Способ получения кднк-клонов, кодирующих человеческий эритропоэтин

.801672 Я 15/1 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН К ПАТЕНТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Дженетикс Институт, Инк, (ЦБ) (72) Эдвард Фритч (И), Родни М,Хьювик (СВ) и Кеннет Джекобс (18) (53) 575.224.2:577.2(048)(088,8) (56) Ргос. Маг 1. Асад, Бсд, 1 БА, 1984, ч, 81, р. 2708-2712 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ кДН-КЛОНОВ, КОДИРУЮЩИХ ЧЕЛОВЕЧЕСИ ЭРИТРОПОЭТН (57) Изобретение касается клонированных генов для человеческого эритроИзобретение касается клонированных генов для человеческого эритропоэтина, которые обеспечивают высокиеуровни экспрессии указанных генов иполучение дп чегго активного человеческого эритропоэтина (ЭПО),Целью изобретения является повышение точности способа и повышение выхода эритропоэтина при экспрессии вживотных клетках.Способ заключается в том, чтоосуществляют отбор клонов в результате гибридизации 3 кДНК-библиотеки фага мРНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондами, которые получаютпутем выделения и очистки эритропоэтина иэ мочи людей, страдающих апластической анеюей с последующиманализом аминокислотных последовательностей трипсиновых фрагментов,поэтика, которые обеспечивают высокиеуровни экспрессии укаэанных генов иполучения дп чегго активного человеческого эритропоэтина (ЭПО), Цельюизобретения является повышение точности способа и повышение выхода эритропоэтина. Способ получения клоновпредлагает отбор клонов в результатегибридизации ЪкДНК - библиотеки фагамРНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондами, которые получаютпутем выделения и очистки эритропоэтина из мочи людей, страдающих апластичеСкой анемией, с последующим анализом аминокислотных последовательностей трипсиновых фрагментов. П р и м е р 1. Выделение геномного клона ЭПО.ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих анемией, известным спосо бом за исключением того, что фенольную обработку заменяют термообработокой при 80 С в течение 5 мин для инактивации нейраминидазы. Конечной стадией очистки является фракционирование на колонке высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием 0-952 ацетонитрильного градиента с 0,13-ной трифторуксусной кислотой (ТФК) в течение 100 мин, По ложение ЭПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом Х- концевой последовательности основных пиков. ЭПО элюируют при 532 ацетонит рила и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращен 1672930ной фазой, Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл, доводят до рН 7,0 бикарбонатом аммония, переваривают 27-ным ТРСК-обработанным трипо5 сином в течение 18 ч при 37 С, затем подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой. Записывают оптическую плотность при 280 и 214 нм. Разделенные пики выпаривают почти досуха и подвергают не О посредственно анализу И-концевой аминокислотной последовательности, используя газофазный секвениатор. Два фрагмента иэ трипсинового гидролизата отбирают для синтеза олигонуклеотид ных зондов. Иэ последовательности Ча 1-Азп-РЬе-Туг-А 1 а-Тгр-Ьуз (аминокислоты 46-52) получают 17-мер А А АТТССАНСССТАСААСТТ 20 и 18-мер А А А ССАЮСССТАСТАС СААСТТИАС25Иэ последовательности Ча 1-Туг-Бег-Азп-РЬе-Ьеи-Агя (аминокислоты 144- 150) получают два пула 14-меров ПСЫ Т Т ПСЫ ТТАСАСТААСТТССТ и ТАСАССТААСТТСТТ 30 которые отличаются в первом положении лейцинового клона,Олигонуклеотиды 5 -конец метят по)ЧР, Йспользуя полинуклеотидную киназу и гамма Р-АТР. Геномную кДНКбиблиотеку человека, клонированнуюв А бактериофаге, подвергают скринингу. Приблизительно 3,5 х 10 фага вы 5севают с плотностью 6000 фага на40150 мм чашку Петри (среды ИЕСУМ) иоинкубируют при 37 С до тех пор, покапятна не станут видимыми (размеромоколо 0,5 мм). После охлаждения при4 С в течение 1 ч реплики пятен переюносят на нейлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 37 С начашках со свежими средами. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют. После вакуумной сушки при 80 С в течение 2 ч фильтры промывают в 5 х ББС,0,5 Х БОЯ в течение 1 ч и клеточныеостатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухойтканью. Это соскабливание снижаетфоновое связывание зонда с фильтрами.55Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют 4-8 ч при48 С в 3 М растворе тетраметиламмонийхпорида, 10 мМ МаРЛ 4., рН 6,8, 5 хМ раствор Денхарда, 0,52 505 и 10 мМЭДТА, 17-мер, меченный Р, прибавляютв концентрации О, 1 пмоль/мл и гибридизируют при 48 С в течение 72 ч, После гибридизации фильтры промывают2 х ЯБС, 0,3 М МаС 1, 0,03 М цитратнатрия, рН 7,0 при комнатной температуре, затем в течение 1 ч в ЗМТМАС 1-10 мМ ИаРО 4, рН 6,8 при комнатной температуре и 5-15 мин при температуре гибридизации, Приблизительно 120 сильных сигналов обнаруживаютпосле 2-дневной авторадиографии. Этиклоны группируют в пулы по 8, пересеивают и вновь подвергают скринингув трипликате,П р и м е р 2, Анализ мРНК человеческой фетальной печени,ФПо 5 мкг мРНК человеческой фетальной печени и мРНК печени взрослогоподвергают злектрофорезу в 0,87-номагарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу. Однонитевый зонд затем получают иэ матрицыМ 13. Праймером является 20-мер, происходящий иэ того же триптического фрагмента, что и первоначальный 17-мерзонд. Зонд получают известным способом, однако вслед за отщеплениемБша 1 (который продуцирует желательныйзонд длиной 95 п,о., содержащий74 п.о. кодирующей последовательности) малый фрагмент очищают от матрицы М 13 хроматографией на колонке с сефазорой С 14 В, Фильтр гибридизируютприблизительно до 5 х 1 О отсчетов в1 мин этого зонда в течение 12 ч при68 С, промывают в двух ББС при 68 фС иподвергают воздействию в течение6 дней усиливающего экрана. Фиксируютоднонитевую маркерную мРНК иэ 1200 п.о,П р и м е р 3. кДНК фетальной печени.Идентичный зонд получают и используют для скрининга библиотеки кДНКфетальной печени, полученной в векторе-СЬ 2 1 А, используя стандартныеметодики скрининга. Три самостоятельных положительных клона Д-НЕРОР Ь 6(700 п.о.), "НЕРОГ Ь 13 (1400 п.о,выделяют путем скрининга 1 х 10 пятен,Полную вставку ф-НЕРОР Ь 13 и 9-НЕРОРЬ 6 секвенируют вслед за субклонированием в М 13. А-НЕРОР Ь 8 секвенируюттолько часть, а оставшуюся подразумевают идентичной другим клонам,16729кДНК-клоны 7-НЕРОР Ь 6, ф-НЕРОР8 и Ъ-НЕРОР Ь 13 депонированы в коллекции Ащегсап Туре Сц 1 цге Со 11 есд оп, Кос 1 ч 11 е, Магу 1 апд, под номерамиАТСС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153соответственно.Геномные клоны 7-НЕРО 1, Ъ-НЕР 02,Ъ-НЕРОЗ и %-НЕРО 6 депонированы и доступны из Ашег 1 сап Туре Сц 1 гцге Со 1- 1 О1 есгдоп, Кос 1 счд 11 е, Магу 1 апс 1, подвходящими номерами АТСС 40154, АТСС40155, АТСС 40150 и АТСС 40151 соответственно,П р и м е р 4. Конструирование век тора р 91023(В),Вектором трансформации являетсярАйР 26 БЧрА (3). Он содержит кДНКген дигидрофолятредуктаэы мьппи (РРНР),который находится под транскрипциональным контролем основного позднегопромотора аденовируса 2 (Ад 2). 5сайт сращивания указан в аденовирусной ДНК, а 3-сайт сращивания, происходящий от гена иммуноглобулина, присутствует между основным позднимпромотором аденовируса 2 и РРНГ-кодирующей последовательностью. Раннийсайт полиаденилирования БЧ 40 присутствует по направлению ниже от РРНР- ЗОкодирующей последовательности. Участок прокариотического происхождениярАдР 26 БЧрА исходит из рБЧОд (Се 11,1981, 27, 279) и не содержит последовательности рВК 322, 35рАДР 26 БЧрА (3) превращают в плаэмиду рСЧБЧ 12, райР 26 УБрА (3) превращают н плазмиду рАИР 26 5 ЧрА (3)(4) дележей одного иэ двух сайтовРяг н плазмиде РАЙР 26 БЧрА (3), Это 40осуществляют путем частичного переваривания рестриктазой Ряг. 1 так,что получают субпопуляцию линеаризованных плазмид, в которой толькоодин сайт Ряг. 1 расщеплен. Затем обрабатывают ферментом Кленова, сшивают, скринируют для делеции сайтаРяг 1, расположенного 3 к полиадениляционной последовательности БЧ 40,50рАсИ) 26 БЧрА (3) (д) расщепляютРчц 11. Затем р 1 АИ 43 (Се 11, 1979,16, 851) переваривают ХЬо 1, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают Рчц 11, и фрагмент из 140 п.о.выделяют электрофорезом в 67-ном55акриламидном геле, Этот фрагмент140 п.о, сшивают с Рчц 11 - переваренной плазмидой рАЙР 26 БЧрА (3) (с 1). 306Смесью трансформируют Е. со 11, отбирают по устойчивости к тетрациклинуи колонии подвергают скринингу с использованием зонда, меченного по Р,ЭЯгибридиэирующегося с фрагментом иэ140 п.о, ДНК выделяют из положительно гибридизирующихся колоний и анализируют для отбора правильной ориентации сайта Рчц 11 - на 5 -стороне1вставки 140 п.о, Эта плаэмида обозначена рТР ЬФрагмент Ача 11 Р вируса БЧ 40,содержащего последовательность энхансера 5 Ч 40, получают путем гидролиэаДНК 5 Ч 40 рестриктаэой Ача 11, эатупления концов фрагментом Кленова, сшивания ХЬо 1-линкеров с фрагментами,переваривания ХЬо 1 для открываниясайта ХЬо 1 и выделения наибольшегофрагмента (Р) посредством электрофореза в геле. Этот фрагмент затем сшивают с рТРЬ по сайту ХЬо 1, получаяплазмиду рС 5 УЬ 2-ТРЬ. Ориентацияфрагмента Ряч 40 и рСУБ УЬ 2-ТРЬ такона, что поздний промотор вирусаБЧ 40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотораденовируса.Для введения генов, связанных саденонирусом (генов ЧА), в рСУ 5 гЬ2-ТРЬ, вначале конструируют плазмидурВК 322, которая содержит фрагментВ НдМ 111 аденовируса типа 2, ДНКаденовируса типа 2 перевариваютНпд 111 и фрагмент В выделяют электрофорезом в геле. Этот фрагментвставляют в плаэмиду рВК 322, которуюпредварительно расщепляют рестриктазой Нпд 111, После трансформацииЕ. со 11 отбирают рекомбинанты совставкой фрагмента В Ндпд,111, и вставленную ориентацию определяют путемпереваривания рестрикционным ферментом, рВК 322 - Нпд 111 В содержитфрагмент В Н 1 пд 111 аденовируса типа2 в ориентации,Гены ЧА получают иэ плазмиды рВК 322 - Ай Ндпд 111 В путем переваривания Нра 1, добавления линкеров ЕсоК 1 и расщепления рестриктазой ЕсоК 1 с последующим восстановлением фрагмента 1,4 кб. Фрагмент, имеющий липкие концы ЕсоК 1, затем встраивают по ЕсоК 1 в РТЬ. После трансформации НВ 101 Е. со 11 и отбора по устойчивости к тетрациклину колонии подвергают скринингу посредством гибри 1672930дизации с ДНК, специфичной к гену ЧА. ДНК получают иэ положительно гибридиэирующих клонов и охарактеризовывают перевариванием рестрикционной зндону 5 клеазой. Полученную ппазмиду обозначают р 91023.Два сайта ЕсоК 1 в плаэмиде р 91023 отщепляют путем разрезания Р 91023 ре" стриктазой ЕсоК 1 до двух ДНК-фраг- О ментов: 7 т.п,о. и 1,3 т,п,о. Последний фрагмент содержит гены ЧА, Концы обоих фрагментов застраивают с использованием фрагмента Кленова Ро 1 1 и два фрагмента затем сшивают. Плазми да Р 91023(А). содерлп 1 т гены ЧА и является аналогичной плаэмиде р 91023, беэ ЕсоК 1 - ЕсоК 1 фрагмента. Один Рэг 1-сайт в плазмиде р 91023(А) отщепляют и заменяют на ЕсоК 1-сайт. р 91023(А) разрезают до готовности при помощи Рэй 1 и обрабатывают фрагментом Кленова Ро 1 1 для генерации прорастающих концов. ЕсоК 1-25 линкеры сшивают с тупоконечным сайтои Рзс 1 плазмиды р 91023(А). Линейную плазмиду р 91023(А) с ЕсоК 1-линкерами, присоединенньачи по затупленному сайту РзС 1, пеРеваРивают до готовности ЕсоК 1, после чего повторно сшивают, Плазмиду Р 91023(В) восстанавливают и идентифицируют как структуру, аналогичную плаэмиде Р 91023(А), но вместо прежнего сайта35 Рзг. 1 содержащую сайт ЕсоК 1. Плазмида р 91023(В) депонирована в коллек" ции Авегсап Туре Сц 1 гцге Со 11 есгоп, КосМд 11 е, Магу 1 апд, под входящим номером АТСС 39754.40П р и м е р 5. кДНК-клоны (Ъ-ЕРОГ Ь 6 и 3 -ЕРОГ Ь 13 по примеру 3) встраивают в плаэмиду р 91023(В), образуя рРТГ Ь 6 и РРТГ Ь 13 соответственно. 8 мкг каждой из очищенных ДНК используют для трансфекции 5 л 10 клеток СОБ, используя РЕАЕ-декстранметод. Через 12 ч клетки промываюти обрабатывают хлорохинои (0,1 иМ) в течение 2 ч промывают вновь и вы 950 держивают в течение 24 ч в 10 мп сред, содержащих 1 ОХ-ную фетальную телячью сыворотку. Среду меняют на 4 мп среды, свободной от сыворотки, и собирают через 48 ч.Получение иммунологически активно 55 го ЭПО определяют количественно радиоимиунным аналиэои. Чувствительность пробы составляет 1 нг/мл. Уровень ЭПО, высвобожденного в средуштаммом, содержащим рРТГ Ь 13, составляет 330 нг/мл,рРТГ Ь 13 депонирована в коллекции Ашегхсап Туре Сц 1 гцге Со 11 есг.акоп,КосКчх 11 е, Магу 1 апд, под входящим номером АТСС 39990,П р и и е р 6. кДНК ЭПО ф-НЕРОГ1 13) вставляют в плазмиду р 91023(В),трансфекцируют в клетки СОБи собирают аналогично примеру 5, эа исключением того, что обработку хлорохинои не проводят.Биологически активный п чегго ЭПОизмеряют с использованием либо колониеобраэующей пробы с клетками фетальной печени мыши в качестве источникаСГЧ-Е, либо пробы поглощения .Н-тиЭмидином, используя клетки.селезенкимышей, иньецированных фенилгидразином,Чувствительности этих анализов составляют 25 мЕд/мл. Биологически активный1 п чиччо ЭПО измеряют с использованиемлибо метода гипоксической мыши, либометода "голодающей крысы". Чувствительность этих анализов составляет100 мЕд/мл. ЭПО из клеток СОБ, трансфекцированных кДНК-клона ЕРОГ Ь 13 тип 1:Проба АктивностьК 1 А 100 нг/мл5СГ 0-Е 2 0 5 Ед/млУН-ТЬу 3,1 1,8 Ед/млГипоксическаямышь 1 Ед/млГолодающая крыса 2 Ед/мпП р и м е р 7, ЭПО из клеток СОБ,180 нг ЭПО, высвобожденного в среду трансфекцированными кДНК-ЭПО Щ-НЕРОГ Ь 13) (выше), подвергают электрофорезу в 107-ном БОБ полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр, зондируют анти- телом анти-ЭПО, промывают и повторно зондируют1 белком А, фильтр авторадиографируют в течение двух дней. Нативный гомогенный ЭПО, описанный в примере 1, подвергают электрофорезу перед или после йодирования. Используеиые маркеры включают метионин,меченный,Б, сывороточный альбумин (68000 Д) и яичный альбумин (45000 Д).П р и и е р 8, КонструированиеКК 1-4.Выделяют фрагмент Ваш Н 1-Рчц 11 иэ плаэмиды РБЧ 20 НГК, содержащий ранний промотор БЧ 40, смежный с геном дигидрофолятредуктаэы мьппи (АНУК), энхансер БЧ 40,малый антигенный интрони последовательность полиаденилирования БЧ 40 (фрагмент А), Остальные фрагменты получают иэ вектора р 91023(А) (выше) следующим образом: р 91023(А) переваривают Ряг 1 в единственном сайте Ряг 1 около промотора аденовируса и либо сшивают с синтетическими конвертерами Ряг 1-ЕсоК 1 и рециркулиэуют (создавая сайты Ряг 1- ЕсоК 1-Ряг 1 в первоначальном сайте Ряг 1; 91023(В, либо обрабатывают большим фрагментом ДНК-полимераэы 1 для разрушения сайтов Ряс 1 и сшивают с синтетическим ЕсоК 1-линкером 20 и рециркулиэуют (соэдавая ЕсоК 1- сайт в первоначальном сайте Ряг 1, 91023(В. Каждую из двух полученных плазмид 91023(В) и 91023(В ) переваривают ХЬа и ЕсоК 1 для получе ния двух фрагментов (Г и С). Путем соединения фрагмента С иэ плазмиды р 91023(В) и фрагмента Г из плаэмиды р 91023(В ), а также фрагмента С из плазмиды р 9 1023(В) и фрагмента Р 30 иэ плаэмиды р 91023(В) создают две новые плаэмиды,которые содержат либо сайт ЕсоК 1-РяГ 1, либо сайт РяГ 1-ЕсоК 1, где РяГ 1-сайт наиболее близок к основному позднему промотору аденовируса (р 91023(С1Вектор р 91023(С) ) гидролизуют ХЬо 1, липкие концы эатупляют с помощью ДНК- полимеразы 1, пришивают фрагмент НЫд Ц 1-ЕсоК 1 размером 340 п,о содержащий энхансер БЧ 40. Вектор с 1 ас получают перевариванием ДНК с 1 ас рестриктазой Ваш Н 1, заполнением липкого конца фрагментом ДНК-полиме 45 разы 1 и перевариванием рестриктаэой Нпй 1 П, Полученную плазмиду (сБЧНР 1 ас) регенерируют по Ваш Н 1- сайту путем сшивания с тупым концом Рчц 11. Фрагмент ЕсоК 1-Н 1 пд 111 получают из БЧНР 1 ас и пришивают к фрагмен 50 ту ЕсоК 1-Ндпд 111 РБЧОй, который содержит плазмидную основу репликации, и отбирают плаэмиду рБЧНРОЙ. Затем получают фрагмент ЕсоК 1-Ндпд 111 из 340 п.о. плазмиды РБЧНРОЫ, эатупляют с обоих концов ДНК-полимеразой 1 и сшивают с описанным ХЬо 1-переваренным, тупоконечным вектором р 91023(С). Полученную плаэмиду, вкоторой ориентация фрагмента Нпд 111 ЕсоК 1 такова, что Ваш Н 1-сайт внутри фрагмента является близлежащим кгену ЧА, называют рЕБ 105, ПлазмидурЕБ 105 переваривают Ваш Н 1 и Рчц 11,а также отдельно Рчц 11, и выделяютфрагмент Ваш Н 1-Рчц 11, содержащийосновной поздний промотор аденовируса (фрагмент В), и фрагмент Рчц 11,содержащий ген устойчивости к тетрациклину, а также другие последовательности (фрагмент С). Фрагменты А, Ви С сшивают и полученную плаэмидувыделяют и обозначают КК 1-4. Плазмида РК 1-4 депонирована в коллекцииАшегдсао Туре Сц 1 Сцге Со 11 есгоп,КосЕч 11 е, Магу 1 апд, под входящимномером АТСС 39940,П р и и е р 9. Экспрессия ЭПО в клетках СНО (метод 1).20 мкг ДНК иэ плазмиды рРТГ Ь 13, описанной по примеру 5, расщепляют эндонуклеаэой С 1 а 1 плаэмиды и сшивают с С 1 а 1 фрагментом ДНК плазмиды рАЙО 26 БЧр(А)1 (2 мкг), которая содержит интактный ген дигидрофоля-, тредуктазы (РНГК), приводимый в действие основным поздним промотором аденовируса. Эту ДНК используют для трансфекции ПНРК - отрицательных клеток СНО и после двухдневного выращивания отбирают на альфа-средах, не имеющих нуклеотиды, и пополняют 107.-ной диализованной фетальной бычьей сывороткой. Вслед эа ростом в течение двух недель в избирательных средах колонии извлекают, объединяют по группам из 10-100 колоний на пул, повторно высевают и выращивают до слияния в альфа-средах, не имеющих нуклеотиды. Отстоявшиеся среды нэ пулов, выращенных до метотрексатной селекции, анализируют ЭПО посредством радиоиммуноанализа (К 1 А) . Пулы, которые показывают наличие ЭПО, выращивают в присутствии метотрексата (МТХ) (0,02 мкМ), субклонируют и анализируют. С 1 а 44,02-7 пул высвобождает 460 нг/мл ЭПО в среду. Эта клеточная линия выбрана для получения ЭПО и депонирована в коллекции Ашегдсап Туре Сц 1 гцге Со 11 есгдоп под номером АТСС СК 1.1 8695. Этот клон подвергают поэтапномуотбору при возрастающих концентраци 1672930 1230 ях,1 л и обнаруживают даже более высокие уровни синтеза ЭПО,На каждом этапе ЭПО измеряют внадосадочном слое культуры посредст 5вом К 1 А и биологической активностидп чегго. Уровни используемого метотрексата составляют 0,02, 0,1 и0,5 мкМ, после первого цикла селекции при 0,02 мкМ МТХ в культуральныесреды высвобождаются значительныеуровни ЭПО.П р и м е р 10, Экспрессия ЭПО вклетках СНО.ДНК клона Ъ-НЕРОР 1, 13 переваривают ЕсоК 1, и малый фрагмент К 1,содержащий ген ЭПО, кЛонируют в ЕсоК 1 сайт плазмиды К К 1-4 (пример 9)ЭтуДНК затем используют для трансфекции ОНРК - отрицательных клеток СНОпрямо (беэ переваривания), селекциюи амплификацию осуществляют, какописано,ДНК РКР 1, 13 также встраивают вклетки СНО путем слияния протопластов и микроинъекции, Плаэмида РКР13 депонирована в коллекции Ашегдсап Туре Сц 1 гцге Со 11 есс 1 оп, Кос 1 сч 111 е,Магу 1 апд под номером АТСС39989.П р и м е р 11Экспрессия клонаЭПО в клетках СОБ,ДНК плазмиды рБЧО 1) перевариваютрестриктазой Ндпд 111 и эатупляютДНК-полимеразой 1. ДНК клона ЭПО,-НЕРОР, переваривают до готовностиЕсоК 1 и НЫд 111 и фрагмент размером 4,0 т,п.о., содержащий ген ЭПО,выделяют и затупляют, как описано.Фрагмент гена ЭПО вставляют в плазмидный фрагмент рБЧОЙ. ПлазмидаС 2 2-1 имеет ген ЭПО в ориентации а(т.е. с 5-концом ЭПО, самым ближайшим к началу БЧ 40), а плазмида СЕ1-3 находится в противоположной ориентации,Плаэмиды С 2 1-3 и СЕ 2-1 трансфекцируют в клетки СОБ 1 по примеру6, среды собирают и анализируют нам унологически реактивный ЭПО Приблизительно 31 нг/мл ЭПО обнаруженов культурах СЕ 2-1 и 16-31 нг/мп -в культурах СЕ 1-3Геномные клоны НЕР 01, НЕРО 2 иНЕРОЬ могут быть вставлены в клеткиСОБ для экспрессии аналогичным образом.П р и м е р 12, Экспрессия в клетках С 127 и ЗТЗ. При конструировании рВРУЕРО плазмиду БРЬ/5 переваривают рестриктаэойЕсоК 1 и соединяют с фрагментомЕсоК 1 (1340 п.о.) из Ъ-НЕРОР 1, 13при помощи ДНК-лигазы. Полученнуюплазмиду, в которой 5-конец генаЭПО является ближайшим к промоторуБРЬ, обозначают рЕР 049 Р. В этой ориентации сайт Вав Н 1 в полилинкере РРЬ/5 непосредственно примыкает к5 -концу гена ЭПО.Плазмиду рй ВРУ-ММТпео (342-12)переваривают Вав Н 1 для получениядвух фрагментов: большого фрагмента8,0 т,п.о., содержащего геном ВРУ,и меньшего фрагмента,6,5 т.п.о.,содержащего рИ 1. 2 начало репликациии ген ампициллин-устойчивости, металлотионеинового промотора, ген неомицин-устойчивого и сигнал полиаденилирования БЧ 40. Переваренную ДНКсшивают ДНК-лигазой и плазмиди, которые содержат только 6,8 т.п,о,фрагмент, идентифицируют перевариваниями рестрикционными эндонуклеазамиЕсоК 1 и Ваш Н 1, Плазмида обозначена рММТпеоВРУ. рЕР 049перевариваютВав Н 1 и Ве 1 11, и выделяют 700 п.о.фрагмент, содержащий целую ЭПО-кодирующую область. Вц 1 11-перевареннуюрММТЬеоВРУ и фрагмент Вав Н 1/В 81 11ЭПО (700 п.о.) сшивают, и идентифицируют гибридизацией в колониях припомощи оликонуклеотидного й(ССТСАТСТСТ-ССССТСТСС) (зонда, являющегося специфичным к гену ЭПО). Плаэмиду (рЕРО 15 а), которая имеет кДНКЭПО в ориентации так, что 5 -конец)кДНК ЭПО является близлежащим к металлотионеиновому промотору, идентифицируется путем перевариванияЕсоК 1 и Крп 1,Плаэмиду рдВРУ-ММТпео (342-12)переваривают Вав Н 1, выделяют фрагмент длиной 8,0 т.п,о., который содержит целый геном вируса бычьей папилломы, и сшивают его с Вав Н 1 фрагментом, рЕР 015 а, идентифицируют плаэмиду (рВРУ-ЭПО) гибридизацией в колониях с использованием олигонуклеотидного зонда Й (Р-ССАСАСССССТАСАСА-ОН),который является специфичным к геному ВРУ, Плазмида рйВРУ-ММТпео (342-12)депонирована в Ашегсап Туре Сц 1 гцгеСо 11 есгдоп, Кос 1 ч 111 е Магу 1 апц подномером АТСС 37224.Методы 1-111 используются для экспрессии ЭПО.Метод 1, 25 мкг ДНК рВРУ-ЭПО используют для трансфекции 1 10 клеток6С 127 СНО, используя стандартные методики. Через 5 ч после трансфекции среды удаляют, клетки обрабатывают глицерином, промывают и прибавляют свежую Ь-среду, содержащую 103-ную фетальную бычью сыворотку. Через 48 чклетки трипсиниэируют и расщепляютв соотношении 1:10 в 0 ИЕ среде, содержащей 500 мкгмп С 418, а клеткивыращивают в течение 2-3 недель.С 418 - устойчивые колонии, выделяюти выращивают в присутствии С 418, затем промывают, прибавляют свежие среды, содержащие 107-ную фетальную бычью сыворотку, и среду собирают через 24 ч. Среды являются положительными для ЭПО при радиоиммунном анали зе и биологической пробе дп ч 1 Гго,Метод 11. Клетки С 127 и ЗТЗ трансфецируют 25 мкг ДНК рВРУ-ЭПО и2 мкг ДНК РБЧ 2 пео. Вслед эа трансфекцией применяют метод 1. 25Метод 111. Клетки С 127 трансфецируют 30 мкг ДНК рВРУ-ЭПО по методу 1.Вслед за трансфекцией и расщеплением(1: 10) среды меняют каждые три дня.Приблизительно через 2 недели лоявляются очаги ВРУ-трансформированныхклеток. Отдельные очаги собирают,выращивают до субсливающегося монослояи анализируют на активность ЭРО илиего антигенность в кондиционированных средах,П р н м е р 13. Экспрессия в клетках насекомых. Конструирование р 1 УЕУЕРОР Ь 13.Плазмидный вектор р 1 УЕУ депонирован в Авегдсап Туре Сц 1 гцге Со 11 есгдоп, КосЕчд 11 е, Магу 1 апд, под входящим номером АТСС 39991р 1 УЕУ переваривают ЕсоК 1, затупляют с использованием большого фрагмента ДНК-полимеразы 1, и одиночныйлинкер Мог 1СССССССССССССССССССС50сшивают с тупым концом. Полученную плазмиду обозначают р 1 УЕУ М 1.р 1 УЕУ переваривают Бша 1 и одиночный линкер БГд 1СССССССАССССССССССССССТСССССССсшивают с тупым концом, Полученнуюплазмиду обозначают р 1 УЕУБ 1,Плазмиду р 1 УЕУБ 1 перевариваютКрп 1 и отщепляют от 0 до 100 п,о,от каждого конца путем перевариваниядвунатриевой эндонуклеазой Ва 1 31,Полученные концы, которые не совсемтупые, затупляют с использованиембольшого фрагмента ДНК-полимеразы 1,и полилинкерХЬо 1 ХЬа 1В 81 11 ЕсоК 1дщА цКп 1АСАТСТССАСААТТСТАСАТССАТССТАССТСТАСАССТСТТААСАТСТАССТАССАТССсшивают с тупым концом, Полилинкер вставляют в обеих ориентациях, Плазмиду, в которой ориентирован полилинкер таким образом, что сайт Вя 1 11 внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют р 1 УЕУБ 1 Ве Кр. Плазмиду, в которой сайт Крп 1 внутри полилинкера является близлежащим к полиэдральному генному промотору, называют р 1 УЕУБ 1 КрВя. Число пар оснований, которые были потеряны между первоначальным Крп 1-сайтом в р 1 УЕУБ 1 и полиэдральным промотором, не определено. р 1 УАУБ 1 Вя Кр депонирована в Ашег 1 сап Туре Сц 1 гцге Со 11 есг 1 оп, КосЕчд 11 е, под входящим номером АТСС 39988.р 1 УЕУ М 1 переваривают Крп 1 и Рзг 1. Большой фрагмент, который содержит начало репликации и 3 -конец полиэдрального гена, выделяют (фрагмент А), р 1 УЕУБ 1 В 8 Кр переваривают Рзг 1 и Крп и меньший фрагмент, который содержит полиэдральный генный промотор и полилинкер, выделяют (фрагмент В). Фрагменты А и В объединяют ДНК-лигазой для образования новой плаэмиды р 1 УЕУБ 1 Вр КрМе, которая содержит частично потерянный полиэдральный ген, в который вставлен полилинкер и Мог 1-сайт, который прикрывает фланг полиэдрального генного участка.р 1 УЕУБ 1 ВС Кр М 1 переваривают ЕсоК 1 и вставляют фрагмент ЕсоК 1 длиной 1340 п.о. из й -НЕРОР Ь 13. Плазмидй, содержащие ген ЭПО в ориентации так, что 51 -конец гена ЭПО является близлежащим к полиэдральному промотору и 3 -концу полиэдрального)гена, идентифицируют путем перевари-, вания Вя 1 11, Одну из этих плазмид обозначают как р 1 УЕРО.Экспрессия ЭПО в клетках насеко" Плазмидную ДНК плаэмиды р 1 УЕРО выделяют и подвергают дальнейшей очист 5 ке СБС 1-центрифугированием. ДНК-штамма Ь 1 вируса полиэдроза Аиго 8 гарЬа са 1 Иогп 1 а дикого типа (АсИРУ) получают фенольной экстракцией вирусных частиц и последующей очисткой вирусной ДНК,Эти две ДНК трансфецируют в клетки 1 РЬ В-БГ, Для каждой чашки трансфецируемых клеток используют хомутикДНК АсИРУ .дикого типа и 10 мкг р 1 УЕРО,оЧашки инкубируют при 27 С в течение5 дней. Затем собирают надосадочнуюжидкость, и экспрессию ЭПО в надосадочном слое анализируют радиоиммунныманализом и биологической пробой пчСго,П р и м е р 14. Очистка ЭПО.Среды клеток СОБ (121) с концентрациями ЭПО до 200 мкг/л концентрируют у 5до 600 мл с использованием ультрафильтрационных мембран, диафильтруютпротив 4 мл 10 мИ раствора фосфатанатрия, рН 7. Концентрированные и диафильтрованные кондиционированные среды содержат 2,5 мг ЭПО в 380 мг общего белка. Раствор ЭПО дополнительно концентрируют до 186 мп ,и .осажденные белки извлекают пентрифугированием при 110000е в течение 30 мин.35рН надосадочного слоя, который содержит ЭПО (2 мг), доводят до рН 5,5с помощью 507.-ной уксусной кислоты,оперемешивают при 4 С в течение 30 мини осадок извлекают центрифугированием 40при 13000 х 8 в течение 30 мин.Верхний слой (20 мл), содержащий200 мкг ЭПО (24 мг общего белка),наносят на колонку с СМ-сефароэой(20 мл), уравновешенной в 1 О мМ ацетата натрия (рН 5,5), промывают 40 млтого же буфера, ЭПО, связанный сСМ-сефарозой, элюируют 100 мл градиента УаЧ (0-1) в 10 мМ растворе фосфата натрия (рН 5,5). Фракции, содержащие ЭПО (общее количество 50 мкг50в 2 мг общих белков), объединяют погруппам и концентрируют до 2 мл сиспользованием ультрафильтрационноймембраны,Сконцентрированные фракции иэ55СМ-сефарозы подвергают дальнейшейочистке с помощью ВЭЖХ с обращеннойфазой, используя колонку Чуйас С. ЭПО подают на колонку, уравновешенную 10%-ным растворителем В (растворитель А представляет собой 0,17.СГСОН в воде, растворитель В представляет собой О, 1% СРСОН в СРСИ), с низкой степенью подачи (1 мп/мин). Колонку промывают 10%-ным растворителем В в течение 1 О мин и ЭПО элюируют линейным градиентом В (10-70%) в течение 60 мин, Фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группам ( л 40 мкг ЭПО в 120 мкг общих белков) и лиофилиэируют, Лиофилизированный ЭПО повторно растворяют в 0,1 М растворе Тг 1 з-НС 1 (рН 7,5), содержащем 0,15 И МаС 1, и повторно хроматографируют ВЭЖХ с обращенной фазой. Фракции, содержащие ЭПО, объединяют по группам и анализируют электрофорезом в БОБ-полиакриламидном (1 ОЖ) геле, Объединенные фракции ЭПО содержат 15,5 мкг ЭПО в 25 мкг общего протеина.Формула изобретенияСпособ получения кДНК-клонов, кодирующих человеческий эритропоэтин, включающий отбор клонов в результате гибридизации библиотеки кДНК-клонов с маркированным радиоактивным фосфором зондом и последующее выявление целевых клонов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа и выхода эритропоэтина при экспрессии в животных клетках, отбор клонов проводят в результате гибридизации 3 кДНК-библиотеки бактериофага мРНК фетальной печени с олигонуклеотидными зондамиА А А А А А ТТССАИСССТАСААСТТ, ССАМСССТАСААСТТИАС ТТСМ Т Т ПСЫ Т Т ТАСАССТААСТТССТ, ТАСАССТААСТТСТТ,которые получают путем выделения и очистки эритропоэтина иэ мочи людей, страдающих апластической анемией, путем фракционирования жидкостной хроматографией высокого давления и элюирования с помощью 0-95%-ного градиента ацетонитрила и 0,1%-ной трифторуксусной кислоты, определения аминокислотной последовательности эритропоэтина в результате переваривания эритропоэтина трипсином при рН 7 и ,температуре 37 С, выбора трипсиновых1672930 Составитель Т.Забойкина Техред М,Моргентал КорректорМ.Самборская Редактор И,Дербак Заказ 2848 Тираж 367 ПодписноеВНРРЛР Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 Фрагментов Ча 1-Азп-РЬе-Туг-А 1 а-Тгр"-Еуз- аминокислоты 46-52 или Ча 1-Туг-Бег-Азп-РЬе-Еео-Аг 8- аминокислоты144-150 для синтеза олигонуклеотидов,причем гибридизацию проводят при48 С в течение 3 дней, а выявлениецелевых клонов осуществляют с помощьюавторадиограФии