК ) -лей-гпн-тре лфап-про-ОН. 261. Н-тре-фап-про-ОН.Растворяют 176 г -фал-про-Оме в1000 мл метанола иф 1 н.), гидрируютов присутствии палпадия на угле при 20и 1 атм и выпаривают. Остаток растворяют в 400 мл диметилформамида, прибавляют при 0 100 мл триэтиламина, выкристаллизовавшийся гидрохпоид триэтиламина отфильтровывают и к фильтрату прибавпяют, -тре-Ц(полученный из 87 гЬ тре ЗбЪЦЦЦЦ путем растворения в 100 мл 1 н, соляной кислоты и прибавляют 35 мл 1.н.нитрита натрия). Затем в течение 16 часооставляют стоять при О, выпаривают досу-,ха, остаток растворяют в этилацетате, промывают разбавленной соляной кислотой изатем разбавленным аммиаком, высушивают и выпаривают. Остаток пульвериэируюти гептане, промывают петролейным эфироми высушивают. Получают -тре-фал-проо го о-Оме; т.пл. 92 (разложение),К= - 16в диметилформамиде.Растворяют 53 гЬ -тре-фап-про-Омев 530 мл метанола, прибавляют 100 мл2 н. натрового щелока, в течение 1 часа 50ооставляют стоять при 25, прибавляют50 мл 2 н. соляной кислоты, концентрируют до. приблизительно 200 мл, прибавляют еще 100 мл воды, устанавливаютзначение рН = 10, водный раствор, промы-., 5вают два раза этилацетатом, затем устанавливают значениерН = 1 4 н. соляной кисГлотой выделенный трипептид К -тре-фал-ппо-ОН экстрагируют этилацетатом выосушивают и выпаривают; т.пп. 105 60 8фе, о61 р = - 28 в диметипфор.ламиде. Остаток растворяют в смеси 500 мп диоксана и 100 мл воды и гидрируют в призсутствии палпадиевого катализатора при 20и под нормальным давлением. Фильтруют,выпаривают досуха, остаток промываютэфиром и высушивают. Получают Н-тре-фапо-по-ОН; т.пл. 192 (с разложением);И = - 41 в 95%-ной уксусной кислоте.32, 7,:-гис-лиз-( БОК ) -лей-гпн-тре-фап-про-ОН,Растворяют 40 г -гис-пиз(БОК)-лей-глн-МНИКв 400 мп диметипформамида,оохлаждают до -20, прибавляют 75 мп диоксана и,2 н.Щи затем 6 мп трет,-бутипнитрита, перемешивают в течение 10 минопри -20, прибавляют 30 мп триэтипаминаи 20 г Н-тре-фал-про-ОН и в течение16 час оставляют взаимодействовать, Затем выпаривают досуха, остаток промываю,простым эфиром, разбавленной уксуснойкислотой, простым эфиром, и, наконец, горячим этипацетатом. Затем высушивают ввысоком вакууме и получаются. -гис-пизе(разложение);кО оЫв = - 47 в диметипформамиде.Частичная последовательность ЭЯ -гис-пиз-(БОК)-пей-гпн-тре-фап-про- книн,1, Е -гпн-тре-фап-про-Оме.84,8 гЕ-тре-(т.бут,)-Оме растворяютв 1500 мп метанола и прибавляют 125 мп2 н. соляной кислоты и 10 г 10%-ногопалпадия на угле. После гидрирования втечение 4 час отфильтровывают от катализатора и полностью выпаривают..б 1,2 г 7. -глн-ОН и 25,6 г М -оксисукцинимида растворяют в 1000 мл ацетонитрила и диметилформамида и охлаждаютодо -15 . Сперва прибавляют раствор 45,7 гдициклогексилкарбоциимида в 200 мларетонитрила и затем растворяют поаученный НС 1 Н =тре-(т.бут)-Оме в диметилформамиде при прибавлении 30,4 мл триэтиламина. При периодическом встряхивании оставляют стоять 16 час при комнатной температуре,Выкристаллизовавшийся гидрохлорид триэтилвмина или дициклогексилмочевину отфильтровывают и фильтрат полностью выпаривают. Остаток растворяют в сложном уксусном эфире и промывают 1 н, соляной кислоты и 5%-ным бикарбонатом натрия. После высушивания над сульфатом натрия органическую фазу сгущают до объема приблизительно в 200 мл и прибавляют простой петролейный эфир, выделенное масло растирают в порошок и отфильтровы9веют, 11 одучеют Е -гпн-тре-(т,бут) -Оме;о Яо от.пп. 106; ГО 1 0 -- +11 в диметилформа, миле.78,0 г Ь -гпн-тре-(т,бут)-Оме растворяют в 800 мд метанола и прибавдяют к 65 мд гидрезингидрита. После 48 час выдержки при комнатной температуре раствор, полностью выпаривают. Остаток обрабатывают водой и затем перекристаплизовывают из; метанола и воды. Г 1 одучеют Б -гдн-тре-10о;-(т.бут)- ЙН ЙН; т.пд, 202Яо, оР 3- 13 в метаноле.45,3 г Е. -фап-про-Оме растворяют в 750 мд метанола и прибавляют 55 мд 15 2 н, соляной кислоты и 12 г 10%-ного папдадия на угле. Г 1 осде гидрирования в течение 2 час раствор отфильтровывают от катализатора и фипьтрат подностью выпаривают. 2049,5 г 7 -гпн-тре-(т,бут) - ИН Ж Н растворяют в 500 мд диметидформамидаои охдаждают до - 20, прибавдяют 77 мд 5 н, соляной кислоты в простом эфире и 13,4 мп трет,-бутиднитрита и прододжают перемешивать 10 мин и прибавлением 54 мд триэтиламина доводят до нейтрального состояния. Г 1 опученный НС 1Н-фад-про-Оме растворяют в 150 мп диметидформ:,амида, прибавляют 15,4 мд триэтипемина и все прибавляют к дипептидазиду, Послечперемешивания в течение 4 час при комнатной температуре отфидьтровывают от выкристаддизовавшегося гидрохпорида триэтид амина и фипьтрат полностью выпаривают, Остаток фильтруют при помощи хлороформа и метанопа через колонку с сидикагедем. После кристаллизации из этидацетата и петродейного эфира получают Ь -гпн-тре.(т,бут)-фап-про-Оме; т,пд. 110о 40И оэ = - 41 в метаноле.Тетрапептид растворяют в 250 мд трифторуксусной киспоы. После 20 мин 1стояния при комнатной температуре раст вор сгушают до половины объема и продукт выдедяют эфиром. Фильтруют и промывают эфиром, получают после высушивао ния Х -гдн-тре-фап-про-Оме; т.пд. 154;ъ 0оЮь = - 59 в метаноле, 502, Б -гис-пиз-(БОК)-пей- ИН ЙН2114 г-диз(БОК)-ОН, 48 г Н-дей.-Оме и 69 г Й -оксисукцинимида растворяют в 600 мд этипацетата и охлаждаюто55 до -20 . К этому раствору прибавляют раствор 65 г дицикдогексидкарбодиимида. в 300 мл этипацетата, При периодическомвстряхивании оставляют стоять в течение 16 час при комнатной температуре, Вык 10ристапдизовевшуюся дицикдогексилмочевину отфильтровывают и фидьтрат полностью выпариваютТвердый остаток обрабатывают водой. После перекристапдизации из этипацетата и петродейного эфира получают К -диз-(БОК) -дей-Оме;о, 2 о от.пп, 113; Гд э = - 18 в метаноле.101,5 Б -диз-(БОК) -пей-Оме растворяют в 1000 мд этипацетата и прибевдяют предварительно охлажденный раствор 40 мд 5 н. соляной кислоты в простом эфире и 300 мд сложного уксусного ,эфира. Посде прибавления 5 г 10%-ного падпадия на угле в 50 мд диметцдформамида гидрируют 31/2 часа. Затем отфцдьтровывают от катализатора и фильтрат выпаривают,78,7 г Б -гис- ЙН ЙН растворяют в 400 мд диметипформамида, прибавляют 182 мд 5 н. содяной кислоты в простомоэфире и охлаждают до - 10 . После прибавпения 32,5 мп трет.-бутиднитрита прододжают перемешивать еше 10 лии и добавлением 140 мп триэтипамина доводят до нейтральной реакции. Полученный ранее НС 4 Н-диз(БОК) --дей-Оме растворяют в 300 мд диметилформамида, прибавляют 36,4 мп триэтиламина и прибавляют все к раствору азида,После перемешивания в течение 4 час прикомнетной температуре выкристапдизовавшийся гидрохдорид триэтипамина отфипьтровывают и фипьтрат полностью выпаривают Подучают масло, которое растворяют в этипацетате, органическую фазу промывают водой, высушивают надсульфатом натрия, фильтруют и сгушают.Затем продукт выделяют петропейнымэфцром и отфильтровывают, Сырой продукт очищают путем хроматографии насидикагеде и эпюирования хдороформоли метанолом. После кристаппизации из1 эфира и петропейного эфира получаюто.;М -гис-пиз-(БОК)-дей-Оме; т.пд. 1463013 - - - 28 в метаноле,64,5 г Ъ -гис-диз-(БОК)-дей-Омерастворяют в 300 мд метанопа и прибаадяют 15 мд гидразингидрата, После 3дней стояния при комнатной температуре раствор подностью выпаривают, К остатку прибавляют этидацетат и н-бутаноди несколько раз промывают насыщеннымраствором хдорида натрия. Органическую фа:зу выпаривают досуха и остаток фидьтрукдчерез колонку сидикагедя при помоши хдороформа и метанола. ПодучаютЕ -гис-диз(БОК)113. т. -гис-лиз( БОК) -лей-глн-тре-фал-про - ИНИНЫ38,4 г З.-глн-тре-фал-про-Оме растворяют в 1500 мл метанола и диметилформамида прибавляют 10 г 10%-ного палладия на бугле в 50 мл воды, гидрируют 1/2 часа,катализатор отфильтровывают н фильтрат выпаривают.386 г-гис-лиэ(БОК)-лей-ИКЙНрастворяют в 250 мл диметилформамида. щПосле охлаждения до - 1 д прибавляюто42 мл 5 н. соляной кислоты в эфире и7,3 мл трет,-бутилнитрита. Перемешивают 10 мин и доводят 29,5 мл триэтиламина до нейтрального состояния. Полученный 15ранее Н-глн-тре-фзл-про-Оме растворяютв 250 мл пиметилформамида и прибавляютв раствооу пептпдазида. После перемешивания в течение 4 час при комнатной температуре выделившийся гидрохлорид триэм 20тиламина отфильтровывают и фильтратполностью выпаривают, Остаток, растворяюта этилацетате и ц бутаноле и промывают 1 и, аммиаком, 1 н. серной кислотойи несколько раз водой, Органическую фазу полностью выпаривают и остаток очишают пропусканием через колонку силикагеля при помоши хлороформа, метанола,и воды, Получают Б -гис-лиэ(БОК)-лейглн-тре-фал-про-Оме; т.пл. 171оЗОи йд оИ= - 54 в метаноле,43,6 г В -гис-лиз(БОК) -лей-глн-тре-фал-про-Оме растворяют в 1000 мл метанола и диметилформамида и прибавляют44 мл гидразингидрата. После 4 дней сто- фбчния при комнатной температуре растворполностью выпаривают, Остаток вывЖиваютв ацетоиитриле. После охлаждения до приблизительно 20 отфильтровывают, Получают-гис-лиз-(БОК) -лей-глн-тре-фало-.58 в метаноле,йЧастичная последовательность Е1Н-гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-про- фарг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-ИН2М е т о д А. Растворяют 10 г гептапептида (частичная последовательностьВ) в 30 100 мл диметилформамида, выпаривают, остаток растворяют в 100 мл диметилформамида, прибавляют 1 5 г Факсисукцинимида,оохлаждают до О, прибавляют 5 г дициклогексилкарбодиимида, 3 часа оставляют вэа имодействовать, выделившуюся дициклогексилмочевину отфильтровывают, концентрии руют до 30 мл и полученный сложный гептапгптидоксисукцинимидовый эфир Р, -гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-Осу выпе-. 60.1 2ляют прибавлением эфира. После промывания простым эфиром остаток растворяют в 100 мл диметилформамида, прибавляют 101 нонапептидамида (частичная последовательнссть) и в течение 16 чвс сстевннют ввеимодействовать. Прибавляют 500 мл этилацетата и фильтруют. Остаток растворяют в циметилформамиде, прибавляют 10 мл уксусной кислоты и сном выделяют этилацетатом. фильтруют, промывают этилацетатом и эфиром и высушимют. Получаются-гис-лиэ(БОК)- -лей глн тре-фал-про-арг-тре-асн-трегли-вал гли-ала-про- ЯаЕДСОЯ 1 уь 24 о ( в диметилформамиде ), который растворяют в 80%-ной уксусной кислоте. Затем прибавляют 5 г палладия на угле, гидрируют при нормальном давлении и комнатной температуре, Фильтруют, выпаривают в высоком вакууме досуха при 20 и остаток промывают эфиром, Посоле высушивания над стружками КОН получают частичную последовательность Е 1, триаце-тат; т,пл, 185 (с разложением);26оЯд = - 42 в 1 н, уксусной кислоте,М е т о д Б, Растворяют 12 г нонапептида (частичная последовательность С 5 ) в 1000 мл диметилформамида и воды, прибавляют 1,8 г палладия на угле и гидри,руют при нормальном давлении. Отфильтровывают от катализатора и фильтрат сгушают в вакууме до 60 мл. Этот раствор Н- -арг-тре-асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-Й Н 2охранят при -20оК предварительно охлажденному до -15 раствору 10 г Ь-гис-лиз(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-)НКН 2 (частичная последовательностьП 2) В 100 мл диметилформамида прибавляют 21 мл 1,85 н, раствора соляной кислоты в диоксане и 1,1 мл трет. - бутилнитрита. В течение 10 мин перемешио о вают при -15, охлаждают до -30, прибавляют 6 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор Н-арг-тре-асн-тре-гли-вал,-гли-ала-про-ЦН 2 в диметилформамиде. После перемешивания в течение 90 мин при О раствор сгущают в вакууме, прибавляют хлороформ, осадок отфильтровывают, промывают хлороформом, затем этилацетатом и ,вйсушивают. Сырой продукт растворяют в 1смеси метанола, хлороформа и воды и нано сят на колонку силикагеля. Элюируют, чистые фракции соединяют и выпаримют в вакууме досуха, Остаток растворяют в метаноле, продукт выделяют этилацетатом, фильтруют и высушивают. Получаются, -гис-лиз-(БОК)- -лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-глио -вал гли-ала-лро-т,пл, 185 (с раэлооимением); Щ р: 29 в диметилформамиде3,68 полученного таким образом гексадекапептида растворяют в 120 мл диметилформамида и воды, прибавляют 3 г 1 0%-ного палладия на угле в 1 О мл волы и подвергают каталитическому гидрированию, Через приблизительно;.2 часа отфильтровывают от катализатора, фильтрат полностью выпаривают и получают частичную последовательность Е 10 Частичная последовательность ЕН-гис-лиз-( БОК) -лей-глн-тре фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал 1 15М е т о д В. Аналогично способу получения частичной последовательности Е 1 (метод А) получают из гептапептида (частичная последовательность 2) и нонапептида(частичная последовательностьС) частич 20ную последовательность, триацетат; т.пл.о164 (с разложением)го оч 1) = - 19 в диметилформамиде.М е т о д Г, Растворяют 30 г нонапептида (частичная последовательность Сг) в25450 мл диметилформамида и воды, прибавляют 3 г палладия на угле и гидрируют принормальном давлении, Отфильтровывают откатализатора и фильтрат сгушают в вакуумедо 250 мл. Этот раствор Н-арг-тре-асио 30-тре-гли-ала-гли-вал-про-Изранят при -20 .оК предварительно охлажденному до -1 5раствору 24 г 7 -гис-лиз (БОК) -лей-глн-тре-фал- про- ЦНН 2 (частичнаяпоследовательность ) в 200 мл диметилформамида прибавляют 52 мл 1,85 н,раствора соляной кислоты в диоксане и2,6 мл трет,-бутилнитрита, В течениео10 мин перемешивают при -15, охлажодают до - 30, прибавляют 14 мл триэтиламина и фильтруют в холодный раствор Н-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- ЮН в диметилформамиде. После2оперемешивания в течение 90 мин при 0растворсгущаютввакууме, прибавляютхло45, рофюрм, осадок отфильтровывают, промываютхлороформом, затем этилацетатом и высушивают. Сырой продукт растворяют в смеси метанола, хлороформа и воды и наносят на колонку силикагеля, Элюируют,чистые фракции соединяют и выпариваютв вакууме досуха. Остаток растворяют вметаноле, продукт выделяют этилацетатом,фильтруют и высушивают, Получают Е -гис-лиз-( БОК ) -лей-глн-тре-фал-про-арг-треИ-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про- Н)1 ь;т.пл, 180 (с разложением);( = - 30о ге ов диметилформамиде,6,75 получаемого таким образом гексадекапептида растворяют в 220 мл метано- Е) ла и воды, прибавляют 6 г 10;,лчпалладия на угле в 20 мл воды и 1 вергают каталитическому гидрироваппилПосле приблизительно 2 час отфильтровывают от катализатора и фильтрат полностью выпаривают. Получают частичнуюпоследовательность Е, .2Частичная последовательность Г1, 30 мин стояния полученнуюдициклогексилмочевину отфильтровывают. К фильтратуприбавляют 71,2 г Н-лей-Оме, затемв течение 4 час оставляют стоять и выпаривают в вакууме. К твердому остатку прибавляют этилацетат и воду, Органическуюфазу затем промывают 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой и разбавленной серной кислотой (рН ф 3), водой,высушивают над сульфатом натрия и выпаривают, Остаток растворяют в хлороформе, ккоторому прибавляют 1" метанола, и фильтруют через колонку силикагеля ( 10-кратноеколичество). Получают -асп-(ОТБ)-лейо,-Оме; т.пл, 58;Г 3ЫЛр = - 16 в диметилформамиде.2.-глн-асп(ОТБ)-лей-Оме,Растворяют 118 г В -асп(ОТБ)-лейОме в 2000 мл метанола, Затем смешивают 15 г 10%-ного палладия на активном угле в 63 мл 4 н. соляной кислотыи прибавляют к раствору. Все подвергаютгидрированию в течение 2 час при комнатной температуре и нормальном давлении,При этом употребляют приблизительно85% (от теоретического количества)водорода, Катализатор отфильтровывают и фильтрат полностью выпариваЮт, получаютН-асп(ОТБ)-лей-Оме. НСС в виде аморф,ной пены.91,7 г-глн-ОНф и 93,8 г Н-асп(ОТБ)- -лей-ОмеНСС растворяют в 500 мл диме -тилформамида и прибавляют 51 мл И -мйтилморфолина, В течение 15 час оставляютстоять при комнатной температуре и затемраствор полностью выпаривают в вакууме,Полученный таким образом остаток хорошообрабатывают водой и отфильтровываютот воды. Затем перекристаллизовывают изметанола. Получают й -глн-асп(ОТБ)-лейо35Соотношение аминокислот после кислотного гидролиза (бн,НС 16 час):асп 3,2;. тре 3,9; сер 2,7; глн 2,0; про 2,0;юли 3,0; ала 1,0; цис 1,6; вал 2,0;лей 5,0; фал 1,0; гис 1,0; лиз 2,0;40арг 1,0. Способ получения полипептидов обшей Дрмулы Н Цбс-сер-асн-лей-сер-тре-ц с-вал- лей-гли-лиэ-лей-сер-глн-асп-лей-гис-лиз- лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-глиХ-гли-У-про 4 Н2где Х - остаток валина, а У - остатокаланина или Х - остаток аланина, а У -остаток валина,или их кислотно-аддитивных солей иликомплексов с тяжелыми металлами, о т -лич аюшийс я тем, чтопептиды 55 указанной формулы получают известнымипептидными методами, например карбодиимидным, причем не участвующие в реакции свободные функциональные группызащищают промежуточно, в подходящей 60 стадии синтеза образуют дисульфидиыйной кислоты в эфире и 0,252 мл трет. -бутилнитрита. В течение 10 мин продолжают перемешивать и затем доводят 1,01 мл,триэтиламина до нейтральной реакции. Гексадекапептид Е растворяют в 50 мл 5диметилформамида и прибавляют к раствору гептапептидазида. После перемешиванив течение 4 час при комнатной температуре выделенный гидрохлорид триэтиламинаотфильтровывают и фильтрат полностью вы ,Опаривают, Остаток растворяют в небольшомколичестве метанола и высаживают егоприбавлением простого эфира, Сырой продукт хроматографируют на колонке силикагеля и элюируют хлороформом, метанолом 15й водой. Получают указанное в заглавиисоединение; т.пл. 225;о-(ОТБ) -лей-гис-лиэ(БОК)-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-тре-гли-ала-гли-вал-про-ИН 2 2 СНЗСООН ЗН 20,Аналогично способу получения частичной последовательностиСполучают из гептапептида (частичная последовательность )и гексадекапептида (частичная последовательность Е 2) указанное в заглавии соединение; т.пл, 216о1 иеО Ойлэ = - 19 в диметилформамиде, З 0Пр и м е р 1, Н-Цис-сер-асн-лей-сер-тре-ивс-вел-лей-тли-лив-лей-сер-глн-неллей-гис-лиз-лей-глн-тре-фал-про-арг-тре.асн-тре-гли-вал-гли-ала-про-й Н 2.В 30 мл 607 р-ной уксусной кислотырастворяют 650 мг тре-гли-лиз(БОК)-лейсер-глн-асп (ОТБ); -лей-гис-лиз ( БОК)- и-леи-глн-тре-фал-про-арг-тре-асн-трегли-вал-гли-ала-про- КН (частичнаяпоследовательность 6, ) и в течение216 час оставляют стоять при комнатнойтемпературе. После прибавления водынесколько раз промывают простым эфиром.Водную фазу пропускают через колонку самберлитом И А(ацетат) и элюатупаривают досуха,Растворяют 295 мг БОК-цис-сер-асилей-сер-тре-цис-вал-лей-ОН в 10 мл диметилсульфоксида и диметилформамида,прибавляют 131 мг" - оксисукцинимидаи 59 мг дициклогексилкарбодиимида ичерез 6 час отфильтровывают от выделившейся дициклогексилмочевины, Полученныйотщеплением тритильной группы трикоэапептид растворяют в 10 мл диметилформамида и прибавляют к фильтрату, Через48 час при комнатной температуре продукт выделяют прибавлением эфира. Оса док переосаждают эфиром из метанола и полученные после высушивания 220 мгсырого защищенного дотриаконтапептидарастворяют в 4 мл смеси хлористого метилена, трифторуксусной кислоты и водыи через 1 час стояния при комнатнойтемпературе упаривают досуха. ОстатокРастворяют в 0,2 н. уксусной кислоте,наносят на колонку (1 х 300 см) с биогелем 1 и элюируют 0,2 н. уксусной кислотой. Соединенные чистые фракции выпа -ривают и лиофилизуют. Получают укаэанное в заглавии соединение; т.пл. 2 1 5(разложение);Х= - 75 в 1 н. уксусной кислоте,Соотношение аминокислот после кислотного гидролиэа (6 н.НС,16 час): асп 3,1;тре 3,7; сер 2,8; глн 1,9; про 2,0;гли 2,9; ала 1,0; цис 1,6;.,вал 2,0;лей 5,2; фал 1,0; гис 1,0; лиз 2,0 а)г 0,9и - . -- .-сер и м е р 2. Н-Цис-сер-асн-лей-сер-тре-ц с-вал-лей-гли-лиэ-лей-се