Способ получения пептидов в виде кислотно-аддитивных солей

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН ИЕ ИЗОБРЕТЕН ОП К ПАТЕНТУ яр РТ(54) СПОСОБДЕ КИСЛОТНО- (57) Изобрет в частности лотно-аддити ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРпО делАм изОБРеТений и ОткРытий(71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дь(56) Патент США М 4190646,кл. С 07 С 103/52, опублик. 1980. ОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ В ВИАПДИТИВНЫХ СОЛЕЙние касается пептидов, х получения в виде кис ных солей общей формуЯО 1277903 А 5 д 4 С 07 К 1/02, 5/04, А 61 К 37/02 лы 1 Х - Агц.уя-У, где Х - Н, Сер;У - Аяр, Авр-Ча 1, Аяр-Ча 1-МН , Аяр-Ча 1-ОСН , Авп-Ча 1, Аяр-А 1 а, Аяре,А 1.а-Ча 1, С 1 ц-Ча 1, Аяи-Ча 1, которыеобладают иммунологической активностью и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности среди пептидов были получены новые 1. Их синтез ведут ступенчатым наращиванием пептидной цепи, начиная с эфира С - концевой аминокислоты, методом активированныхэфиров и методом смешанных ангидридов с последующим отщеплением от конечного защищенного пептида защитныхгрупп каталитическим гидрогенолизом.Испытания 1 показывают, что они обладают более широким спектром иммунорегулирующего действия при низкойтоксичности, чем известные пептиды.6 табл." концентрация изучаемого вещества составляла полонину укаэанного вверху аначення 1Эаказ б 7 бб/бО Тираж 343 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Изобретение относится к способу получения новых пептидов общей формулыХ-Аг-Ьув-Чв виде кислотно-аддитивных солей, 5где Х - водород, С 1 р;Ч-Азр, Авр-Ча 1, Аяр-Ча 1-%1, АярЧа 1-0 Ме, Авп-Ча 1, Азр-А 1 а, Аяре,А 1 а-Ча 1 С 1 у-Ча 1 Азп-Ча 1 обладаюУ Э Ф0щих иммуномодулирующей активностью,которые могут найти применение в экспериментальной биологии и медицине.Цель изобретения - способ получения новых пептидов, обладающих более15широким спектром иммунорегулирующегодействия,Принятые сокращения: Е - бензилоксикарбонил-; Вос - трет-бутилоксикарбонилил-; ОВц- трет-бутилокси-,"Орйр - пентафторфенокси-; Авц - аминосукцинил-; ОМе - метокси-; ОВг 1бензилокси-; ОНВ - 4-питробензилокси-группа; ДМФА - диметилформамид;ТЭА - триэтиламин. 25Температуру плавления определяютс помощью прибора Тоттоли фирмы В 11 сЬ 1 (Швейцария). Гомогенностьпромежуточных и конечных соединений контролируют с помощью тонкослойной хро матографии на пластинках с силикагелем фирмы МегсЕ (ФРГ) в системах:1 - этилацетат-(пиридин-уксуснаякислота - вода, 20:6:11), 95:5;2 - этилацетат - (пиридин-уксус 35ная кислота - вода, 20:6:11), 9:1;3 - этипацетат - (пиридин-уксусная кислота - вада, 20,5: 11), 4: 1;4 - этилацетат - (пиридин-уксусная кислота - вода, 20: 6: 11), 3: 2; 405 - н-бутанол - (пиридин-уксусная кислота - вода, 20:6:11) 3:7;6 - хлороформ - метанол, 9:1;7 - н-бутанол - уксусная кислота - вода, 1:1;1;Я 58 - н-бутанол - уксусная кислота - вода, 4."1:5,Хроматограммы проявляли нингидрином после хлорирования с К-толидином, Удельное оптическое вращениеизмеряли на цифровом фотоэлектрическом паляриметре Рег 11 п-Е 1 шег 141(США). Растворители отгоняли на роторном испарителе фирмы (Швейцария)на водяной бане с температурой невыше 40 С.П р и м е р 1 (Метод А). Е-.АгВ(МО )-Ьуз(Е)-Азр(ОВг 1)-Ча 1-ОЫВ (1).К раствору 1,73 г (6,0 ммоль) Ча 1 -01 В НС 1 в 15 мл ДМФА добавляют 0,84 мл (6,0 ммоль) триэтиламина и 2,45 г (5,0 ммоль) Вос-Аяр-ОР 1 р,Реакционную смесь перемешивают 30 мин при комнатпой температуре, упаривают, остаток растворяют в 30 мл этилацетата. 1 аствор промывают 15 млн. соляной кислоты, 15 мл 57-ного раствора бикарбоната натрия и 15 мл воды, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Полученный защищенный дипептид (Р. 0,9) растворяют в 1 О мл 8 н. НС 1 в диоксане, через 15 мин добавляют 40 мл безводного эфира и упаривают досуха. Полученный в остатке свободный дипептид (К0,5) растворяют в 10 мл ДМФА, доводят значение рН раствора с помощью триэтиламина до 8,0 и добавляют 3, г (5,5 ммоль) Вос-Ьуз/Е/- ОРйр, Реакционную смесь перемешивают 30 мин, поддерживая рН 8,0 с помощью триэтиламина, разбавляют 60 мл хлороформа и промывают 5 мп 1 н. соляной кислоты и 15 мл воды, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают, остаток упаривают с без-, водным эфиром, Полученный защищенный трипептид (К 1 0,4) высаждают со 100 мл безводного эфира,отфильтровывают дважды промывают эфиром и растворяют в 20 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют триэтиламин до рН 8,0, а затем 3,3 г (7,0 ммоль) Е-Аг 8/11 Ог/-ОРГр. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, поддерживают рН 8,0 с помощью триэтиламина, упаривают, остаток растирают с 50 мл зтанола, отфильтровывают, промывают этанолом (210 мл), В итоге получают 3,85 г 1733) 1 с т,пл. 135-148 С; В. О, 80.П р и м е р 2 (метод Б). Е-Аг 8 (ЯО) - 1.уя(Е)-Аяр(ОВг 1)-ОВг 1 (11).Смес.ь 1,62 г (3,3 ммоль) Вас в Ь Е)-ОРйр, 1,40 г (4,0 ммоль) Аяр (ОВг 1)-ОВг 1, НС 1 и 0,98 мл (7,0 ммоль) триэтиламина в 1 С мл этилацетата оставляют стоять в течение часа при комнатной температуре и затем разбавляется с 20 мл этилацетата, Смесь встряхиваю. сначала с 10 мл 1 н, раствора соляной кислоты, затем с 10 мл 5 ь-ного раствора бикарбоната натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и затем упаривают в вакууме. Остаток укрепляют с н-гексаном, отфильтровывают и промывают с н - гек -саном. Получаемый защищенный дипептиц (выход: 81,27,; т.пл, 92-95 С; К, = 0,75) обрабатывают с 30 мл 4 н. солянокислого диоксаца в течение 30 мин, затем упаривают до сухого ос татка. Свободный дипептид (К = О,0) растворяют в 10 мл диметилформамида, раствор нейтрализуют с 0,35 мл триэтиламица и полученную суспензию добавляют к приготовленному следующим образом смешанному ангидриду: 10,6 г (3,0 ммоль) Е-Аг 8(Ю, )-ОН и 0,42 мл (3,0 ммоль) триэтиламина растворяют в 5 мл диметилформамид. Раствор охлаждают до в О С и при этой темпера 15 туре смешивают с 0,36 мл (3,0 ммоль) пивалоилхлорида капельным образом. К полученному таким путем раствору смешанного ангидрида через 5 мин при - 10 С добавляют раствор свободного пептида. Реакционную смесь перемешивают еще в течение 30 мин при 0 С, затем оставляют стоять на ночь и на следующий день испаряют до сухого остатка. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа и раствор встряхивают с 1 О мл 1 н, раствора соляной кислоты, затем с 10 мл 57-ного раствора бикарбоната натрия и, наконец, с 10 мл воды. После сушки органическая фаза30 упаривается до сухого остатка и полученный остаток укрепляют приготовленной в соотношении 1:1 смесью эфира и и-гексана. Получают 1,82 г (выход 84%) защищенного трипептида с К, = 0,70.П р и м е р 3 (метод С). 2-Агя (Ю)-Ьуя(2)-Аяц-Ча 1-ОН (111).2,51 г (12 ммоль) Ча 1-ОгВифНС 1 растворяют в 50 мл хлороформа. Раствор смешивают с 3,86 г (10 ммоль) Вос-Аяр(ОгВи) - ОЯи и 1,68 мл (12 ммоль) триэтипамина. На следующий день раствор встряхивают сначала с 3"10 мл 1 н. раствора соляной кислоты, затем с 3 10 мл 57-ного раствора бикарбоната натрия, После осушки растворитель отгоняют. Полученный в качестве остатка защищенный дипептид (К= 0,80) растворяется в 30 мл 5 н.2уксусной кислоты, содержащей бромистый водород, и раствор оставляют сто - ять на неделю. Затем реакционную смесь упаривают до сухого остатка и остаток укрепляют безводным эфиром. Получаются 2,65 г (98,27) Аяц-Ча 1-0 Н. НЬг (К= 0,15) и ацилируют дальше описанным в примере 1 методом. Данцые защищенного тетрапептида содержатся в табл. 5.П р и м е р 4. Агу-Ьуя - Аяр-Ча 1АсОН (1 Ч).2,25 г (2,22 ммоль) 2-Агя(ИО ) Ьуя(2)-Аяр(ОВг 1)-Ча 1-ОНВ (пример 1) суспецдируют в 50 мл 90%-ной уксусной кислоты. Суспензия смешивается с 1 г 5 ,-ного палладия на активном угле и через смесь в течение 14 ч пропускают водород. Затем катализатор отфильтровывают, промывают с 210 мл 907-ной уксусной киспоты, фильтрат объединяют с промывной жидкостью и затем упаривают до сухого остатка. Остаток с водой и этанолом вновь упаривают, затем растворяют в 2 мл воды и смешивают с 30 мл этанола. Полученную суспензию фильтруют и осадок промывают этанолом. Получают 0,92 г (80%) 1 Ч .с ГЫ 1 = -24,8 (С 1;10% АсОН); К = 0,10.Аминокислотный анализ: Ьуя 1,05 (1); Агя 0,95 (1); Аяр 1,04 (1); Ча 1 0,95 (1).П р и м е р 5. С 1 р-Агд-Ьуя в АярЧа 1 АсОН (Ч).4,1 г 1 Вос-Ьуя(2)-Аяр(ОВя)-Ча 1- ОМВ растворяют в 10 мл 8 н. НС 1 соляной кислоты в диоксане, через 15 мин добавляют 100 мл безводного эфира, выпавший осадок отфильтровывают, дважды промывают эфиром и растворяют в 20 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют триэтиламиц до рН 8,0, а затем 3,5 г Вос-Агд(ХО )- РОГр и 0,98 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 1 ч, упаривают, остаток растирают с 50 мл этанола, отфильтровывают, промывают этанолом (210 мл), Полученный защищенный тетрапептид (К= - 0,80) растворяют в 25 ип 8 н, НС 1 в диоксане, через 15 мин добавляют к раствору 70 мл безводного эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промывают дважды эфиром и растворяют в 30 мл ДМфА. К раствору добавляют триэтиламин до рН 8,0. а затем 2,4 г С 1 р-ОРЕр. Реакционную смесь перемешивают 1 ч, добавляют 100 мл этацола, выпавший продукт отфильтровывают, промывают этанолом (2 " 20 мл), В итоге получают 3,9 г 2-С 1 р-Агц(ИО)-Ьуя (2)-Аяр(ОВя 1)-Ча 1-ОИВ с т.пл . 166- 172 С, К = 0,80.2,2 г 2-С 1 р-Агу(Ю )-Ьуя(2)-Аяр (ОВг 1)-Ча 1-ОИВ суспендируют в 50 мл1277903 качестве сравнительного экспериментасмешивают 200 мкл суспецзии клетоки 400 мкл ВББ.Полученные смеси инкубируют в воздухе, содержащем 5% двуокиси углерода, при 37 С в течение 1 ч, послечего смешивают с 200 мкл суспензии 1%БКВС и центрифугируют при 90 ц в течение 5 мин, 400 мкл верхней фракции(жидкости) удаляют и после осторожного повторного суспецдирования берутдля расчета образования Е-розетокпо меньшей мере 400 клеток образование розетки - когда 3 или более БКВС 35 окружают один лимфоцит), Статистический анализ осуществляется с исполь, зованием распределения Стьюдента.Вследствие различной активности вотношении образсваний Е-розеток у О лимфоцитон полученных от различныхдоноров и разли цой их ингибируемости азатиоцрином, вешества характеризуются их. способностью восстанавливать активность лимфоцитов к образованию Е-розеток, ингибируемую азатиоприцом, выраженной в % восстановленияК %); ле этого стеклышки ставили на моди -15 фицированную встряхивающую машину для борьбы с желчнокаменнои болезнью и встряхивали в течение 30 с (частота встряхивания: 65 мин , высота подъема 8 см), С целью фиксирования розеток к каждсй трубочке добавляли 50 мл 0,17-ного глу.,"арового апьдегида. Через 3 мин под микроскопом насчитывались более чем три лимфоцита, связывающие происходящие от овцы эритроциты, всего оценивались 4100 клеток, Сепарированные лимфоциты содержали в качестве э,агрязне-. ния макрофаги и полиморфноядерные 907,-цой уксусной кислоты, добавляют 1 г 57.-ного Рс/С и н течение 14 ч гидрцруют, Затем катализатор отфильтровывают, промывают О мл 907.-цой уксусной кислоты, объединенный фильтрат упариваюг, остаток растирают с 30 мл этанола, образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают этанолом ,2 х 10 мл) и сушат.В итоге получают 1,12 г (93%) 17, Полученный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии ца силикагеле Б 1-100 с использованием в качестве элюента системы: метанол вода 1:1. В итоге получают 0,74 г Ч сГК 1, = -51,3 1 С 0,9; 10%-ная уксусная кислота).Аналогично получают ряд других пептидов, физико-химические характеристики которых приведены в табл.1 - 2.Иммуномодулирующая активность описываемых соединений была изучена в опьп ах 1.п чуго и п ч 1 чо по известным методикам.1. п ч.ггоИзучение на активные Е-розетки проводилось с помощью модифицированного способа 1 уЬгап и др, с .пимфоцитами частично здоровых, частично аустоиммунно больных людей (ревматоидный артрит и системная вопчанка красная). К 50 мл клеточной суспенэии лимфоцитов, смотря по обстоятельствам, добавляют 100 мл разбавленного до концентрации от 10 до 10 мол/л изучаемого вещества. Смесьоинкубировали при 37 С на воздухе содержащем 5% СОв течение 60 миц и затем смешивали с 50 мл 1%-ной суспензии эритроцитов (овечьих). Затем в течение 10 мин центрифугировали с числом оборотов 1000 мин , Посклетки максималг,цо 0%), частовязывающие розетки кнетки корригиро - вались в каждом случае до этого зцачеция. Полученные результаты представлены в табл, 3 - 4.Тест ицгибироцания азатиоприном Е-розеток.Сусцензию клеток, содержащуюб210 лимфо цито н/мл, получают из крови здоровых доноров, выбранных по случайному закону. Тест на ингибирование азатиоцрицом Е-розеток выполняется согласно ранее описанному спосооу. Коротко, э гот способ состоит во введении в 200 мкл суспензии клеток 500 мкл азатиоприна и 200 мкл VВББ без добавок, или содержащего исследуемое вещество. Вещества подвергают испытанию при концентрацияхв пределах от 1 С до 10моль/л, В 100 Экси-ЕКПС-А-ЕКГС)ЕКПС - Ах - ЕКЕСгде ЕИС ц Ак-ЕКПС обозначают средний процент клеток, образующих Е - розетки, без ицгибитора и в присутствии азатиоприна соответственно. Эксп-ЕКЕС представляет собой процент клеток, образующих Е-розетки, в присутствии азатиоприна и экспериментального вещ ства.Получеииые результаты пред):талены в табл, 5.11. 1 п ч)ло.1. Для изучеиия оказывающего влияния иа продукции антител действия выбирали метод Цегловского,Новорожденным И 1 заг - крысам самое позднее в 12-й час после их рождения внутрибрюшинно вводилось подлежащее изучению вещество в форме 25 мл жидкости с концентрацией от3 -74 1 О до 4 10 мол/л (единичная доза на каждые 9 животных). В возрасте 14 дней животные иммунизировались путем внутрибрюшинного введения каждому 0,5 мл 57.-ной суспензии эритроцитов овцы, и на 7-й день после иммунизации животные обескровливают путем декапитации, Кровь каждых трех животных объединяют, в течение 10 мин центрифугируют с числом оборотов 3000 мин и в таким образом полученной сыворотке определяют титр антител по методу Така Сяу.25Результаты выражались как титр агглютинации, причем в качестве титра принималось то наибольшее разбавление сыворотки, при котором еще различимой является агглютинация. Результаты сведены в табл. 6.2, Число клеток, производящих специфические антивещества, определялось по методу СаппдщЬаш.Суть метода состоит в том, что из 35 клеток селезенки иммунизированных животных, из суспензии эритроцитов овцы и комплемента готовится гомогенная суспензия и вводится в камеру пригодную для развития моноклеточных слоев. 40 Вокруг клеток, производящих антивещества, образуется постепенный ореол и число этих ореолов (пятен 7 идентичио с числом клеток, ироизиодяни)х цифичиое аитинещество Р 1 ау;ио Гогп)1 пд се 11 я, РРС).Подопытные жинотиы максимум иа 12-й час после своего рождения одни раз виутрибрюшинио обрабатывались с подлежащим изучению ве)цеством. Согласно методу ) каждое вещество изучалось в трех дозах. На 7-й день после иммунизации изучалась способ-. ность пропарированных из животных селезеночных клеток к образованию Р 1 адие.В табл. 7 указано частное от числа Р 1 ацез обработанных животных и числа Р 1 ациея необработанных контрольных животных.1Как видно из данных, приведенных в табл. 3 - 7, соединения, получаемые предлагаемым способом, обладают широким спектром иммуномодулирующего действия в сочетании с низкой токсичностью.Формула изобретенияСпособ получения пептидов общей формулыХ-Агд.уз-Чгде Х - водород, С 1 РЧ-Азр, Аяр-Ча 1, Азр-Ча 1-ИН , АзрЧа 1-0 Ие, Азп-Ча 1, Азр-А 1 а, Аяре А 1 а-Ча 1, С 1 и-Ча 1, Аяи-Ча 1, в виде кислотно-аддитивных солей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что синтез осуществляют путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с эфира С-концевой аминокислоты, методом активированных эфиров и методом смешанных ангидридов с последующим отщеплением от конечного защищенного пептида защитных групп каталитическим гидрогенолизом." с =1, в 103-ной уксусной кислоте,хроматографированный в колонке, заполненной силикагелем 81-100, водой и метанолом 1:1.АсОН = уксусная кислота,Таблица 3 Свивывающая Е"роветки активность лимфоцнтов, страдаощнх рематондным артритом (выравенная в процентах активности лнмфоцитов, и 4) нцентрация (написанная как отрицательный десятичный логарифмнцентрацин, мол/л) ептидг 9 ОЗ 4 П 33 ополягенне табл. 3 нцентрация (написанная какнцентрации, кол/л) отрицательный десятичный логариФм Пелтндг 9 3 1 1 8 01 р-Агц-Ьув-Лвр" 9 Агц-Ьув-Лвп-Чв 1 10 Агц-Ьув-Авп-Ча 1 19,5 187 20,6.+2,2; -1,1 4,5, +10 23,2 25,4 25,5 262 26,4 25,4 7 01 р-Агц-Ьув-Лвр"Ча 1-Туг 227 22,6 24,1 ь 0,05 Г тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая ка ТР 5) 0,05 со Бгибепс-Тенг. Таблица 4 Пелтид+ ф15 Лгц-Ьув"Авп-Ча 1 7,0 354 32, 1:16, 7 2 Агц-Ьув-Лвр-Ча 13 Лгц-Ьув-Лвр4 Агц"Ьув-Авр-Ча 1"вНв5 Агц"1.у в "Авр-А 1 аб Л 1 а-Ьув-Авр"Ча 17 Агц-Ьув-Авр-Ча 1-ОИе 23,7 18,4 9,7 27,7 24,3 23,7 20,8 25,0 28,6 23,7 22,5 20,7 20,8 23,1 25,5 23,7 20,3 23 у 9 26,4 27,9 25,3 2 е 24 е 5 28 в 27,7 27,5 27,3 20,8 24,9 26,6 Свяэываацая Е-розетки активность лимФоцитов здоровых в процентахг активности лнмфоцитон, и4 Концентрация (каписаккая как отрицательный десятичный логариФм,выпахенный в мол/л концентрации)ж( Г 9.Т 1 Т ( дх+5,8 33,2 30,7 35,0 34,9 32,0 24 э 299 255 29 э 4 225 35,5 29,9 Р 0,05 г Р тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая на ТР 5);зевР 0,01 Р тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая на ТР 5); Р 0,05 Ясцйепсзначительное действие. Таблица.5 Эффект аналогов, ТРн леввмнзола в отновенин ннгибируемого азатнопрннон образования Е-розеток сстановление в О, в присутствии соединенияконцентрации, мол/л ЕРГС Соединение 1- Т 10 10,064 26,268 22,7+4,6 38,4+5,8 25,610, г 1, 8,32235,8 15,62,0 8,+6,2 7,9 т 9, + 21, 7+Э,22,4+-6,316-+4,8"Ьув-А 1 а-Ча 1 8-Ьуз-Ави-Ча 1 ЗО 156 э 6 235 э 41 40 9 т 7,9 30,04,9 2+1,0 6,0+1,3 27,4 зЭ 6,8 в 55 3,9-З,З 1 э 6+7 57,053,-7 а 1 Аг 8-Ьув 21,763,095531 3,7+2,4 Аг 6-Ьув-Авр-А 1 11,83,0 26,6+7212,864,0 22,5+4, 422 8-1.ув- -АврЭО,Оз 5,118,486 18,7+5,2 219-58 з-Ча 1 0,24,8 40,17,8 15,6-Э,1 р-Аг 8-Ьуз-Авр-Ча 1-Ту 64,4 з 5,12,8 эб,О 27,0529925Э 46 в Аг 8-1.ув и-Ча лица 6 Действие 1 п ч(чо, выполняющее продукцию как титр агглютинации (титр антит раненное антител, эв А э) Концентрация, мол/л