430546

(61) Зависимый от патента 22) Заявлено 14.10.69 (21) 1370715/23-4(33) ШвейцарияОпубликовано 30.05.74, Бюллетень20 Государственный комитет Совета Министров СССР ео делам изобретений и открытий(088.8) ата опубликования описания 30,10.7(72) Авторы изобретени Иностранцыакс Бруггер, Бруно Камбер, БернхаПетер Зибер(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИП ПЕПТИДОВтением предлагае в получении гипобщей формулы Изобретение относится к области получения новых пептидов, которые могут найти применение в качестве эффективных гипокальцемических препаратов.Предлагаемый способ позволяет получать пептиды, структура которых близка структуре человеческого тиреокальцитонина,Получаемые таким образом пептиды отличаются от человеческого тиреокальцитонина лишь наличием в положении 8 других амино кислотных остатков вместо метионина, а именно 1.-валина, Ь-норвалина, 1.-лейцина, Ь-изолейцина, Ь-норлейцина и Ь-а-аминомасляной кислоты. Замещение остатка метионина на более стабильные остатки приводит к упроще нию синтеза, но конечные пептиды обладают биологической активностью, не меньшей, чем человеческий тиреокальцитонин, что весьма ценно.В соответствии с изобремый способ заключаетсякальцимических пептидов о цис-гли-асн-лей-сер-тре-цис-Х-лей - гли третир-тре-глн-асп-фал-асн-лиз-фал-гис-тре - фал про-глн-тре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про - ИНгде Х - Ь-валин, Ь-норвалин, Ь-лейцин, Ь-изо-лейцин, Ь-норлейцин, Ь-а-аминомасляная кислота, а также их К"-ацил- и К" -дезаминопроизводных, и отличается тем, что указанные пептиды получают конденсацией фрагментов 1 - 7, 1 - 8, 1 - 9 или 1 - 10, содержащих дисульфидный мостик, с фрагментами 8 - 32, 9 - 32, 10 - 32 или 11 - 32 соответственно, с последующим удалением защитных групп и выделением целевых продуктов известными способами.П р и м е р 1. Кбз-тре-тир-тре-глн-асп- (отбу). фал-асн-лиз- (бок) -фал-гис-тре-фал - про - глнтре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-МНРастворяют 7,3 г кбз-тре-тир-пре-глн-асп(отбу) -фал-асн-лиз- (бок) -фалон в 75 мл диметилформамида, прибавляют 1,33 г К-гидроксисукцинимида и охлаждают раствор до - 22 С. Прибавляют охлажденный раствор 1,195 г дициклогексилкарбодимида в 15 мл диметилформамида (раствор А). После перемешивания в течение 1 час при - 22 С и 5 час при +4 С опять охлаждают раствор до - 22 С. Далее прибавляют к раствору А доведенный5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 триэтиламином до рН 6,7 - 7 и охлаждают раствор 6,9 г и-гис-тре-фал-про-глн-тре-алаиле-гли-вал-гли-ала-про-КНг в 80 мл диметилформамида. Спустя 14 дней прибавляют суспензию к новому раствору А, приготовленному из 0,73 г защищенного нонапептида. Оставляют еще на 7 дней при 0 С, фильтруют после этого суспензию и упаривают фильтрат в вакууме досуха, Остаток очищают хроматографией на колонке из силикагеля в системе и-бутанола - ледяной уксусной кислоты - воды (4: 1: 5).П р и м е р 2. и-Тре-тир-тре-глн-асп- (отбу)- фал-асн-лиз- (бок) -фал-гис-тре-фал-про - глнтре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-МНг,Растворяют 2 г описанного в примере 1 продукта в 150 мл диметилформамида и гидрируют. После 21/г час прибавляют 0,3 мл 4,844 н. соляной кислоты. После 21 час фильтруют и упаривают фильтрат, Остаток растворяют в 25 мл диметилформамида, прибавляют 0,73 мл 1,0 н. соляной кислоты, перемешивают с 40 мл этилацетата и охлаждают до 0 С. Осадок отфильтровывают, растворяют его в третбутаноле - воде и лиофильно высушивают. Продукт показывает а - 25,2 (с=2 в диметилформамиде) .П р и м е р 3. Бок-гли-асн-лей-сер-тре-цис(бзл) -МгНг-кбз.9,2 г и-цис- (бзл) -ХгНг-кбз растворяют в 300 мл перегнанного диметилформамида, к нему прибавляют 12,2 г бок-асн-лей-сертре-ОН и перемешивают при комнатной температуре до растворения, Раствор затем охлаждают до 0 С, прибавляют 3,28 г триэтиламина и 4,88 г К-гидроксисукцимида в 100 мл диметилформамида, продолжают охлаждать до - 22 С и прибавляют 4,36 г дициклогексилкарбодиимида в 30 мл диметилформамида,Перемешивают 1 час при - 22 С, повышают затем температуру постепенно и перемешивают еще 3 дня при комнатной температуре, отфильтровывают выпавшую дициклогексилмочевину и фильтрат упаривают досуха в высоком вакууме. Остаток растирают в смеси этилацетата и 5-ной лимонной кислоты, осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат в вакууме, растирают в сухом эфире, отфильтровывают и сушат в высоком вакууме; т. пл, 173 - 178 С; сф - 25,5 (с=2 в диметилформамиде) .П р и м е р 4. н-Гли-асн-лей-сер-тре-цис(бзл) -МгНг-кбз, ТФА.13 г бок-гли-асн-лей-сер-тре-цис- (бзл) -,ИгНгкбз растворяют в 130 мл 90 -ной црифторуксусной кислоты и раствор оставляют стоять 2 час при 22 С. Раствор затем концентрируют и остаток растирают три раза с эфиром и сушат в вакууме над едким натром; т, пл. 159 - 161 С,П р и м е р 5. Бок-цис- (бзл) -гли-асн-лей-сертре-цис- (бзл) -КгНг-кбз,6,69 г бок-цис-(бзл)-осу и 12,2 г и-гли-асилей-сер-тре-цис- (бзл) -МгНг-кбз растворяют в 100 мл диметилформамида, Раствор 150 м мол 1 триэтиламина в 100 мл диметилформамида прибавляют по каплям при перемешивании, пока реакционная смесь на мокрой индикаторной бумажке не покажет рН=значение 6,4, Раствор перемешивают 3 дня при комнатной температуре, затем упаривают в высоком вакууме досуха. Остаток два раза перемешивают с 300 мл этилацетата, затем три раза с смесью 150 мл этилацетата и 30 мл 57 о-ного раствора лимонной кислоты, отфильтровывают, сушат в вакууме и перекристаллизовывают из диметилформамида - этилацетата; т. пл, 191 - 193 С; агро - 31,5 (с=2 в диметилформами. де).П р и м е р 6. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-трецис МгНЗ,6 г бок-цис-(бзл)-гли-асн-лей-сер-тре-цис(бзл) -ИгНг-кбз растворяют при - 40 С в 700 мл сухого жидкого аммиака. При перемешивании прибавляют 973 мг натрия так, что цвет реакционной смеси изменяется только в голубой. 25 мин спустя восстановление окончено. Продолжают перемешивать 10 мин при сохранении голубого цвета, прибавляют затем 2,4 мл этилацетата и упаривают досуха, Остаток растирают с 12 мл воды, 3,2 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл этилацетата в течение 1 час при 0 С, осадок отфильтровывают, промывают два раза 10 мл 1 О/о-ного раствора уксусной кислоты и раз 10 мл этилацетата сушат в высоком вакууме.1 П р и м е р 7. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-трецис-МгНз.1,0 г бок-цис-гли-асн-лей-сер-тре-цис-МгНз растворяют в 100 мл диметилформамида и 500 мл воды, содержащей 1,23 м экв. НС 1, рН раствора доводят до 6,8 при помощи 3,7 мл 0,43 н. раствора гидроокиси калия. При сохранении этого рН-значения в течение 90 мин прибавляют по каплям при перемешивании одновременно 247 мл 0,01 н. раствора феррицианида калия и 4,9 мл 0,43 н. раствора гидроокиси калия. Продолжают перемешивать 90 мин при комнатной температуре и затем рН-значение раствора доводят до 4,0 при помощи 0,7 мл ледяной уксусной кислоты. Потом раствор перемешивают с 50 мл Дауэкс- Х 8, ацетатформа, затем с 13 мл Дауэкс-Х 8, Н+-форма, отфильтровывают и выпаривают досуха, Остаток растворяют в 50-ном третбутаноле, лиофилизируют и сушат в высоком вакууме.П р и м е р 8. Бок-нле-лей-гли-оет,Из 4,63 г бок-иле-ОН, 2,82 мл триэтиламина и 1,9 мл этилового эфира хлормуравьиной кислоты в 50 мл тетрагидрофурана приготовляют смешанный ангидрид, соединяют его с 5,05 г н-лей-гли-оет, НС 1 в 50 мл тетрагидрофурана, Продукт перекристаллизовывают из этилацетата - петролейного эфира (40: 60); т. пл.126 - 127 С; а 1 гро - 28,3 (с=1 в диметилформамиде).430546 12. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-треПредмет изобретения Составитель В. КривцовРедактор Л, Герасимова Техред 3. Тараненко Корректор 3, Тарасова Заказ 2864/18 Изд.1728 Тираж 506 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 5П р и и е р 9. Бок-иле-лей-гли-ОН.Растворяют 3,25 г описанного в примере 8 защищенного трипептида в 100 мл метанола и прибавляют 21 мл 0,53 н. гидроокиси натрия. После полуторачасового перемешивания раствор подкисляют и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в воде и экст 1 рагируют этилацетатом. Органический слой сушат и упаривают. Продукт плавится при 71 - 72 С; ар - 28,4 (с=1 в диметилформамиде),П р и м е р 10. Нле-лей-гли-ОН.Растворяют 2,42 г бок-нле-лей-гли-ОН в 24 мл 90%-ной трифторуксусной кислоты, 1 час спустя раствор упаривают, Продукт плавится при 94 - 96 С. П р и м е р 11. Бок-цис-гли-асн-лей-сер-трецис-нле-лей-гли-ОН.Растворяют 1 г описанного в примере 7 гидразида в 35 мл диметилформамида и получают азия при помощи 0,85 мл 3,64 н, соляной кислоты в тетрагидрофуране и 0,155 мл изоамилнитрита. Азидный раствор прибавляют к раствору 0,955 г нле-лей-гли-ОН и 0,324 г триэтиламина в 25 мл диметилформамида. Реакционную смесь упаривают и перемешивают два раза с этилацетатом - раствором лимонной кислоты. Примерцис-нле-лей-гли-тре-тир-тре-глн - асп - (отбу)- фал-асн-лиз- (бок) -фал-гис-тре-фал - про - глнтре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-КНРастворяют 440 мг описанного в примере 11 бок-декапептида и 109 мл И-гидроксисукцинимида в 35 мл диметилформамида, раствор охлаждают до - 22 С, прибавляют 98 мг дициклогексилкарбодиимида и перемешивают еще 11/2 час при - 22 С и 3/2 час при 0 С, Потом опять охлаждают до - 22 С, прибавляют 850 мг описанного в примере 2 докозапептидамида и доводят рН до 6,6 при помощи триэтиламина, После 7 дней при 0 С и 5 дней при 22 С раствор упаривают досуха в вакууме, и остаток хроматографируют через силикагель в системе и-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4: 1: 5),1П р и м е р 13, н-Цис-гли-асн-лей-сер-тре-циснле-лей-гли-тре-тир-тре-глн-асп-фал - асн-лизфал-гис-тре-фал-про-глн-тре-ала-иле-гли - валгли-ала-про-ХН,- (нле-кальцитонин М),1500 мг порошкообразного бок-цис-гли-аснлей-сер-тре-цис-нле-лей-гли-тре-тир - тре - глнасп- (отбу) -фал-асн-лиз- (бок) - фал - гис - трефал-про-глн-тре-ала-иле-гли-вал-гли-ала - проИНз прибавляют при интенсивном перемешивании к 10 мл охлажденной концентрированной соляной кислоты. После 10 мин прибавляют при температуре 0 С 50 мл воды и 5 мл ледяной уксусной кислоты и раствор фильтруют через колонку с мерк-ионообменником11, слабоосновным в ацетатной форме, чтобы удалить хлор-ионы. Затем при добавке к-октанола выпаривают на роторном испарителе, остаток декантацией несколько раз промывают петролейным эфиром, чтобы удалить октанол, высушивают, растворяют в 0,1 н, муравьиной кислоте и хроматографируют на колонке (3,8 см,х,120 см) с био-гелем-Р,. Собирают фракции по 10 мл. Чистоту этих фракций проверяют при помощи тонкослойной хроматографии на окиси алюминия. Соответствующие фракции соединяют и лиофильно высушивают.Аналогично получают вал-кальцитонин М,лей-кальцитонин М, и-вал-кальцитонин М, 30абу-кальцитонин М, гли 2 "-кальцитонин М. Способ получения гипокальцемических пептидов общей формулы1цис-гли-асн-лей-сер-тре-цис-Х-лей-гли-тре -тиртре-глн-асп-фал-асн-лиз - фал-гис-тре-фал-про глн-тре-ала-иле-гли-вал-гли-ала-про-ХНгде Х - 1.-валин, 1.-норвалин, 1.-лейцин,1.-изо-лейцин, Е-норлейцин- или Е-а-аминомасляная кислота, а также их М" -ацил- и М"-дезаминопроизводных, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 45 что указанные пептиды получают конденсацией фрагментов 1 - 7, 1 - 8, 1 - 9 или 1 - 10, содержащих дисульфидный мостик, с фрагментамп 8 - 32, 9 - 32, 10 - 32 или 11 - 32 соответственно, с последующим удалением защитных 50 групп и выделением целевых продуктов известными методами.