Способ получения трипептидов
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
СОЮЗ СОВЕТСОЦИАЛИСТИЧРЕСПУЬЛИН 77904 х 5/08//С ц 4 С ЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ОПИСАНИЕ ИЗО ПАТЕНТУ(72) Карл Иеран Клаесон, Лейф ЭрикАурелл, Лейф Роджер Симонссон(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПЕПТИДОВ(57) Изобретение касается пептидов,в частности получения трипептидовобщей Формулы 1 и-С 1 ц-А -А -ННКйгде А- А 1 а, С 1 у, Ча 1, 1,ео, Яег,ТЬт, РЬе, 11 е, Рдр, Туг, Рго 1 ААт 8, Ьув 1 К - п-нитроанилид, которые проявляют биологическую активность и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности у соединений пептидного ряда были получены новые 1. Их синтез ведут из производного аминокислоты формулы А - ННК, где А и К имеют укаэанные значения и соответствующей аминокислоты с последующим наращиванием структуры до требуемого пептида с помощью сочетания остальных аминокислот, причем К используют в качестве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты. Новые пептиды обладают хромоформными свойствами и более высо- В кой скоростью расщепления при гидролиэе субстратов, чем известные, и могут быть использованы в качестве реагентов при определении сериковых и ЯН протеаз. 4 табл.127790Изобретение относится к способуполучения трипептидов общей формулыи-С 1 ц-А -А -МН-К (1)1где А - А 1 а, 61 у, Ча 1., 1.ец, 8 ег,ТЪг, Рго, РЬе, 11 е, Р 1 р,Туг;А - Агя, Еув;К - п-нитроанилид,новых биологически .активных соеди-.нений, содержащих хромофорную группу, которые могут найти применениев биологии и медицине.Цель изобретения - новые производные пептидов, обладающие хромофорными свойствами и более высокойскоростью расщепления,При анализе элюатов и получаемыхпродуктов методом тонкослойной хроматографии в качестве адсорбционнойсреды используют стеклянные пластины 20с силикагелем Р (Мегск) и хромато 254графирование осуществляют в следующих системах:А: н-бутанол:уксусная кислота:вода 3:2.1 (по объему);Р .хлороформ:метанол 9:1 (по объему),После хроматографирования пластины просматривают в УФ-свете (254 нм),а затем опрыскивают нингидрином иобрабатывают смесью дикарбоксидин/,/хлор,В тексте использованы следующиесокращения; НОАС уксусная кислота;Вг бензоил; СЪо карбобензокси; ДСС Р 35дициклогексилкарбодиимид; РСГ ь треххлористый фосфор; ДМР диметилформамид; ЕСН триэтиламин; НОВТ 1-оксибензотриазол; ДСНА дициклогексиламин; ДСИ дициклогексилмочевина; 40ЕОН этанол; МеОН метанол; ЕСОАсэтилацетат; ОрНР п-нитрофенокси;рБА п-нитроанилид; ТРА трифторуксусная кислота.П р и м е р 1, и-С 1 ц-С 1 у в Агав 45рЮАфНС 1 (м,в,=498,9); (м.с.ф 530,5):175 мл концентрированной уксусной кислоты и 105 мл (5,6 моль) НВг в уксусной кислоте добавляют к 35 г (0,074 моль) СЪО-Атд(МО )рНА и смесь перемешивают в течение 30 мин до получения прозрачного раствора. Затем при интенсивном перемешивании полученный раствор выливают в 2 л сухого эфира. Образующийся осадок отфильтровывают и промывают сухим эфиром, высушивают в вакууме над БаОН, Полученную бромистоводородную соль 2Н-Агд(110,) рНА растворяют в 50 мл сухого перегнанного диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре (-О С) с помощью триэтиламина до получения слегка щелочной реакции на увлажненной реакционной смесью рН-индикаторной бумаге, Обычно на нейтрализацию расходуют Е, в количестве, равном приблизительно 1,5 эквивалента НВг, Образующийся Е 1. НВг отФильтровывают. При охлаждейии к реакционной смеси добавляют 1,1 эквивалента = 0,8 моль = 26,8 г СЬо-С 1 у-ОрИР", через 30 мин добавляют еще 1/2 эквивалента = 5,2 моль Е Г 1, Смесь оставляют при комнатной температуре на ночь, Затем упаривают в вакууме, полученное масло растирают в водном растворе 27-ного ЯаНСО.1, затем растворяют в горячем метаноле и кристаллизуют при перемешивании и охлаждении, Образующиеся кристаллы отфильтровывают и промывают холодным метанолом. Хроматография в тонком слое показывает наличие лишь незначительного количества примесей, продукт перекристаллизовывают из того же растворителя, Получают белые кристаллы, представляющие собой согласно результатам тонкослойной хроматографии чистый продукт. Выход: 34 г (867,) ( С,); КЕ=0,20 (Р ); СсФ. -35,4 (С. 0,3 Метанол);1 ЬСЬо-р-( 1 цОН (м.в.=263,3)56,3 г (0,20 моль) СЬо-С 1 ц-ОН растворяют в 400 мл этилацетата, добавляют 49,4 г (0,24 моль) дициклогексилкарбодиимида, растворенные в 60 мл этилацетата, и перемешивают при охлаждении на ледяной бане, Через 2 ч образующуюся дпциклогексилмочевину отфильтровывают и оставшийся раствор упаривают досуха. Продукт (ангидрид СЬо-С 1 ц) кристаллизуют из этилацетата и петролейного эфира. Ангидрид растворяют в смеси 120 мл диоксана и 260 мл эфира, а затем добавляют 48 мл дициклсгексиламина ЯСНА), растворенные в эфире до объема 100 и . Через некоторсе время выпадает в осадок СЬо-рц ДСНА. Смесь перемешивают приблизительно в течение часа, а затем образующуюся дициклогексиламмониевую соль отфильтровь,вают и промывают эфиром и этилацетатом, дициклогексиламмониевую соль суспендируют в эгилацетате и взбалтывают с 5 г (О,8 моль) КНКО. растворенным в воде, образующийся в результате этого СЬо-рцОН переходит в этилацетатную фазу. Зтилацетатную фазу промывают 10%-ным БаС 1 в воде и сушат над Ба ЯО . На этой стадии существует опасность выпадения продукта в,осадок. Этилацетатную фазу упаривают до небольшого объема и продукт осаждают петролейным эфиром, в результате образуются 10 тяжелые кристаллы 1 Ь , по данным ТСХ представляющие собой чистый продукт.Выход: 36,9 г (80%) 1 Ь; БЕ=0,45(А); сс.3 - 30,3(С. 1,О Метанол)1 151 ЬСЬо - р-С 1 ц - С 1 у-Агд (ИО ) рНА(м.в. 641,6).10,25 г (18,3 ммоль) Ну-Агя МО /рМА НВг, полученного снятием защитных групп с СЬоу-Аг 8 002)РИа 20 с помощью НВг согласно методу, описанному в 1 а, растворяют в 35 мл сухого диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре (-1 О С) с помощью Е Н до получения щелочной ре акции на увлажненной индикаторной бумаге. Образующийся ЕИНВг отфильт. - ровывают. К реакционной смеси добавляют 2,47 г (18,3 ммоль) оксибензотриазола и 5,26 г (20 ммоль) СЬо-р- Ю -61 ц-ОН (ЕЬ), а затем при низкойтемпературе добавляют 4,53 г (22 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, растворенных в небольшом количестве диметилформамида. Смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, затем реакционный раствор упаривают и полученное масло растирают с 2% НаНСО в воде и с чистой водой. Образующееся твердое соединение растворяют в небольшом количестве ацетона, а затем дабавляют горячий метанол и небольшое количество воды, Продукт кристаллизуется при охлаждении и перемешивании, и образующиеся кристаллы отфильтровывают. Образующийся 1 Ь представляет собой согласно результатам хроматографии в тонком слое чистый продукт. После тщательного высушивания в вакууме получают 8,90 г (76%) 1 Ь.Н,=0,06 (Н,); с)- 21,5(С.0,8 диметилформамид),1,08 г (1,25 ммоль) 1 Ь освобождают от защитных групп (деблокируют) с помощью 30 мл фтористоводородной кислоты при ОС в течение часа в присутствии 0,6 мл анизола.После упаривания в вакууме продукт растворяют приблизительно в 30 мл 2%-ной уксусной кислоты и промывают небольшим количеством эфира. Водную фазу хроматографируют на колонке с Сафадексом С(Фармация Файн Кемикалз) в 2%-ной уксусной кислоте с той же средой для элюирования. Фракцию с чистым ацетатом 1 лиофилизируют и пропускают через колонку с ионообменной смолой Ц АЕ(Фармация Файн Кемикалз) в хлоридной форме в смеси этанол:вода (1:1), и той же средой для элюирования. Фракцию с чистым Гидрохлоридом 1 лиофилизируют.Высод 485 мл (78%) 1.Хроматография в тонком слое М =0,29 (А показывает только одно пятнос 1.)- 54,1 (С. 1,О, 50%-ная уксусная кислота/вода).П р и м е р ы 11-Х 111, описанные в табл. 1, осуществляют способом по примеру 1, физические константы, выходы указаны в табл. 1, условия проведения реакции сочетания и методы очистки указаны в табл. 2.1-21,5 0 МР 38 1 ЧЬ СЬо сС 1 ц-А 1 а-Аг 8-рИА О, 25 Р-55, 7 50%-ная НОАС 72- 25,4 957 - ный Ес ОН 85+Н О НВг/НОАС, ЯАЕ 25 507.-ныйЕВОН Проведены испытания трипептидов общей формулы (1), полученных предлагаемым способом и определение протеаэ с помощью субстратов с группа ми, подверженными отщеплению и определению физико-химическими методами.Субстраты, полученные. согласно приведенным примерам, могут быть использованы для определения различных 50 энзимов следующим образом.В основе определения лежит тот факт, что продукт расщепления, образующийся в результате энзиматического гидролиза, имеет Уф-спектр, по 55 существу отличный от УФ-спектра су"-. - страта, Таким образом, все и-нитроанилидные субстраты по изобретению, например, характеризуются максимумом ОрБР, крист, МеОН+Н 0 НОВТ, Е)СС 1, крист. МеОН++Н О2 НВг/НОАС, ЯАЕ50%-ныйЕгОН ОрМР, крист. МеОН+Н О НОВТ, 1)СС 1, крист. ацетон+МеОН НЬг/НОАС, ЯАЕ, 507.-ныйЕВОН ОрМР, МеОН+Н ОНОВТ, 1)СС 1, ацетон+МеОН ОрИР, этилацетат+эфир НОВТ, 1)СС 1 1)МР+этилаце- тат поглощения при 310 нм с молярным коэффициентом экстинкции примерно12000, При ч 05 нм поглощение этихсубстратов почти полностью исчезает,п-Нитроанилид, который высвобождается из субстратов при энзиматическомгидролизе, имеет максимум поглощенияпри 380 нм и молярный коэффициентэкстинкции 13200, который при ч 05 нмснижается только до 9 б 20. Поэтомус помощью снятия спектрофотометрических данных при 406 нм легко следить за количеством образующегосяп-нитроанилида, которое пропорционально скорости энзиматического гидролиза, которая, в свою очередь, определяется количеством активногоэнзима,11 277904 2В табл. 3 представлены значения каждого энзима скорость реакции вэяскоростей реакций синтетических суб- та относительно субстрата сравнения стратов с различными энэимами, Для (скорость реакции = 1). Таблица 3 Субстрат сравнения (=1007) Энэимы ТА Рха Тгу ЯБЯ100 100 1 О 330 100 360 140 3 О 1 и-С 1 ц С 1 у Ага рНА ЕЕ и-С 1 ц Бег Ага рЯА 65 130 150 Ч и-С 1 ц А 1 а Ага рИА 10 15 250 50 310 ЧЕ и-С 1 ц Рго Агя рЮА ЧЕЕп С 1 ц РЬе Ага рМА Х и С 1 ц РЬе Ьуя рЧА ХЕ и С 1 ц Ьец Ьуя рЯА 40 440 240 10 10 40 450 0 0 10 60 230 0 0 120 ХЕЕ руго С 1 ц-С 1 у-Ага рИА 15 340 260 П р и м е ч а н и е : ЯН-ВЧа 1-Ьец-Ьуя рНА;БВк РЬе-Ча 1-Агя-рНА;БВЕ 1 е-С 1 ц-С 1 у-Ага рМА;р 11 плазмин, Тгу трипсин, Рха - фактор коагуляции,1 Ж - урокиназа, ТА плазминогенный тканевый активатор.1Чувствительность субстрата срав- вестные, и могут бытьиспользованынения к исследуемому"энзиму приведе- , в качестве реагентов при определе 35на в табл. 4, нии сериновых и БН протеаз. Таблица 4 Формула изобретения Субстрат Энзим Активность ( ьО д/мин) достигаемая с 4 10 моль/л энзима Способ получения трипептидов общей формулы 1и-С 1 ц-А -А -ИН-К1где А - А 1 а, С 1 у, Ча 1, Ьец, Бег,ТЬг, Рго, РЬе, Е 1 е, Р 1 р,Туг;А - Ага, Ьуя;К - п-нитроанилид,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтопроизводное аминокислоты формулы 11А ННКгде Аи К имеют указанные значения,подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу К используют в качестве защитной дляС-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты. ЯББО, 040 0,150 0,200 0,040 Плазмин Трипсин Гха 50 УрокиназаТканевыйактиватор 1 0,040 55 Как видно из приведенных таблиц, предлагаемые субстраты гидролизуются различными энэимами быстрее, чем из
СмотретьЗаявка
2893256, 06.03.1980
Каби АВ
КАРЛ ЙЕРАН КЛАЕСОН, ЛЕЙФ ЭРИК АУРЕЛЛ, ЛЕЙФ РОДЖЕР СИМОНССОН, САЛО АРИЕЛЛИ
МПК / Метки
МПК: C07K 5/097
Метки: трипептидов
Опубликовано: 15.12.1986
Код ссылки
<a href="https://patents.su/7-1277904-sposob-polucheniya-tripeptidov.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения трипептидов</a>
Предыдущий патент: Способ получения пептидов в виде кислотно-аддитивных солей
Следующий патент: Способ получения натриевых солей производных мурамилпептидов
Случайный патент: Горелка для сварки угловых швов неплавящимся электродом в защитных газах