Способ получения эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5 gcatg c

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ - GCATG - C, включающий культивирование продуцирующего микроорганизма на питательной среде, содержащей источник азота, углерода, минеральные соли и воду, в условиях аэрации с последующим выделением из биомассы целевого продукта, отличающийся тем, что с целью повышения выхода биомассы продуцента и активности эндонуклеазы рестрикции Рае 1, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Pseudomonas aeruginosa BU 278.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в научно-исследовательской практике.
Цель изобретения - повышение выхода биомассы и активности эндонуклеазы рестрикции Pae I.
Способ заключается в том, что получаемый фермент-рестриктирующая эндонуклеаза Pae I (рабочее назначение Pae 278) - изошизомер Sph' - узнает ДНК участок S' - GCATG'C и расщепляет ДНК фага лямбда в шести участках, SV 40 - в двух, аденовируса 2 - в девяти, pBR 322 - в одном. Ценным для вирусологических лабораторий является то, что Pae I расщепляет ДНК SV 40 в двух участках повтора района репликатота, нарушая репликативные свойства генома вируса. Наиболее распространенный в генной инженерии вектор клонирования pBR 322 имеет один участок расщепления ферментом Pae I - в гене, ответственном за устойчивость к тетрациклину. Таким образом, клонирование ДНК в данном участке при помощи Pae I существенно облегчается удобством отбора рекомбинатов по фенотипу Тс^s (чувствительность к тетрациклину). Удобство использования данного фермента в генной инженерии состоит и в том, что в результате расщепления ДНК образуются "липкие концы", значительно облегчающие конструирование рекомбинантныхх ДНК.
Поиск штамма-продуцента проводят при помощи разработанного экспресс-метода определения активности в толуольных лизатах бактериальных клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщепления ДНК.
Штамм Pseudomonas aeruginosa BU 278 получен из Чехословацкой коллекции культур микроорганизмов ССМ 1961-АТСС 9027-NCIB 8626-BU 278-RH 813-JEMP_s 37/65.
Штамм депонирован в ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича под номером 123.
Характеристика штамма.
М о р ф о л о г и я к л е т о к. Палочки расположены поодиночке парами и короткими цепочками. Подвижны. Грамотрицательны.
Р о с т н а т в е р д ы х и ж и д к и х п и т а т е л ь н ы х с р е д а х. На скошенном агаре рост по штриху обильный, нежный блестящий, приобретает зеленоватый оттенок.
Колонии на чашке Петри с агаром расплывчатые, сероватые, с темным центром и просвечивающим краем. Среда приобретает зеленоватый цвет.
На мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера заметное помутнение, толстая пленка, осадок. Среда становится желтовато-зеленой.
Ф е р м е н т а ц и я у г л е в о д о в. Глюкозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, маннит культура не ферментирует.
И н д о л и с е р о в о д о р о д. Не образует.
Уреаза +; оксидаза +; утилизирует цитрат.
Нитраты редуцируются в нитриты.
Желатина уколом. Разжижение.
Ч у в с т в и т е л ь н о с т ь к а н т и б и о т и к а м. Штамм обладает множественной резистентностью к антибиотикам. Резистентен к пенициллину, ампициллину, стрептомицину, канамицину, хлорамфениколу, биомицину, бацитрацину, колхицину, метициллину, эритромицину, линкомицину и др.
Чувствителен к гентамицину, митомицину С.
Б а к т е р и о ц и н о г е н н о с т ь. Культура небактериоциногенна.
О п т и м а л ь н ы е у с л о в и я в ы р а щ и в а н и я и х р а н е н и я (среда, рН, температура, срок пересева).
Культура хорошо растет на твердых и жидких питательных полноценных средах: мясо-пептонном агаре, мясо-пептонном бульоне, бульоне Хоттингера, среде LB. Оптимум роста на среде 37^оС.
Хорошо растет при 25, 30^оС. Оптимум роста при 37^оС.
Зона рН роста культуры лежит в пределах рН от 6,5 до 9,5. Оптимум роста культуры и образования фермента при рН среды 8,5.
При рН 10,0 культура не растет.
Рабочую культуру пересевают один раз в неделю на МПБ или МПА скошенный. Хранят культуру в лиофилизированном состоянии в ампуле.
Культура типичная для Pseudomonas aeruginosa.
Наибольший выход биомассы, содержащей эндонуклеазу рестрикции Pae I, получают в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде, которая содержит, г: Бульон 200-250 мл Пептон 10-12 NaCl 4,5-5,5 Вода До 1 л
Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках.
П р и м е р 1. Культуру Pseudomonas aeruginosa штамм BU 278 предварительно адаптируют на основной питательной среде, содержащий в 1 л, г: Бульон 250 мл Пептон 10 NaCl 5 Глюкоза 5 при 37^оС в течение ночи. Инокулят для фермента готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1: 10, и размножают в условиях аэрации.
Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1: 10 к объему среды при 37^оС в условиях аэрации (2 л воздуха на 1 л питательной среды). рН среды 7,4.
Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,6-7,8.
Выращивание продолжают до фазы замедления роста.
Выход биомассы 6 г/л культуральной жидкости.
Содержание рестриктазы Pae I 1200 ед/г биомассы.
Определение активности фермента проводят экспресс-методом в толуольных лизатах бактериальных клеток с последующими электрофорезом с агарозном геле продуктов расщепления ДНК.
В ы д е л е н и е э н д о н у к л е а з ы р е с т р и к ц и и P a e I.
1 г биомассы Pseudomonas aeruginosa Bu 278 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2 - 4^оС. После удаления остатков клеточной оболочки и неразрушенных клеток фермент фракционируют 1% -ным полиэтиленимином. Обогащенный рестриктазой экстракт хроматографируют в калийфосфатном буфере, в градиенте KCl на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52), затем на колонке с голубой сефарозой (фирмы Фармация).
Получают 10,5 ^. 10³ ед. фермента в 5,0 мл глицеринового буфера. Препарат фермента стабильно сохраняет активность в течение 8 мес. Фермент пригоден для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.
П р и м е р 2. Культивирование штамма Pseudomonas aeruginosa BU 278 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, которая содержит в 1 л, г: Триптон 10 Дрожжевой экстракт 5 NaCl 10
Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости.
После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Pae I 1000 ед. /г биомассы.
Таким образом, по предлагаемому способу получают эндонуклеазу рестрикции Pae I.
Поиск новой рестриктазы проводится путем скрининга у 40 штаммов различных видов бактерии (Pseudomonas, Escherichia, Proteus и т. д. ).
Биомасса штамма Pseudomonas aeruginosa BU 278 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Pae I, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5'-GCATG C в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы в биомассе 10000-12000 ед. на 10 г сырой биомассы.
Для изошизомера Pae I - рестриктазы Sph I выход очищенного фермента 900 ед. на 10 г сырой массы биомассы.
Выход очищенного фермента Pae I 10,5 ^. 10³ ед. активности на 10 г сырой биомассы, что более чем в 10 раз превышает значение, указанные для Sph I (900 ед. ). (56) Fuchs L. Y. et al, Characterisation of a sitespecific restriction endonuclease Sph I from Streptomyces Sphacochromogenes. Gene, 10, 39-46, 1980.