Способ получения трипептидов

СОЮЗ СОВЕТСОЦИАЛИСТИЧРЕСПУЬЛИН 77904 х 5/08//С ц 4 С ЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ОПИСАНИЕ ИЗО ПАТЕНТУ(72) Карл Иеран Клаесон, Лейф ЭрикАурелл, Лейф Роджер Симонссон(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПЕПТИДОВ(57) Изобретение касается пептидов,в частности получения трипептидовобщей Формулы 1 и-С 1 ц-А -А -ННКйгде А- А 1 а, С 1 у, Ча 1, 1,ео, Яег,ТЬт, РЬе, 11 е, Рдр, Туг, Рго 1 ААт 8, Ьув 1 К - п-нитроанилид, которые проявляют биологическую активность и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности у соединений пептидного ряда были получены новые 1. Их синтез ведут из производного аминокислоты формулы А - ННК, где А и К имеют укаэанные значения и соответствующей аминокислоты с последующим наращиванием структуры до требуемого пептида с помощью сочетания остальных аминокислот, причем К используют в качестве защитной группы для С-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты. Новые пептиды обладают хромоформными свойствами и более высо- В кой скоростью расщепления при гидролиэе субстратов, чем известные, и могут быть использованы в качестве реагентов при определении сериковых и ЯН протеаз. 4 табл.127790Изобретение относится к способуполучения трипептидов общей формулыи-С 1 ц-А -А -МН-К (1)1где А - А 1 а, 61 у, Ча 1., 1.ец, 8 ег,ТЪг, Рго, РЬе, 11 е, Р 1 р,Туг;А - Агя, Еув;К - п-нитроанилид,новых биологически .активных соеди-.нений, содержащих хромофорную группу, которые могут найти применениев биологии и медицине.Цель изобретения - новые производные пептидов, обладающие хромофорными свойствами и более высокойскоростью расщепления,При анализе элюатов и получаемыхпродуктов методом тонкослойной хроматографии в качестве адсорбционнойсреды используют стеклянные пластины 20с силикагелем Р (Мегск) и хромато 254графирование осуществляют в следующих системах:А: н-бутанол:уксусная кислота:вода 3:2.1 (по объему);Р .хлороформ:метанол 9:1 (по объему),После хроматографирования пластины просматривают в УФ-свете (254 нм),а затем опрыскивают нингидрином иобрабатывают смесью дикарбоксидин/,/хлор,В тексте использованы следующиесокращения; НОАС уксусная кислота;Вг бензоил; СЪо карбобензокси; ДСС Р 35дициклогексилкарбодиимид; РСГ ь треххлористый фосфор; ДМР диметилформамид; ЕСН триэтиламин; НОВТ 1-оксибензотриазол; ДСНА дициклогексиламин; ДСИ дициклогексилмочевина; 40ЕОН этанол; МеОН метанол; ЕСОАсэтилацетат; ОрНР п-нитрофенокси;рБА п-нитроанилид; ТРА трифторуксусная кислота.П р и м е р 1, и-С 1 ц-С 1 у в Агав 45рЮАфНС 1 (м,в,=498,9); (м.с.ф 530,5):175 мл концентрированной уксусной кислоты и 105 мл (5,6 моль) НВг в уксусной кислоте добавляют к 35 г (0,074 моль) СЪО-Атд(МО )рНА и смесь перемешивают в течение 30 мин до получения прозрачного раствора. Затем при интенсивном перемешивании полученный раствор выливают в 2 л сухого эфира. Образующийся осадок отфильтровывают и промывают сухим эфиром, высушивают в вакууме над БаОН, Полученную бромистоводородную соль 2Н-Агд(110,) рНА растворяют в 50 мл сухого перегнанного диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре (-О С) с помощью триэтиламина до получения слегка щелочной реакции на увлажненной реакционной смесью рН-индикаторной бумаге, Обычно на нейтрализацию расходуют Е, в количестве, равном приблизительно 1,5 эквивалента НВг, Образующийся Е 1. НВг отФильтровывают. При охлаждейии к реакционной смеси добавляют 1,1 эквивалента = 0,8 моль = 26,8 г СЬо-С 1 у-ОрИР", через 30 мин добавляют еще 1/2 эквивалента = 5,2 моль Е Г 1, Смесь оставляют при комнатной температуре на ночь, Затем упаривают в вакууме, полученное масло растирают в водном растворе 27-ного ЯаНСО.1, затем растворяют в горячем метаноле и кристаллизуют при перемешивании и охлаждении, Образующиеся кристаллы отфильтровывают и промывают холодным метанолом. Хроматография в тонком слое показывает наличие лишь незначительного количества примесей, продукт перекристаллизовывают из того же растворителя, Получают белые кристаллы, представляющие собой согласно результатам тонкослойной хроматографии чистый продукт. Выход: 34 г (867,) ( С,); КЕ=0,20 (Р ); СсФ. -35,4 (С. 0,3 Метанол);1 ЬСЬо-р-( 1 цОН (м.в.=263,3)56,3 г (0,20 моль) СЬо-С 1 ц-ОН растворяют в 400 мл этилацетата, добавляют 49,4 г (0,24 моль) дициклогексилкарбодиимида, растворенные в 60 мл этилацетата, и перемешивают при охлаждении на ледяной бане, Через 2 ч образующуюся дпциклогексилмочевину отфильтровывают и оставшийся раствор упаривают досуха. Продукт (ангидрид СЬо-С 1 ц) кристаллизуют из этилацетата и петролейного эфира. Ангидрид растворяют в смеси 120 мл диоксана и 260 мл эфира, а затем добавляют 48 мл дициклсгексиламина ЯСНА), растворенные в эфире до объема 100 и . Через некоторсе время выпадает в осадок СЬо-рц ДСНА. Смесь перемешивают приблизительно в течение часа, а затем образующуюся дициклогексиламмониевую соль отфильтровь,вают и промывают эфиром и этилацетатом, дициклогексиламмониевую соль суспендируют в эгилацетате и взбалтывают с 5 г (О,8 моль) КНКО. растворенным в воде, образующийся в результате этого СЬо-рцОН переходит в этилацетатную фазу. Зтилацетатную фазу промывают 10%-ным БаС 1 в воде и сушат над Ба ЯО . На этой стадии существует опасность выпадения продукта в,осадок. Этилацетатную фазу упаривают до небольшого объема и продукт осаждают петролейным эфиром, в результате образуются 10 тяжелые кристаллы 1 Ь , по данным ТСХ представляющие собой чистый продукт.Выход: 36,9 г (80%) 1 Ь; БЕ=0,45(А); сс.3 - 30,3(С. 1,О Метанол)1 151 ЬСЬо - р-С 1 ц - С 1 у-Агд (ИО ) рНА(м.в. 641,6).10,25 г (18,3 ммоль) Ну-Агя МО /рМА НВг, полученного снятием защитных групп с СЬоу-Аг 8 002)РИа 20 с помощью НВг согласно методу, описанному в 1 а, растворяют в 35 мл сухого диметилформамида и нейтрализуют при низкой температуре (-1 О С) с помощью Е Н до получения щелочной ре акции на увлажненной индикаторной бумаге. Образующийся ЕИНВг отфильт. - ровывают. К реакционной смеси добавляют 2,47 г (18,3 ммоль) оксибензотриазола и 5,26 г (20 ммоль) СЬо-р- Ю -61 ц-ОН (ЕЬ), а затем при низкойтемпературе добавляют 4,53 г (22 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, растворенных в небольшом количестве диметилформамида. Смесь оставляют на ночь при комнатной температуре, затем реакционный раствор упаривают и полученное масло растирают с 2% НаНСО в воде и с чистой водой. Образующееся твердое соединение растворяют в небольшом количестве ацетона, а затем дабавляют горячий метанол и небольшое количество воды, Продукт кристаллизуется при охлаждении и перемешивании, и образующиеся кристаллы отфильтровывают. Образующийся 1 Ь представляет собой согласно результатам хроматографии в тонком слое чистый продукт. После тщательного высушивания в вакууме получают 8,90 г (76%) 1 Ь.Н,=0,06 (Н,); с)- 21,5(С.0,8 диметилформамид),1,08 г (1,25 ммоль) 1 Ь освобождают от защитных групп (деблокируют) с помощью 30 мл фтористоводородной кислоты при ОС в течение часа в присутствии 0,6 мл анизола.После упаривания в вакууме продукт растворяют приблизительно в 30 мл 2%-ной уксусной кислоты и промывают небольшим количеством эфира. Водную фазу хроматографируют на колонке с Сафадексом С(Фармация Файн Кемикалз) в 2%-ной уксусной кислоте с той же средой для элюирования. Фракцию с чистым ацетатом 1 лиофилизируют и пропускают через колонку с ионообменной смолой Ц АЕ(Фармация Файн Кемикалз) в хлоридной форме в смеси этанол:вода (1:1), и той же средой для элюирования. Фракцию с чистым Гидрохлоридом 1 лиофилизируют.Высод 485 мл (78%) 1.Хроматография в тонком слое М =0,29 (А показывает только одно пятнос 1.)- 54,1 (С. 1,О, 50%-ная уксусная кислота/вода).П р и м е р ы 11-Х 111, описанные в табл. 1, осуществляют способом по примеру 1, физические константы, выходы указаны в табл. 1, условия проведения реакции сочетания и методы очистки указаны в табл. 2.1-21,5 0 МР 38 1 ЧЬ СЬо сС 1 ц-А 1 а-Аг 8-рИА О, 25 Р-55, 7 50%-ная НОАС 72- 25,4 957 - ный Ес ОН 85+Н О НВг/НОАС, ЯАЕ 25 507.-ныйЕВОН Проведены испытания трипептидов общей формулы (1), полученных предлагаемым способом и определение протеаэ с помощью субстратов с группа ми, подверженными отщеплению и определению физико-химическими методами.Субстраты, полученные. согласно приведенным примерам, могут быть использованы для определения различных 50 энзимов следующим образом.В основе определения лежит тот факт, что продукт расщепления, образующийся в результате энзиматического гидролиза, имеет Уф-спектр, по 55 существу отличный от УФ-спектра су"-. - страта, Таким образом, все и-нитроанилидные субстраты по изобретению, например, характеризуются максимумом ОрБР, крист, МеОН+Н 0 НОВТ, Е)СС 1, крист. МеОН++Н О2 НВг/НОАС, ЯАЕ50%-ныйЕгОН ОрМР, крист. МеОН+Н О НОВТ, 1)СС 1, крист. ацетон+МеОН НЬг/НОАС, ЯАЕ, 507.-ныйЕВОН ОрМР, МеОН+Н ОНОВТ, 1)СС 1, ацетон+МеОН ОрИР, этилацетат+эфир НОВТ, 1)СС 1 1)МР+этилаце- тат поглощения при 310 нм с молярным коэффициентом экстинкции примерно12000, При ч 05 нм поглощение этихсубстратов почти полностью исчезает,п-Нитроанилид, который высвобождается из субстратов при энзиматическомгидролизе, имеет максимум поглощенияпри 380 нм и молярный коэффициентэкстинкции 13200, который при ч 05 нмснижается только до 9 б 20. Поэтомус помощью снятия спектрофотометрических данных при 406 нм легко следить за количеством образующегосяп-нитроанилида, которое пропорционально скорости энзиматического гидролиза, которая, в свою очередь, определяется количеством активногоэнзима,11 277904 2В табл. 3 представлены значения каждого энзима скорость реакции вэяскоростей реакций синтетических суб- та относительно субстрата сравнения стратов с различными энэимами, Для (скорость реакции = 1). Таблица 3 Субстрат сравнения (=1007) Энэимы ТА Рха Тгу ЯБЯ100 100 1 О 330 100 360 140 3 О 1 и-С 1 ц С 1 у Ага рНА ЕЕ и-С 1 ц Бег Ага рЯА 65 130 150 Ч и-С 1 ц А 1 а Ага рИА 10 15 250 50 310 ЧЕ и-С 1 ц Рго Агя рЮА ЧЕЕп С 1 ц РЬе Ага рМА Х и С 1 ц РЬе Ьуя рЧА ХЕ и С 1 ц Ьец Ьуя рЯА 40 440 240 10 10 40 450 0 0 10 60 230 0 0 120 ХЕЕ руго С 1 ц-С 1 у-Ага рИА 15 340 260 П р и м е ч а н и е : ЯН-ВЧа 1-Ьец-Ьуя рНА;БВк РЬе-Ча 1-Агя-рНА;БВЕ 1 е-С 1 ц-С 1 у-Ага рМА;р 11 плазмин, Тгу трипсин, Рха - фактор коагуляции,1 Ж - урокиназа, ТА плазминогенный тканевый активатор.1Чувствительность субстрата срав- вестные, и могут бытьиспользованынения к исследуемому"энзиму приведе- , в качестве реагентов при определе 35на в табл. 4, нии сериновых и БН протеаз. Таблица 4 Формула изобретения Субстрат Энзим Активность ( ьО д/мин) достигаемая с 4 10 моль/л энзима Способ получения трипептидов общей формулы 1и-С 1 ц-А -А -ИН-К1где А - А 1 а, С 1 у, Ча 1, Ьец, Бег,ТЬг, Рго, РЬе, Е 1 е, Р 1 р,Туг;А - Ага, Ьуя;К - п-нитроанилид,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтопроизводное аминокислоты формулы 11А ННКгде Аи К имеют указанные значения,подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем группу К используют в качестве защитной дляС-концевой карбоксильной группы первой аминокислоты. ЯББО, 040 0,150 0,200 0,040 Плазмин Трипсин Гха 50 УрокиназаТканевыйактиватор 1 0,040 55 Как видно из приведенных таблиц, предлагаемые субстраты гидролизуются различными энэимами быстрее, чем из