Способ получения лейкоцитарного интерферона

, 640 -ИТАР инжене р 2 ышееск ФН ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР(57) Использование: генетическа Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к получению человеческого лейкоцитарного интерферона.Известен способ получения лейкоцитарного интерферона, предусматривающий культивирование штаммов культивируемых клеток животных, выделение и очистку целевого продукта.Целью изобретения является пов ние чистоты целевого продукта.В данном способе осуществлено обнаружение послддовательностей ДНК, кодирующих ЧеИФН-а в клетках Е.со 11.С помощью данного способа получают полипептид(ы), проявляющие иммунологич ую или биологическую активность Че- И Настоящий способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладария, получение лейкоцитарного йнтерферона, Сущность изобретения: способ включает обнаружение и выделение последовательностей ДНК и конструирование рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих полипептид, обладающий иммунологической и биологической активностью ЧеИФН- и, Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ДН К последовательности 2-р В В 322 (Рзс) НС 1 Ес, 2-рВВ 322 (Рзт), Н ЕЬ, 2- рВЯ 322 (Рзс) Нс 1 Е-ЯМ, 2-рВВ 322 (Рзт) Нс 1 Е-ЯИ, 2-рКТ 287 (Рзс) Нс 1 ЕЬ-АН 6, а также последовательности, которые гибридизуются с изложенными вставками,ющий иммунологической или биологической активностью ЧеИ Ф Н-а.Получены рекомбинантные ДНЕ, содежащие ДН К последовательн:.стиаюйрВ 8322/Рзт) (Н С Е 4 с, 2-р ВЯЗ 12(Рзт)/Нс 1 ЕЬ, 2-рВВ 322/Рзс/Нс 1 Е-ЯИ 35, 2-рВВ322/Рзт/Нс 1 Е-ЯГ 442, 2-рКТ 287/Рзс/Нс 1 Е- .2 Ь-АН 6, а также ДНК последовательности,которые гибридизуются с упомянутымивставками,Способ иллюстрируется следующими ,Рипримерами,П р и м е р 1, Человеческие лейкоциты , );стимулируют в течение 5 часов при 37 С двирусом Сендай и экстрагируют с иесь поли(А)РНК, содержащей мРНК человеческоголейкоцитарного интерферона (ЧЗИФН-амРНК). Стимулированные лейкоци, ы собирают и 10 клеток суспендируют в 1 л раствора, содержащего 8 г МаС 1, 0,2 г 1:С 1, 1,15г Ма 2 НРО 4 2 Н 20 и 0,2 г КН 2 РО 4, ра(.творен1/20 количества способной гибридизации в НЮЬ м-РНК, содержащегося в поли(А) РНК из индуцированных клеток,Находящийся в рВВ 322 Рас 1-сайт находится в В-лактамазном (пенициллиназном)геле. Следовательно, если кодирующийДНК-сегмент (например с-ДНК, включающая весь ген или часть гена) расположен в позиции с соответствующей ориентацией, то в результатс получают "липкий" (1 озеб) 50 Определено, что АТС, расположенная внуклеотидах 57 - 59, является фактическипервой АТС, аутеничной мРНК.Кодон в Н 1-2 Ь фрагменте, соответствующий первой аминокислоте из лимфобластоидного интерферона, представляетсобой 22 кодна из первого Аоб (и 14 кодоновиз второго), что указывает на то, что последовательности, кодирующей интерферон,может предшествовать последовательность, определяющая сигнальный пептид,состоящий из 23 (или, что менее вероятно,из 15) аминокислот, Более длинные из предполагаемых сигнальных последовательностей содержат непрерывне серии из 11 15гидрофобных аминокислот (а более короткие из 6 гидрофобных аминокислот),По-видимому, нуклеотидная последовательность, соответствующая "созревшему"ИФН-а полипептиду, включает в себя 498 20нуклеотидов, кодирующих 166 аминокислот, Основной состав кодирующей последовательности соответствует 50% ОС.Цепь ДНК, имеющую ту же последовательность, что и м-РНК, обозначают как 25плюс-цепь, а ее комплемент как минус-цепь,НГЬ ДНК расщепляют рестиктазой В 91 И,концевую группу метят Р-фосфатом и ДНК32переваривают Рзт 1, в результате получаютболее длинный фрагмент 545 Ьр,/570 Ьр. и 30более короткий 340 Ьр радиоактивный фрагмент, Эти фрагменты денатурируют и превращают в поли(А) РНК из индуцированныхлейкоцитов в 80% формамиде, 0,4 М йаС 1,т,е, в условиях, в которых не происходит 35вторичной ассоциации ДНК - ДНК (см, выше). Нуклеиновые кислоты расщепляют нуклеазой 31, которая разрушает всеодноцепочечные нуклеиновые кислоты, особенно негибридизованную Р-ДНК, и продукты разделяют на полиариламидном геле,Проводят такой же эксперимент, какописано в предыдущем разделе, но используют поли(А) РНК из неиндуцированныхлейкоцитов человека, получаемых по той же 45методике, что и индуцированые вирусомлейкоциты Яепс 1 а 1, По сравнению с результатами предыдущего раздела поли(А) РНКиз неиндуцированных клеток содержит белок. Белок состоит из амино-концевой части Р-лактамазы и последующей аминокислотной последовательности, которая кодирует целевой белок. Для гарантии того, что Н 1-4 с вставлена в нужную рамку считывания для экспрессииР-лактамазонового гена, используют набор производных рВЯ 322, а именно рКТ 279, рКТ 280 и рКТ 287. Каждое из этих производных имеет Рзт 1, локализованный таким образом, что гетерогенная ДНК, встроенная в этом сайте, будет находиться в правильной рамке считывания. Рзт 1-изъятую вставку из НЫЬ получают также, как описано для фрагмента НЫс, Н 11-2 ЬРэ 1 фрагмент (10 нг) смешивают с Рзт 1-расщепленным рВВ 322, рКТ 279, рКТ 280 или рКТ 287 в каждом случае 10 нг в 20 микролитрах 10 мМ трис-НС 1(рН 7,5), 6 мМ М 9 С 12, 100 мМ КаС 1, 6 мМР-меркаптоэтанола, 200 микрограмм/мл желатины и 0,1 мМ АТФ и инкубируют с 0,1 единицей Т 4 ДНК-лигазы втечение 16 ч при 10 С, Результирующие молекулы рекомбинантной ДНК обозначают как Е-рВВЗ 22(Рзт) (Нс 1 РЬ 2- рКТ 279(Рзт) (Нс РЬ 2-рКТ 280(Рзт) Нс 1 РЬ и Е-рКТ 287 (Рзт) (Нс 1 ГЬ), Е.соИ Н В 101 трансформируют каждой из этих рекомбинантных молекул ДНК и трансформированные колонии отбирают на содержащих тетрациклин агаровых пластинах, Такие устойчивые к тетрациклину клоны трансформированных бактерий содержат рециклизованный вектор, бактериальные колонии каждого набора выращивают на миллипоровских фильтрах и колонии, гибридизованные Р-меченым НИсгзфрагментом идентифицируют и отбираюттак, как описано выше, Штаммы описываются следующим образом:Е.со И Н В 101 (Е-р В Я 322/Рзт(Н с 1 ГЬАН 1) до (-АНЗ);Е,соИ НВ 101 (Е-рВВ 322(Рзс)/НсЕЬАН 1) до (-АНЗ);Е.соИ НВ 101 (Е-рКТ 279(Рзс)/Нс 1 РЬАН 1) до (-АН 8);Е,соИ НВ 101 (Е-рКТ 280(Рзт)/Нс ЕЬАН 1) до (-АН 8);Е,соИ НВ 101 (Е-рКТ 287) (Рзт)/Нс 1 ЕЬАН 1) до (-АН 8),Экстракты некоторых вышеприведенных штаммов, а также некоторые из штаммов 2-РВЯ 322/Ряс/(Нс 1 Г-ЯК 1 к 95) испытывают на активность ИФН-а. Бактерии выращивают на триптоновой сэеде до стационарной фазы, собирают, промывают 1/20 объема (по отношению к объему культуры) 50 мМ трис-НС 1(рН 8), 30 мММаС 1 и замораживают. После оттаивания клетки снова суспендируют в укаэанном ниже объеме вышеуказанного буфера и добавляютЯ 30, 3100 330, Я 100 330, Я 100 330, 3100 ЯЗО, 3100 Я 30, 3100 лизоцим до 1 мг/мл. Через 60 мин и при 0 С суспензии замораживают(в бане этанол-сухой лед) и оттаивают (при 37 С) 5 раз и центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин на центрифуге, В некоторых случаях часть 5 надосадочного слоя далее центрифугируют при 1000009 на центрифуге и выделяют надосадочные слои, Такие надосадочные слои и сп ыты вают на активность И ф Н-а с и омощью определения снижения цитопатиче ского эффекта. Колонии, дающие положительную реакцию в примере 1, подвергают новому определению вместе с 49 Источник экстракта: Е.со 1 НВ 101, трансформированная с помощью; 2-КТ 279(Рзт)/Нс ЕЬ-АН 8 2-КТ 280(Р зт)/Н с 1 ЕЬ-А Н 3 2-КТ 287(Р зт) /Н с 1 ЕЬ-А Н 6 2-рВЯ 322(Рзт)/Нс 1 Е-ЯИ 35 2-р ВЯ 322(Рзт)/Нс 1 Е-ЯИ 42 2- ВЯ 322 Рзт /Нс 1 Е-ЯМ 32 Полученные белки обладают иммунологической или биологической активностью 15 ИФН.Плазмиду НО-ЯВ/35 обрабатывают Рзт 1, 1 АС-Аи фрагмент встраивают в плазмиду, Определяют структуру модифицированной плазмиды 2-рВЯ 322(Рз) 20 (Нс Е-ЯМ 35-АН 16), а также аминокислотную последовательность с концевым амином для белка, получаемого в Е,со 1. Нуклеотидная конструкция соответствует такой последовательности, в которой фрагмент 1 АС-А 1 д 25 присоединен к первой аминокислоте из ИНФ-а 1(ЯК 35), Аминокислотная последовательность амино-концевой части полученного в Е,со 1 протеина подтвержадет, что получают "липкий" белок, имеющий шесть 30 аминокислот, встроенный в последовательность ИФН-а 1(ЯИ 35), Однако штамм, трансформированный модифицированной плазмидой, производит приблизительно в 100 раз больше полипептида, обладающего 35 биологическими и иммунологическими свойствами человеческого лейкоцитарного интерферона по сравнению с организмом хозяина, трансформированным немодифицированным 2-рВЯ 322(Рзс) (Нс 1 Е-ЯМ 35), 40Гибридную плазмиду расщепляют ВЯр 1, После термической инактивации (650 С, 30 мин) фермента смесь доводят до концентрации 50 мМ трис-НС 1 (рН 8) и нагревают (37 С, 30 мин), После экстракции 45 фенолом и эфиром самый крупный фрагмент 1 сДН К выделяют при низкой температуре на желатинизирован ной ага розе (0,8%) и присоединяют связующие Нпг 111, Затем клонами из серии 2-рВЯ 322(Нс Е-ЯИдоЯИ. Некоторые из приведенных наиболее активных производителей проверяют более тщательно. Культуры выращивают до поздней логарифмической фазы (наблюдаемое ОД 65 о равно приблизительно 0,9) и клетки лизируют в 1/50 объема культуры, Обнаруживают следующие активности с использованием в качестве отрицательного контроля 2-рВЯ 322(Рзт)(Нс 1 Е ЯИ 32),модифицированный фрагмент присоединяют к расщепленной Н 1 пс 111 плазмиде НЯ- рВЯ 322/ЕсоЯ 1/ а асцч 5-150/1 АС/ выделением из содержащих фрагмент гелевых частиц (каждая приблизительно по 20 микролитров) при 65 С, охлаждением до 37 С и добавлением 20 ед/мл Т 4 ДНК-лигазы, Через 16 ч при 15 С в отвердевшем геле происходит связывание, Одну десятую объема 100 мМ трис-НС 1 (рН 7,5), 100 мМ СаСг, 100 мМ МдС 12 добавляют в образец, нагревают 5 мин при 65 С и охлаждают до 37 С, Образцы затем используют для трансформации обработанной Са Е.со 11 НВ 101, инкубируют при 0 С в течение 20 мин, нагревают при 42 С в течение 1 мин и в течение 10 мин при 20 С. После добавления 1 М триптоновой среды образцы инкубируют 60 мин при 37 С и помещают на агаровые пластинки, содержащие ампициллин, Затем от этих культур отделяют плазмиду ДНК игибридную плазмиду, содержащую ИФН-а 1 с его присоединенным по 5 -концу 1 АС- фрагментом, идентифицируют ограничительным анализом, Затем плазмиду расщепляют с помощью ЕсоЯ 1 и переваривают экзонуклеазой Ва 1-31 (0,06 ед/мл, 2 - 4 мин при 30 С) для удаления выступающего ЕсоЯ 1 конца фрагмента 1 АС и для укорачивания р-галактизидазного кодирующего сегмента.Плазмиду расщепляют В 9111, самый большой фрагмент отделяют на агарозном геле (0,8%). Затем этот фрагмент обьединяют с фрагментом ВЯр 1-Вд 1 Д из 2-рВЯ 322/Ры/ /Нс 1 Е-ЯМ 35 и результирующую гибридную1764515 24 23 плазмиду используют для трансформации Е.со НВ 101. Трансформированные колонии подвергают отборочным испытаниям на ИФН-активность и выбирают один клон, имеющий высокую ИФН-активность. Этот 5 клон обозначают Е,со НВ 101(С 8-ИФН-.а 1), а его гибридную плазмиду С 8-ИФН-а 1,Анализ С 8-ИФН-а 1 последовательности ДНК показывает, что кодирующая последовательность, следующая за 10 инициирующим триплетом, определяется первыми семью аминокислотами В-гадлактозидазы, остаток Рго образован слиянием аминокислот от 16 до 23 в сигнальной последовател ьн ости И Ф Н-а 1 посл едовател ьно сти ИФН-а 1 (ЯК 35). Миниклеточные штаммы Е.со (ОЯ 410), трансформированные гибридной плазмидой С 8-ИФН- а 1 производят приблизительно 50 миллионов единиц ИФН на литр, или приблизительно 20 в 2500 раз больше полипептида, обладающего иммунологической или биологической активностью ЧеИФН по сравнению с миниклетками, трансформированными немо 25 ИФН-а активность НЮэкстрактов элюируют перед цитохромом с величиной кд 0,45.Следовательно, кажущийся молекулярныйвес вещества составляет от 20000 до 30000,в фракциях контрольного экстракта НО 30 активности не было обнаружено,ЧеИФН-й (специфическая активность1,2 х 10 о/мг) и НО-НЫ-6 Я 100 эксетракты инкубируют с различными разбав 35 ленными растворами антисыворотки овцыпротив ЧеИФН-а (специфическая активность 450000 единиц/мл) в 100 микролитрахмодифицированной среды Еадез (МСЕ) с10 сыворотки теленка в течение 30 мин40 при 37 С и 45 микролитов анализируют наИФН-активность путем редукционного анализа цитопатического действия,Следовательно, ИФствителен к трипсинупротеину,НЮЯ 100 экстра-а экстрактов чувследовательно, к 0,1 20 1 20 10 2 50 0Экстракт Н 0-35 (1 мл) и экстракт Я 100 Е.со НВ 101 (Е-рВВ 322(Рзт) (НсГ-ЯМ 32) ("НЮэкстракты" ) хроматографируют на 32 мл колонке Сефадекс 0-100 при 4 С в 50 миллимолях К-фосфатного буфера (рН 7,4), Скорость потока составляет 2 мл/ч и отбирают фракции объемом 1,0 мл, Определяют поглощение при 280 нанометров, 405 нано- метров (цитохром с) и ИФН-й активность. дифицированным Е-рВВ 322(Рзт)(НЫ ЯМ 35), Аминокислотная последовательность полипептида, полученного с помощью плазмиды С 8-ИФН-а 1 подтверждает, что продукт представляет собой "липкий" белок, имеющий семь аминокислот из ф-галактозидазы, одну кислоту, образовавшуюся в результате слияния аминокислоты 16 - 23 из сигнальной последовательности ИФН-а 1-входящей в ИФН-а 1,П р и м е р 9. 50 микролитров образцов аутеничных ЧеИФН-а(специфическая активность 1,2 х 10 0 (мг, 500), экстракты Я 100, описанных выше Е,со Н В 101 (Е- рКТ 287(Рзт)/НсРЬ АНС("Н 1-287-6-экстракты") (2000/мл, 100) и Е,со НВ 101 (2-р В В 322(Рзт)/Нс Р-Яй 35) (" Н Гэкстракты") (10000/мл, 500) инкубируют с различным количеством трипсина, как показано ниже, в течение 30 мин при 37 С, Так как экстракты Я 100 имеют высокое содержание протеина, а ЧеИФН-анет, то смесь ЧеИФН- а и контрольный экстракт Я 100 НЫиспытывают параллельно:26 25 1764515 о проАнтитела, направленные против ЧеИФН-й, специфически ингибируют ИФН- активность полипептидов, полученных в Е.со трансформацией с некоторыми рекомбинантными молекулами ДНК, содержащими НсРЬ ДНК последовательность. Пониженное воздействие антитела на ИФН-а, полученное в Е,со, может отражать структурные различия между последним и натуральным ЧеИФН-а, например,Эти результаты показывают, что НФи Н 1-287-6 экстракты проявляют защитное действие на клетках человек и на клетках мыши проявляется слабый эффект ( "10;4), как это типично для интерферона человека.Экстракты Е,со НВ 101 (2- рВВ 322(Рэт)/Н 0-ЯМ 3-АН 6 сравнивают с аутентичным ИФН по его действию на некоторые функции клетки. И Ф Н-а, полученный из Е,со, проявляет следующие свойства натурального ИФН-а;(1) он увеличивает активность уничтожения лимфоцитов человека, (2) он усиливает цитотоксичность зависимой от антиела промежуточной клетки, (3) он подавляет ингибирование антиген и митоген-наведенной миграции лейкоцитов, и (4) он проявляет возрастание ИФН-чувствительности клеток, Эти свойства индуцированы активноотсутствие углеводородного фрагмента, присутствие сигнальной последовательности, или слияние с частью 3-лактамазной последовательности,5 Клетки человека СС 23 или клетки мыши929 обрабатывают экстрактами Е.со ЧеИФН-а (специфическая активность 1,2 х 10 единиц/мг) или ИФ мыши, инфицируют вирусом и ИФН-й активность определяют путем 10 анализа цитопатического эффекта,стью ИФН-аэ синтезированным Е.с тив опухолей и рака человека.П р и м е р 10, ИФН-а без амино-концевых последовательностей получают в Е,со 5 и подтверждают, что он проявляет активность в соответствии с активностью ИФН.Для того, чтобы получить соответствующую рекомбинантную молекулу ДНК, плазмиду НОЬ гидролизуют Есор и ВавН и 0 фрагмент, содержащий ИФН-ба кодирующую последовательность, отделяют на агарозном геле и сливают с последовательностью, кодирующей -+ не-ИФН- а - Есор/ВапН фрагмент плазмиды НЮ-ЯМ 5 35, в которой отсутствует Ры 1 сайт, примыкающий к 3 концу гибридной вставки по сравнению с НЮЬ, Полученную плазмиду обрабатывают рестриктазой Рэс/В 9 амина-концевого фрагмента ИФН- а 1 кодирую щей последовательности, На его местовстраивают ряд ИФН- а 1 фрагментов, пол5 10 15 20 25 30 35 40 45 5055 ученных гидролизом плазмиды НИЬ с Рчц , обработкой Ва 1 экзонуклеазы, присоединением Рз 1 1 линкеров с последующей обработкой Вд , Полученные таким образом плазмиды содержат последовательности, кодирующие И Ф Н-а , в которых отсутствуют различные части их аминоконцевых последовательностей. Плазмиду 2 Н-М 8 гидролизуют Рзс и определяют ее нуклеотидную последовательность, Плазмида 2 НМ 8 содержит несколько нуклеотидов между Рзт сайтом и первым кодоном ИФН-а , Плазмиду 2 Н-М 8, гидролизованную РзО, обрабатывают полинуклеатидкиназой/ИМАТР, Я экзонуклеазой и Яа 1, Эти фрагменты помещают под контрольАС присоединением их кАС фрагменту, полученному из плазмидыас 3 Р 8 обработкой Есор эндонуклеазой Я 1 и Яа 1, Кодирующие посл едовател ьн ости И Ф Н- а 1 полученных таким образом ряда плазмид, испытывают недостаток различных частей на амина-конце, соединенных в направлении против часовой стрелки путем АИ 3 с фрагментом, содержащимАС промотор,В клетках Е.со (ОЯ 410) обе этих плазмиды экспрессируют полипептиды, которые проявляют И Ф Н-активность,Проверяют клоны, которые проявляют слабую гибридизацию к фрагменту НИс и идентифицируют клон Е,ао НВ 101 (Л- р В 8322(Рзт)/Н с Р-206).Гибридная плазмида 2-рВВ 322(Рат) НсР-206 ("НСГ-206") из клона и его вставка "НЮ-206" слабо гибридизуется к Н 0-4 с и Н 1=2 Ь фрагменту, Трансформация клеток Е,со плазмидой ННобеспечивает получение полипептидов, проявляющих биологическую или иммунологическую активность Ч е И Ф Н-а.Нрклеотидную посл едовател ьность Н О-20 фрагмента (Рзс) фрагмент плазмиды ДНК размером 790 вр, выделенной из культуры НсР-У) определяют с помощью общеизвестных методов,Гидролиз ова н ную Д Н К (обыч но 10 ми крограмм) метят по 5". Меченые фрагменты разделяют вторым рестрикционным ферментОм, продукты отделяют электрофорезом через 5% полиакриламидный гель в трис-борат-ЭДТУК буфере, экстрагируют из геля и очищают, Получают следующие различные фрагменты:25 и 26 - расщепление НО-206 с помощью Рчц , мечение, расщепление с помощью Вд , выделение Рзт-ВдИ фрагмента (257 вр) ("25") и РмВд фрагмента (279 вр) ("26"). 21, 22 и 23 - расщепление НЫ-206 с помощью Рчц, мечение, расщепление с помощью Вд, выделение Рчц-Вд фрагмента, (88 вр) ("21") Рчц-Вд фрагмента (176 вр) ("22") и РзтВдфрагмента (214 вр) ("23").11, 12, 13 и 14 - расщепление Н П-206 с помощью Вд., мечение, расщепление с помощью РзО, выделение Вд-Раб фрагмента (279 вр) ("14") и комигрейтная смесь Вд-РзО фрагмента и Вд-Вд фрагмента. Расщепление смеси с помощью Рчви выделение Вд-Рзс фрагмента(257 вр) ("13"), Вд-Рчофрагмента (176 вр) ("12") и Вд-Рчц фрагмента (88 вр) ("11").27, 270, 41, 43, 44 и 45 - расщепление НИ-206 с помощью Нпй, мечение исходных фрагментов: Нпй-Нпй(113 вр) ("27"), Нпй-Нп 1 (146 вр) ("28"): Нпй-Нпй (159 вр) ("ЗОР"), Нп 1-Н и (379 вр)("31 Р") и Нп 1-Нпй (1522 вр)("32 Р"), Расщепление 28 Р с помощью Мво 11 и выделение фрагмента Нп 1 Мво 11 (112 вр) ("41"), Расщепление ЗОР с помощью Мво 11 и выделение фрагмента Нпй-Мво(125 вр) ("43"). Расщепление 31 Р с помощью Рзт и выделение фрагмента Нп 1-Рзс, (151 вр) ("44"). Расщепление 32 Р с помощью Рзт и выделение фрагмента Нпй-Ры (139 вр) ("45"), Разделение тяжа 27 Р с получением двух тяжей ("27 ц" "27 "),Из сравнения аминокислотной последовательности вставок видно, что НХ-206 фрагмент кодирует интерферонподобный протеин, имеющий на одну аминокислоту меньше, чем фрагмент НИЬ(аминокислота 44 (АЯр), присутствующая в Н 0-2 Ь, не содержится в НЮ-206), Кроме того, различны 10 нуклеотидных последовательностей и 17остатков производных аминокислот двух фрагментов. Сравнение 35 амно-концевых аминокислот с лимфобластоидным интерфероном показывает, что вставка Н 1- 11-206 кодирует протеин, который отличается 5 остатками. Следовательно, должны существовать по крайней мере три различных ИФН гена лейкоцитного типа (альфа типа)-Н 1-2 Ь фрагмент. Клетки Е.со НВ 101, содержащие гибридную плазмиду, выращивают в реде триптона при встряхивании до ОДжо 1 - 2 раза, Клетки собирают, взвешивают, вновь суспендируют в отношении 1/100 или 1/20 от первоначального объема культуры и лизируют, Надосадочные жидкости 5-30 испытывают редукционным анализом СРЕ е микротитровочных пластинках, Экстракты из контрольных клеток были отрицательны( 1 ,О./мл), Клетки СС 23 человека и клетки бычьей эмбрлонной почки (БЭП) (ЕОчч)выращивают в МЕМ% плодной сыворотки теленка. Клетки инфицируют соответствующим разбавленным раствором вируса 5Менго через 24 ч. Количество белка оценивают визуально относительно частично очищенного лейкоцита ИФН (препарат РЕ)известного титра, Этот препарат был в трираза активнее на клетках человека по сравнению с клетками быка,Следовательно, И Ф Н- а 1 примерно в 30раз менее активна на клетках человека, чемИФН-а 2, Они оба проявляют одинаковуюактивность на бычьих клетках, Таким образом, ИФН могут быть, в дополнение к ихиспользованию в качестве антивирусных иантиопухолевых или антираковых агентов вчеловеке использованы в лечении этих заболеваний у крупного рогатого скота, Например, препараты ЧеИФН-а применяют влечении ЕМОЧ и других хорошо известныхвирусных инфекций крупного рогатого скота. Это даже более приемлемо для ИФН-а1, так как его активность на клетках быка 25примерно в 20 раз больше, чем активностьна клетках человека.Улучшенный выходдостигается вслучаеИФН- а 1 с конструкцией С 8 (указано выше),такую же конструкцию получают и для ИФ Н-а 302, Е-р В Я 322(Рзт)/Н 0-11-206 расщепля ют полностью с помощью Взр и частично с помощью Рчц и фрагмент 867 вр выделяют из6% полиариламидного геля, Этот фрагментзатем лигируют до 2590 вр Рчц фрагмента 35С 8-ИФН-а 1. Полученной гибридной плазмидой трансформируют Е,со НВ 101 и клоныотсеивают на ИФН активность, Один крон,проявляющий высокую активность, отбираюти вводят в Е,со НВ(С 8-ИФН- а 2). 40ДНК-последовательность гибриднойплазмиды С 8-И Ф Н-й 2 о бра баты ва ют такимобразом, чтобы она подобно С 8-ИФН-а 1имена кодирующую последовательностьпосле инициаторного триплета, которая определялась сначала семью аминокислотамиР-галактозидазы, остатком Рго и 16 - 23ИФН-а 2 сигнальной последовательности.Клетки, трансформированные с этойплазмидой, дают 100 - 200 миллионов единицна литр ИФН и выход ИФН-а 2 был в 20000 -40000 раз выше, чем при использовании клеток, трансформированных в немодифицированным Е-рВЯ 322 (Рм)/НО- 206,Сравнение выходов С 8-ИФН-а 1(50 х 10единиц/л) и С 8-ИФН-сй (100 - 200 миллионов единиц/литр) на первый взгляд является неожиданным, так как ИФН-и 2примерно в 30 раз более активен, чем ИФНа 1 на клетках человека (показано выше). Однако сравнение количества 2 протеинов, полученных в результате культивирования клеток, трансформированных двумя С 8 плазмидами показывает, что в С 8-ИФН-а 1 протеина в 5 - 6 раз больше, чем в С 8-ИФН,Плазмиду, содержащуюАСАц фрагмент, получают в результате обработки известногоас промотора с Ац 1 и достройкой фрагмента с ЕсоЯ линкерами. Полученный фрагмент встраивают в ВЯ 322 при ЕсоЯ сайте и маленький фрагмент ЕсоЯ-ЕсоЯ удаляют из конструкции. Полученную плазмиду обозначают 404, расщепляют с Нпб и Рчцдля вставки ИФ Нсодержащего фрагмента. Этот фрагмент ИФН-а 2 получают частичным гидролизом 7-рВЯ 322(Рз 1)/ НсЕ-206("206"), достройкой ЯацЗА фрагмента с помощью Нпб линкера и расщеплением с Взр 1, После сшивают фрагмент Нпб-Рчц плазмиды 404, полученную плазмиду гидролизуют Нпб и ЯсоЯ, обрабатывают 51 нуклеазой для приближенияАС промотора к ИНФ-а 2 гену и вновь лигируют. Эта конструкция идентифицирована как плазмидаАС-АО (а 2) имеет ИФН ДНК последовательность под контролем .АС промотора, Кроме того, ИФН-а 2 последовательность расположена сразу же после инициирующего АО 6 кодона этого промотора, Следовательно, по крайней мере часть ИФН, полученного с помощью этих плазмид, будет зремым ИФН, напримео, ИФН без каких-либо аминокислот сигнальной последовательности, В миниклетках выход ИФН-а 2, полученного с плазмидойАС-АОС (а 2) составил 5 - 10 миллионов единиц на литр.Генетический маркер из рВЯ 322 связывают с АОЙ и ИФН- а 2 геном из Н 1-11-206. Эту конструкцию получают в результате гидролиза рВЯ 322 с помощью Мво 11, обработки Я 1, присоединения линкера как это сделано ранее, и повторно реклонирования фрагмента в ЕсоЯ сайт рВЯ 322 и удаления сайта ЕсоЯ, Полученную плазмиду ("Р- ас- АОО плазмида") соединяют с Нпб линкер-Взр фрагментом 206, обоработанным Я 1. После расщепления с помощью ЕсоЯ и обработки Я 1 и фосфатазой, выделяют плазмиду экспрессии Р- ас-АОО (а 2). Конструкции с другими генами получают подобным слиянием с помощьюф- ас-АОС плазмиды для клонирования других генов или конструкций с использованием сайта Бац ЗА в плазмиде Рас-АОС ( а 2),Эта плазмида, обозначена как /3-асАОО (а 2) при трансформации клеток реципиента позволяет получать ИФН-а 2 без слияния с другими протеиновыми последовательностями. В клетках наблюдают выходы 50 - 100 миллионов единиц на 1 л. Предпочтительно использование штамма 5 Е,со 1 ОЯ 410.П р и м е р 11. Конструируют ряд гибридных молекул ИФН-а 1 и ИФН-а 2, обнаруживают, что эти гибридные конструкции отличаются количественно различными 10 свойствами и активностями по сравнению с каждым из родственных ИФН-а 1 или ИФН-а 2.Плазмиды 1, 11, 111 и ч в этих конструкциях обрабатывают рестриказами Взр, Ча стичное расщепление ДНК проводят при пониженных количествах фермента. После тепловой инактивации (65 С, 30 мин) рестриказы, образцы доводят до 50 мМ ТрисНС (рН 8) и в случае необходимости 20 добавляют щелочную фосфатазу кишечника теленка(1 объем на мкгДНК), Спустя 30 мин при 37 С образцы экстрагируют фенолом и простым эфиром. В большинстве случаев фрагменты ДНК выделяют на низкотемпе ратурной желирующей агарозе (0,8%), Для связывания кусочки желе, содержащие фрагмент(около 20 мкл каждый), расплавляют при температуре около 65 С, охлаждают до 37 С и добавляют 200 на мкл Т 4 ДНК 30 лигазы. Полученную смесь выдерживают при 15 С в течение 16 ч и в отвержденном геле получают связывание, Затем добавляют одну десятую объема от 100 мМ Трис-НС 1 (рН 7,5), 100 мМ СаС 12, 100 мМ МдС 12, обра зец нагревают 5 мин при 65 С и охлаждают до 37 С, Затем образцы добавляют к обработанным Са +, клеток, инкубируют при 0 С в течение 20 мин, нагревают 1 мин при 42 С и 10 мин при 20 С, и добавляют 1 мл трип тоновой среды. После инкубирования в течение 60 мин при 37 С культуры помещают на агаровые пластинки, содержащие соответствующие антибиотики.Гибридную молекулу 1, а/Рчо 11/ а45 гибрид конструируют путем частичного расщепления С 8-ИФН-а 1 (С 8-а 1) Рчо 1, дефосфорилирования, гидролиза Рз 0 и выделяют Ры 1-Рчи 1(Р 2) фрагмент размером 1346 вр, Этот фрагмент связывают с 2135 вр Рзт (а)-Рчц 1(Р 2) фрагментом, полученным в результате расщепления С 8-ИФН-а 2(Яцрга) (С 8- а 2) Рно 11 и обработкой Рз 11.Гибридную молекулу 11 а(Вд 1) аконструируют, расщепляя гибридную молекулу 1 Вд 1 П. После дефосфорилирования большой фрагмент Вд 1 П выделяют и связывают с маленьким фрагментом С 8-ИФН-а 2. После клонирования гибридную плазмиду, содержащую маленький Вс 13 П фрагмент в правильной ориентации, идентифицируют рестрикционным анализом,Гибридную молекулуЩ а/Рчц 1/ аконструируют обработкой С 8-ИФН-а 1 РчоИ, дефосфилированием, расщеплением Ача 1 им выделением 1686 вр Рчц 11(Р 2)Ана 1 и 3233 вр Рчц 11(Р)-Ана 1 фрагментов. Эти фрагмены связывают с 300 вр Рчо 1(Р 1)-Рчв 11(Р 2) ф рагментом НсР-206 и плазмиду, содержащую маленький фрагмент Рнни, идентифицируют проверкой трансформированных штаммов Е,сона ИФН-а активность.Гибридную молекулу ч а/Вд 11 Т/а -1 сконструируют в результате гидролиза С 8- ИФН-а 1 Вд 1 ГГ и Ача 1 м выделения фрагмента 1776 вр. Этот фрагмент связывают с фрагментом 3543 вр Вд 1 П-Ача 1 гибридной молекулы 111.Выращивают культуры клеток (ОЯ 410), трансформированные различными плазмидами, и бактерии, собранные центрифугированием, промывают РВЯ, суспендируют в РВ Я (около 1/20 от исходного объема), инкубируют в течение 60 мин при 0 С с 1 мг/мл лизоцима, 10 мМ ЭДТУК, замораживают и оттаивают четыре раза, скашивают, пропуская пять раз через шприц и расщепляют центрифугированием.Активность клеток человека, мыши, морской свинки и быка были следующими:40 имеют несколько фрагментов Есор и Н пс 1111 общих, Гибридизирующая часть сЬги одна из гибридизирующих частей сЬгтакие же, как фрагменты Нпс 111-Нпс 1111 и ЕсоВ 1-Есор, которые гибридизуются с НИ 45 50 2 Ь зондом и имеют одинаковую длину(3,2 кв и 0,95 кв, соответственно). Гибридизующаяся часть сйгидентична гибридизующейся части сЬг, хотя ориентирована в противоположном направлении, поскольку каждый из двух клонов содержит фрагмент 1,4 Вц 11- Вц 11 размером 1,4 и 2 Есор-Есор, 2 кв, которые гибридизуются с НИЬ сДНК зондом, Следовательно, вставки сЬги сЬг- -35 перекрываются,Геном индивидуального человека содержит не менее чем 10 различных ДНК последовательностей, которые перекрестно гибридизуются с НО, Этот вывод подкрепляется тем фактом, что соотношение 55 Сказалось, что все интерфероны имеютприблизительнс одинаковую активность поотношению к бычьим клеткам, но ИФН-а 1 идв гибридных ИФН а (1 и 11), у которых естьдва конечных аминофрагмента ИФН- а 1, 5обладают от около 10 - до 1000-кратно мен ьшей активностью по отношению к человеческим клеткам, нежели ИФН-а 2 и двагибридных ИФН а (111 и И), содержащихконцевые аминофрагменты ИФН-а 2, Два 10гибридных ИФН (1 и 11) с концевыми аминочастями ИФН-а 1 обладают более низкойактивностью по отношению к человеческимклеткам, нежели у самого ИФН-а 1, Один изгибридов (111) с концевыми аминочастями 15ИФН-а 2 обладает приблизительно такойже активностью по отношению к клеткамчеловека, что и сам ИФН-а 2,П р и м е р 12, Получают коллекциюгибридных фагов, полученных из фрагментов хромосомных ДНК зародыша человека,частичным гидролизом Нае 111 и А 1 ц 1, присоединением Есор связующих к А Харон 4 Аветвям. Этот генный банк скринируют поспособу "1 и вы", используя в качестве зонда вставку меченного Р ИФН-а 1 сДНК,вырезанную из рВВ 322/Рзс/НО 2 Ь. Шестнадцать положительно гибридизованныхфаговых клонов выделяютиз 240000 бляшекповторной очисткой бляшек, Десять гибридных фагов препаратов ДНК расщепляютН 1 пб 111, Тас 1, НЬа 1, Вап 11, Е,сой 1 и Вд 1 Д,полученные фрагменты выделяют электрофорезом на агарозном геле, переносят намембраны Миллипор и гибридизуют с меченной Р НОЬ с ДНК вставкой,. згКлоны сЬги сЬгпредставляют собой сегменты ДНК, которые перекрываютсяпо большей части своей длины, так как они фрагментов НОЬ гидролизирующихся, определенных в клоновом банке, составляет около 1 на 16000,Так как Иф Н-а 1 и ИФНасДН К имеют 1 и 2 Вц 1 П сайты, соответственно, внутри их кодирующих последовательностей, повидимому НО-сЬг 35 является копией одного из двух ранее клонированных интерфероновых генов. Н 0-сйг 35 сильно гибридизующийся 3 Н ЫЬ сДН К фрагмент(содержащий только 3 некодирующую область) при сравнении с более слабой гибридизацией с другой хромосомной ДНК этого зонда подтвержает близкое соответствие НЮ-с 1 г 35 и Н 0-2 Ь.Для дальнейшего анализа Н 1-сЬг 35 Нпс 111-ВащН выделяют из сЬг. Этот фрагмент(3,4 кв) содержит гибридизующую часть ("НЮ-сЬг 35") сЬг. Данный фоагмент субклонируют в Рзс сайт рВВ 322, используя известную сС-с 1 б-методику, и Е.со 1 НВ 101 трансформируют полученной рекомбинантной молекулой ДНК.Клоны этих трансформантов скринируЗгют 1 п зш гибридизацией колонии с меченымР НОЬ фрагментом и затем плазмиду ДНК 2-рВЯ 322(Ры)/НсЬгцфНВ "НсЬгИфНВ" выделяют из положительных клонов, Ориентацию гибридной вставки "НсЬг ИфНВ фрагмента" в плазмиде по отношению кЭ-лактамазному гену рВ 8322 определяют по Есор расщеплению и размерам полученных фрагментов, Вставку; ориентированную в правильной рамке считывания с ф-лактамаэой, обозначают а, а противоположно ориентированную Р,Культуры этих положительных клонов выращивают до кажущегося ОДою = 0,8, бактерии собирают и лизируют по способу лизоцим-замерзание-оттаивание. Семь из 10 исследованных клонов демонстрируют ИФН-а активность порядка 75 - 500 единиц/г клеток (цитопатичный эффект восстановительного анализа).ДНК вставку одного из этих семи ИФН- продуцирующих клонов Е.со 1 НВ 101 (2- рВ 8322 (Рзт) НсЬг ИфНВ а характеризуют далее рестрикционным анализом и определением нуклеотидной последовательности, Плазмиду ДНК(НсЬг ИфНВ) получают из клона и определяют рестрикционные сайты, НсЬг ИфНВ а обрабатывают Есор, метят по концу 5 и гидролизуют ВцЩ и Рва для отщепления ненужного фрагмента около 1 кв, 1,04 кв Есог 1 ВдЦ (3 проксимальный) и 0,96 кв Есор-Вд 1 П(5-проксимальный) фрагменты выделяют электрофорезом на агарозном геле, Оба фрагмента ча:тично гидролизуют НпИ, Вар и Мво 11 соответственно и полученные продукты выделяют на 1агарозном геле в Трис-ацетатном буфере (рН 7,8),содержащем 1 мкг/мл этидиумбромида. После выстаивания радиоактивные полосы обнаруживают авторадиографиче ски, Аналогичным образом определяют Вэтом и НцА сайты на 1,04 в 3 проксимальном фрагменте.Для определения нуклеотидной последовательности Н сЬг И ФГВ а расщепля ют различными растриктазами, полученные продукты выделяют электрофорезом через 5 полиакриламидный гель в Трис-боратном-ЭДТУК буфере и экстрагируют из геля и очищают. 15Определяют последовательность нуклеотидов следующим образом; 1 и 2 - отщепление НсЬг -ИФНВ а с помощью ВцД, внесение метки, расщепление Есор и Рзт и выделение ВцП-Есой фрагмента(940 вр) 20 ("1") и Вцх-Есой(360 вр)("2"); 3 и 4 отщепление НсЬг ИФНВ а с помощью Есор, внесение метки, расщепление Вар и выделение фрагмента Есор-Взр (680 вр) ("3") и фрагмента Есор-Взр (880 вр) ("4"); 5, 6, 7 и 25 8 отщепление НсЬг ИФНВ а с помощью Рчц, внесение метки, расщепление Вци Есор и выделение Рно-Есор фрагмента (780 вр) ("5"), фрагмента Рчц-ВцЙ (215 вр) ("6"), фрагмента Рчо-ВцП (90 вр) ("7") и 30 фрагмента Рчв - ЕсоВ (290 вр) ("8");9 и 10 отщепление Нсбг ИФНВ а с помощью Есой, выделение электрофорезом на 1 агарозном геле в трис-боратномЭДТУК буфере фрагмента с 1300 вр ЕсоЮЕсоВ, дальнейшее расщепление Нпй и выделение Нп 1-Нпй фрагмента (459 вр), и фрагмента Нпй-Нпй (180 вр), внесение метки большего Нп 1-Нпй фрагмента и расщепление МЬо позволило выделить Нпй- МЬо (190 вр) ("9"). Внесение метки более короткого Нпй-НпЛ фрагмента и расщепление Ача позволило выделить Нпй- Ача фрагмента (150 вр),4511 - отщепление НсЬг ИФНВ а с помощью МЬо, внесение метки расщепление Вц и выделение МЬо -ВцД фрагмента (465 вр) ("11");12, 13 и 14 отщепление НсЬг ВФНВ а с помощью Вар м Вц, выделение электро форезом на агарозном геле как описано ранее фрагмента 1200 вр Взр-Взр(а) расщепление НцА, внесение метки, расщепление МЬо и выделение НцА-МЬо фрагмента (300 вр) ("12") и фрагмента НцА МЬо (360 вр) ("13"), или (Ь) расщепление Вата, внесение метки, расщепление Есор и выделение Вый-Есор фрагмента (380 вр) ("14"), Последовательности в различных фрагментах определяют по способу Максам-Гильберта,Сравнение последовательности нуклеотидов кодирующей области НсЬг ИФНВ а и последовательности НЫЬ (кодирующая область) показывает, что они идентичны, В частности, удивительно, что нет указания на наличие интронов внутри кодирующей последовательности НсЬг ИФ 35 НВ афрагмента, т,е. между Нпй центром в 5 некодирующей области и ЕсоВ центров в 3 некодирующей области.Содержащие гены сЬги сЬг, которые, по-видимому, идентичны по данным гетеродуплексного анализа, отличают одним ВцД сайтом, исследуют на нуклеотидную последовательность. Пять нуклеотидов отличаются в 725 основных парах. По-видимому Н 1-сЬг 3 и Н 1-сЬг 26 являются аллельными формами одного и того же гена, так как не только гены, но, по крайней мере 3,5 квр предшествующие и 6,0 квр последующие им образуют прекрасный гетеродуплекс из-за относительно небольшого отличия, которое охвтывает только изменения 2 аминокислот, Они обозначены ИФН- а 4 а(НГ-сЬг 3 и ИФН- а 4 Ь/Н 0 сЬг 26). Нуклеотидную последовательность и соответствующую последовательность аминокис- лот ИФН-а 4 в определяют по обычной методике,При этом белки, закодированные каждой из последовательностей, отличаются друг от друга примерно в 15их остатков, Такое расхождение типично для продуктов неаллельных генов, которые разошлись уже 20 - 90 миллионов лет назад,П р и м е р 13. Плазмиду 2-рВВ 322 (Рзт) (НсЬг ГИФНВ а) используют в качестве источника НИ-сЬг 35 фрагмента для экспрессии в клетках мыши, Эту плазмиду гидролизуют Рзт и обрабатывают 5 экзонуклеазой для удаления 5 бб хвостов, Затем эот фрагмент встраивают в 5 бб -Крп фрагмента плазмиды, полученной присоединением Вагп Н-Вап Н фрагментов рВЯ 322 и ДНК полинома, Полученный вектор используют для трансформации мышинных ЭТЗ клеток, Эти трансформированные клетки обозначают мышь ЗТЗ (полинома НЮ сйг 35), Спустя 20 - 40 ч определяют активность ИФН-а порядка 300 ед/мл ИФН-а на клетки человека и около 300 ед/мл на бычьи клетки,Лизаты Е.со НВ 101 инфицируют десятью гибридными лямбда-фагами и анализируют на присутствие ИФН, Семь из одиннадцати фагов (все, кроме сЬг, сЬг, сЬги сЬг) дают лизаты, содержащие ИФН с активностью в интервале от 3 до37 1764515 38 ЛТССССТСССССТТТССТТТЛСТСЛТССТССТССТССТССТСЛССТССЛЛСТСЛЛ ССТССТСТСТССССТСТСАТСТСССТСЛСЛСССЛСАСССТССЛТЛАСЛССЛССЛС СТТСАТССТССТСССЛСЛЛАТСЛССАСЛЛТСТСТССТТССТССТСТСТСЛТССЛС ЛСАСЛТСЛСТТТССЛТТТССССАССЛССЛСТТТСАТСССЛЛССЛСТТССАСЛЛСС СТССЛСССЛТСТСТСТССТССАТСАССТСЛТССЛССЛСАТСТТСЛЛССТСТТТАС СЛСЛЛЛЛСАТТСЛТСТССТССТТСССЛТСЛССЛССТССТЛСАСЛЛЛТТСТССЛСС СЛАСТСТАССАССЛССТСААТСАСТТССААСССТСТСТСЛТССЛССАССЛСАССС ТСССАСАААСТССССТСАТСЛЛТССССЛСТССЛТСТТСССТСТСЛЛСАЛАТАСТТ СССЛЛСЛЛТСАСТСТСТАТСТСЛСЛСАСАЛ("ЛЛЛТАСАССССТТСТСССТСССЛС СТТСТСАСЛССЛСЛАЛТСЛТСЛСЛТСССТСТСТТТАТСЛЛСЯЛЛСТТССАСАЛЛ СЛТТЛЛССЛССЛЛССАЛ, ТСТСЛТСТСССТСЛСЛСССАСАСССТССЛЛЛСЛСС ЛССЛССТТСЛТССТССТСССЛСАЛЛТСАССЛСЛЛТСТСТССТТССТГСТСТСТСА ТССЛСЛСАСАТСЛСТТТССЛТТТССССЛССЛССЛСТТТСАТСССЛЛССЯОТТССЛ СЛЛСССТССАСССАТСТСТСТССТССЛТСЛССТСЛТССАССЛСЛТСТ.СЛЛССТС ТТТЛССАСЛЛЛЛСЛТТСАТСТССТССТТСССЛТСЛССЛССТССТЯСЛСАЯАТТСТ ССЛСССЛЛСТСТЛССЛССЛССТСЛАТСЛСТТССЛЛСССТСТСТСЛТССЛССЛССА СЯС(",СТСССЯСЯЛЛСТССССТСЛТ(",ЯАТСССС ЛСТССЛТСТТСССТСТСАЯСЯЯЛ ТЛСТТСССААСЯЛТСЛСТСТСТЯТСТСЛСЛСЯСЛЛСЛЯЛТЛСЛССССТТСТСССТ ССОАССТТСТСАСЛССЛСЯЯЛТСЛТСЯСЛТСССТСТСТТТЛТСЛЛСЯЯЛСТТССА АСАЛЛСЛТТЛЛССЛССЯЛССАА, ТТЛСТССТСССССТССТССТССТСЛССТССЛ ЛСТСААССТССТСТСТССССТСТСАТСТСССТСАААСССЛСАСССТСССТЛССАО САССЛССТТСЛТССТССТСССЛСАСАТСАССАСАЛТСТСТСТТТТСТССТССТТС ААСОАСАСЛСАТСАСТТТССАТТТССССАССАССЛСТТТСССААССАСТТССЛЛЛ 50 ед/мл, В случае сЬги сЬг, гибридизующие (к НИ) Нпб-Нпс 3 или ЕсоВ- ЕсоВ фрагменты субклонируют в Рзт сайт рВВ 322 и экспрессируют активности ИФН- а в Е.со,Формула изобретения Способ получения лейкоцитарного интерферона, предусматривающий культивирование биологических культур, выделение и очистку целевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, в качестве биологических культур используют штамм мик роорганизма ЕзсйегсЫа со АТСС 31633или 31634, трансформированный рекомбинантными плазмидными ДНК со вставкой 2-рВВ 322(Рзт) Нс Р-206. или Е- рВВ 322(Рзт)/НсИ ЗК 35-АН 1 6 с нуклеотид ной последовательностью55 ных в 1 л воды ("РВЯ"), и добавляют при интенсивном перемешивании к 17 л 20 мМ Трис-НС (рН 7,5), 1 мМ Эдтук("ТЕ"-буфер" ), 2% додецилсульфата натрия (ДСН) в дели- тельную воронку емкостью 50 л. Прибавляют проназу к 200,и г/мл и перемешивают раствор в течение 1 ч пбои комнатной температуре. Прибавляют 10 отсч./мин,1251-глобин мРНК в качестве маркера для выделения поли/А/РНК. Прибавляют 2 М Трис-НС (рН 9) в количестве, равном 1/20 от общего объема ("1/20 объемн"), и смесь экстрагируют при энергичном перемешивании 15 л повторно перегнанного фенола в течение 10 мин. Прибавляют 3 л хлороформа и смесь перемешивают 5 мин, После 30 мин отстаивания для разделения фаз удаляют водную фазу, всего 19,1 л объединяют с 60 г ДСН. Нуклеиновые кислоты осаждают из водной фазы 1/10 объемн. ЗМ ацетатом натрия (рН 5,5) и 2 объемами этанола,После хранения в течение ночи при С осадок нуклеиновых кислот отфильтровывают через пластиковое чайное сито. Этот материал затем перемешивают с 200 мл ТНЕ (50 мМ Трис-НС 1 (рН 7,5), 100 мММаС 1, 5 мМ ЭДТУК), содержащего 0,5% ДСН, Его последовательно растворяют при добавлении еще 350 мл этого раствора, Осадок собирают центрифугированием в бутылях емкостью 1 л в центрифуге Сооволл ВСв течение 15 мин при 5000 об/мин и растворяют в 350 мл ТНЕ, содержащего 0,5% ДСН, Оба раствора ТНЕ объединяют, экстрагируют 3 раза 1 обьемом фенола, 3 раза 1/2 объема эфира и 3 раза 1 объемом эфира. Из водной фазы выделяют всего 775 мг РНК,Поли(А) РНК смеси выделяют адсорбцией на олиго(с 1 Т)целлюлозе. Прибавляют2,7 г олиго(бТ)целлюлозы к 500 мл, После перемешивания в течение часа при комнатной температуре для проведения адсорбции поли(А)РНК на олиго(бТ)целлюлозе, центрифугируют целлюлозу и смесь мРНК,связанных с ней, промывают один раз 50 мл ТНЕ и второй раз 15 мл ТНЕ. Затем связанную поли(А)РНК элюируют пятью последовательными промывками 2 мл НгО. Получают 860 р г поли(А)РНК. Надосадочный раствор РНК из первой адсорбции подвергают двум последующим циклам адсорбции, При второй и третьей адсорбциях получают 600,и г и 170,и г РН К,РНК испытывают на ЧеИФН-а активность путем инъекции в ооциты Хепорцз 1 аечз,РНК растворяют в 15 мл Трис-НС (рН 7,5), 88 мМ ИаС (ТН К буфер), чтобы получить концентрацию около 1 мг/мл. Инъецируют 50 мл этого раствора в каждые 50 ооцитов. 5 10 15 20 25 30 35404550 Ооциты инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в среде Барта. Инкубированные ооциты затем промывают и гомогенизируют пипеткой Пастера в трубке для центрифуги Эппендорфа емкостью 1,5 мл в 0,5 мл 52 мМ трис-глицеринового буфера (рН 8,9). Смесь центрифугируют в течение 2 мин в центрифуге Эппендорфа, надосадочный слой сливают и замораживают при -20 С для испытаний. Одна единица ИФН- а снижает количество вируса на пластине на 50%, Активность препарата ИФН-а выражается по отношению к известному человеческому ЧеИФН-а 69/19, Экстракт ооцитов имеет активность 30010 ИФН-а на ,и г РНК, при этом ооциты инкубируют в течение 48 ч. Для дальнейшей очистки поли(А)РНК добавляют 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) к поли(А)РНК приготовления А для связывания концентрации 5 м М ЭДТУК. Полученный раствор экстрагируют дважды равным объемом ТНЕ-насыщенного фенолом и 5 раз - равным объемом эфира, Затем его пропускают через колонку с 0,1 мл, нагре гую за 90 с до 100 С, и слоем в 13 мл с градиентом сахарозы 5 - 23%, содержащей 50 мМ ТрисНС 1 (рН 7 5), 1 мМ ЭДТУК, 02 М МаС 1, В качестве маркера добавляют 10000 спм 5- концевого 32 р-меченых фрагментов ДНК, произведенных при одновременном усвоении рВЯ 322 и эндонуклеаз Н 1 пс 111 и Рзс, Центрифугирование проводят в ЯО/40 роторе при 10 С и 35000 об/мин в течение 16 ч. Фракции (0,6 мл) собирают с градиентомЯСО коллектором при 1 мл/мин, Испытывают фракции на ЧеИФН-амРНК, их положение по отношению к Р-ДНК маркеоам, Призгпоследующем центрифугировании фракции, содержащие ЧеИФН-а мРНК, идентифицируют относительно маркеров. Фракции с активностью ЧеИФН-а мРНК содержат 80 и г поли(А)РНК, Их смешивают с 2 объемами ТНЕ, содержащего 0,5% ДСН и 0,02% поливинилсульфата (в последних приготовлениях поливинилсульфат был исключен), при этом применяют колонку с 50 ,и л олиго(с 1 Т)целлюлозы, После промывки колонки 40,и г смеси РНК элюирукт 4 промывками 0,6 мл дистиллированной воды, После осаждения этанолом РН К растворяют в 1 мг/мл в 0,5 мМ ЭДТУК,Испытание на активность ЧеИФН-а мРНК проводят, как описано выше, на порции осадка поли(А)РНК, Он имеет удельную активность 360010 интерферона/рг, Следовательно, градиент сахарозы был обогащен поли(А)РНК примерно 10-кратно по отношению к ЧеИФН-и мРНК, Получают приготовлаасталллсслтссстатсстсслталалталтссласлалтсттсллтстстт сласлслллаалстслтстастасттааалталалссстсстлалслллттстлс лсталлстстлссласласталлталсстаалласстататалтлслааааатаа аааталслалалстссссталталлаалаалстсслттстаастаталаалллтл сттсслллалАтслстстстлтсталААалаллалллтлсАасссттатасстаа алааттатслаласлалллтслталалтстттттстттатсллслллсттаслла лллатттллаллатллаалл, таталтстасстслллссслсласстааатлас лаалаалсстталтастсстааслслалталаалаллтстстсттттстсстаст таллаалсАаАсАталстттаалтттсссслаалаалатттаасллссАаттссА лллаасталллсслтссстатсстсслталалталтссласАалтсттсААтстс ттсласлслллаалстслтстастасттааалталалссстсстлалслллттст Аслсталлстстлссласласталлталсстаалласстататалтлслааааат аааааталслалалстссссталталлаалаалстссАттстаастаталааАлл тлсттсслллаллтслстстстлтсталллалаллалллтлсласссттатасст ааалааттатсАаласлаАллтслталалтстттттстттатсллслллсттасл лалллатттллаллатллаалл, лтаассстатссттттстттлсталтаасса тастаатастсластлслллтсслтстаттстстааастаталтстасстслслс сслсласстааатллтлаалаалсстталтлстсстасллслллтаааллаллтс тстслтттстсстассталлаалслалслталтттсаалттссссаласлаалат тталтаасслсслаттсслаллалстслласслтстстатсстсслталОАтадт ссласлалссттсллтстсттсласлслалаалстслтстастасттсссмсла Аасстсстлалллллттттсслсталлстттлссласллсталлталсстссгла слтататалтлслаалааттаааатааллалалстссссталталлТсТсслстс слтсстаастаталаалллтлсттсслллаллтслстстттлтстллсдалалла Аллтлсласссттатасстааалааттатслаласлазллтслталал 7 ссстст СаТТТТСЛЛСЛЛЛсттасЛЛЛАЛЛаЛТТЛЛаалааЛЛаалт, або ТСТСЛТСТ асстслалссслсласстааатллтлаалаалсстталтлстсстасллслллта ааллаллтстстслтттстсстассталлааАслалслталтттсаслттсссса Ааалаалаттталтаасслсслаттсслаллалстслласслтстстстсстссл талалталтссласлалссттсллтстсттсласлслалаалстслтстастаст таааллслаласстсстлалллллттттсслсталлстттлссласллсталлта Асстаалласлтататалтлслаалааттаааатааллалалстссссталталл татаалстссАтсстаастаталаалллтлсттсслАлаллтслстстттлтстл Аслалаллалллтлсласссттатасстааалааттатслаласлалллтс"тал САтссстстсаттттсллслллсттасллллллалттллаалааллаалт;4 Л 1764515 42 Составитель Н,КузенковаТехред М,Моргентал Корректор Е,Папп Редактор Т,Иванова Заказ 3466 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 или последовательностью, которая гибридизуется со встравкой или указанной последовательностью при следующих условиях гибридизации; предгибридизация нитроцеллюлозного фильтра, несущего ДНК-последовательность или ДНК вставку в четырехкратном буфере с 0,1% (мас,/об) фикола, 0,1% полинилпирролидона, 0,1% (мас.об,) бычьего сывороточного альбумина, 0,5% натрий додецилсульфата с 200 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68 С втечение 7 ч, а гибридизация с меченой ДНК-вставкой и ДНК-последовательностью в четырехкратном буфере фиколла (мас,/об), 0,02% поливинилпирролирона, 0,02 % (мас,/об) бычьего сывороточного альбумина, 0,5% натрий додецилсульфата, 200 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, при 68 С в течение 16 ч, ополаскивание фильтра при комнатной температуре 0,53 БОЯ, отмывка при 68 С 2 х 0,53 БОЯ с однократной заменой раствора и 3 мл основания Тризма при комнатной температуре в течение 4 ч.1764515 50 55 ление с примерно 40-кратным обогащением,- Синтез с ДНК смеси, содержащей ЧеИФН-а с ДНК.Поли(А)РНК, обогащенную ИФН-а м Р Н К, испол ьзуют в качестве шаблона (модели) для получения однониточной комплементарной ДН К (сДН К), 800 и л реакционной смеси содержит 40 мМ Трис-НС (рН 7,5), 30 мМ МаС 1, 5 мМ МцС 2, 0,5 мМ ДТТ, 20 мг/мл олиго(бТ)12 - 18, 5 мМ бОТР, бСТР и бТТР, 5 мМ 32 Р-бАТР (НЕН, удельная активность 10000 спм/нмоль), 60 мг/мл поли(А)РНК и 280 ед, обратной транскриптазы. После инкубации в течение 1 ч при 37 С прибавляют 0,5 М ЭДТУК и 20% ДСН (перекристаллизованного) к 10 мМ ЭДТУК и 0,1% ДСН, Смесь экстрагируют 1.объемом фенола (перегнанного), Фенольную фазу промывают 200,и л 200 мМ Трис-НС (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК и 0,1% СДН, объединяют водные фазы. Их экстрагируют равным объемом эфира и хроматографируют на колонке с 5 мл Сефадекс 0-100 в ТНЕ. Собирают фракции по 0,1 мл при 0,3 мл/мин, Фракции, показывающие радиоактивность (как измерено по радиации Черенкова), объединяют и прибавляют ЗМ. Нуклеиновые кислоты осаждают 2,5 объемами этанола. Послехранения в течение ночи при -20 С образцы центрифугируют, отбрасывают надосадочный слой. Осадок растворяют в 180 р л дистиллированной воды и переносят в силиконизированную трубку Эппендорфа, Прибавляют 20 ,и л 5 МКаОН и хранят смесь при комнатной температуре в течение 40 мин, Прибавляют 20 мл 5 М ацетата натрия, 100 мл дистиллированной воды и 500 мл этанола, После охлаждения в течение ночи при -20 С собирают полученный осадок центрифугированием при силе, эквивалентной 10000- кратной силе тяжести (10000 хц) в течение 20 мин при 0 С, Выход однониточной сДНК составляет 10,иг,Однониточный продукт сДНК находится в реальной сложной смеси большого числа различных сДНК, транскрибированных из соответствующих мРНК, имеющихся в смеси поли(А)РНК, Только очень немногие из этих сДНК имеют отношение к ИФН-а, например НРАЙ-асДНК,Определяют размеры различных однониточных сДНК с помощью электрофореза малого на щелочном 2%-ном геле агарозы с использованием 30 мМ МаОН, 2 мМ ЭДТУК в качестве электролита, Р-сДНК имеетзгдлину 600 - 1000 нуклеотидов, относящихся к однониточному глобину СДНК,Р-меченые фрагменты ДНК используют в качествемаркеров размера.П р и м е р 2, Однонитевую сДНК превращают в двунитевую при обработке ДНК5 полимеразой 1. Осажденную однонитевуюсДНК растворяют в 200 и л Н 20, нагретой до100 С, в течение 2 мин и инкубируют в500 и л 0,1 М нагретого денатурированногокалийфосфатного буфера (рН 6,9) 10 мМ10 МцС 12, 10 мМ ДТТ, 1 мМ каждого из бАТР,ббТР и бСТР, 1 мМ Н-бТТР (Н ЕН, удельнаяактивность 100000 спм/нмоль) и 150 ед,/млЕ=со 11 ДНК полимеразы 1, После 6,5 ч при15 С прибавляют 0,5 ЭДТУК и 20% ДСН к 1015 мМ ЭДТУК и 0,1% ДСН, Затем смесь экстрагируют 500,ил фенола, фенольную фазу повторно экстрагируют 250,ил 20 мМ Трис-НС 1(рН 7,5),5 мМ ЭДТУК(ТЕ буфер), Обе водныефазы объединяют и хроматографируют на20 колонке с 5 мл Сефадекс 6-100 в тех жесамых условиях, Прибавляют ЗМ ацетат натрия к 0,3 М и 2,5 объемам этанола, смешивают для осаждения ДНК. Всего собирают13,иг ДНК,25 ДНК обрабатывают нуклеазой.1. Осажденную ДНК растворяют в 250 мл буфера(0,2 М ИаС 1, 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5),10 мМ сульфата цинка и нагревают при 37 Св течение 30 мин. Прибавляют 1,5 рл ЯЗО фермента (11 единиц/,ил), смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин. ПрибавляютДСН и ЭДТУК к 0,1% ДСН и 5 мМ ЭДТУК иэкстрагируют смесь 250 мл фенола. Фенольную фазу промывают 100 оТЕ буфера, Объ 35 единяют водные фазы и хроматографируютна колонке с Сефадексом 0-100 в ТНЕ, собирают фракции по 0,1 мл при скорости 0,3мл/мин и определяют радиацию Черенковадля каждой фракции, После осаждения из40 этанола и ацетата натрия собирают 8 р гдвойной спирали ДНК,П р и м е р 3, Обрабатывают плазмиду(в частности, рВЯ 322) эндонуклеазой Рзс 1 идобавляют бОМР хвосты концевой трансфе 45 разой. бОМР добавляют к 5 концу плазмиды для регенерацииРзт 1 сайта и лигируют с сДНК фрагментом, несущим комплементарные хвосты, Двунитевую сДН К удлиняют при добавлении бСМР хвостов к 3 концевому. Затем плазмиду и сДНК обрабатывают лигазой, чем обеспечивается введение сДНК в подходящий сайт плазмиды и получение гибридной ДНК,П р и м е р 4, Плазмиду рВВ 322 (20 г) гидролизуют 21 единицами Рзт 1 эндонукле азы в 150 мл 10 мМ Трис-НС 1(рН 7,5), 6 мМ МцС 12, 50 мМ КаС 1, 6 мМ МцС 12, 50 мМ КаС 1, 6 мМ 2-меркаптоэтанола,200 мг/рл бычьего сывороточного альбумина (БСА), После 2 ч55 при 37 С смесь экстрагируют 1 объемом фенолхлороформной смеси (1:1) и 1 обьемом эфира и осаждают этанолом,Добавление гомополимерных хвостов бСМР с помощью терминальной деоксинуклеазидтрансферазы (ТОТ) осуществляют в 328 мл реакционного объема, содержащего 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 10 мМ КаНгРОд, 5 мМ МцС 2, 1 мМ бОТР, 50 мг/мл БСА и 3 - 6 ед. ТбТ(очищенного как указано выше) на 1 мг ДНК. Инкубируют при 37 С в течение 20 мин, Прибавляют ЭДТУК к 10 мМ, смесь экстрагируют как указано выше и диализуют два дня против буфера ТНЕ.Двунитевую ДНК удлиняют остатками ЗАСМР по стандартной методике, Инкубируют 150 мл двунитевой сДНК, описанной выше, а 8 ил 100 мМ какодилата натрия (рН 7,2), 2,5 мМ СоС 2, 50 рг/мл БСА, 0,2 мМ бСТЯ, содержащего 3 - 6 ед, очищенного ТОТ на мг ДНК, в течение 8 мин при 27 С, а затем замораживают при -20 С,Инокулируют одну колонию Е,со Х 776 в 100 мл триптоновой среды с добавкой 100 и г/мл диаминопимелиновой кислоты, 10 ,и г/мл налидиксовой кислоты и 10,иг/мл тетрациклина, Выращивают культуру при 37 С до кажущейся оптической плотности 0,6 при 650 нм (ОДюо) и охлаждают на льду в течение 30 мин, Затем культуру седиментируют при 4000 об/мин в роторе, клетки промывают 50 мл 10 мМ КаС, отделяют на центрифуге и повторно суспендируют в 20 мл 100 мМ СаСг. Суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифугируют и снова суспендируют в 4 мл 100 мл 100 мМ СаС 2 и хранят на льду в течение ночи для использования, Аликвоты (0,5 мл) хранят замороженными при -70 С.Смешивают 3 нг ЗАСМР-удлиненной ДНК с 22 нг ЗАСМР-удлиненной Рзт , обработанной рВВ 322 в 50 мл ТНЕ-буфера, Инкубируют при четырех последовательных стадиях при 65, 46, 37 и 20 С, Прибавляют 20,ил 100 мМ Трис-НС (рН 7,5), 100 мМ СаС 2, 100 мМ МцСг и 50,ил ТНЕ буфера, смесь охлаждают на льду 20 мин,Рекомбинантные молекулы РНК добавляют к 100,ил обработанных Са клеток Е,со и смесь охлаждают на льду в течение 20 мин, нагревают до 20 С в течение 10 мин и прибавляют 0,6 мл триптоновой среды, Смесь помещают на 2 пластины с триптоновой агаровой средой, подготовленные как описано ранее. Эффективность трансфекции составляет 3,3 10 колоний на,иг зака 4ленной рВВ 322 трансфецированной ДНК, нативная рВВ 322 дает 3 10 колоний на,иг,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Так как плазмида рВЯ 322 включает ген устойчивости к тетрациклину, Е,со реципиент, который был трансформирован плазмидой, будет расти в культуре, содержащей такой антибиотик, в отличие от нетрансформированных таким образом бактерий, Следовательно, рост в тетрациклиновой культуре позволяет провести селекцию организмов-хозяев, трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК или рециклизованным вектором.После 48 ч при 37 С пикируют индивидуальные колонии и суспендируют в 100 мл триптоновой среды (подготовленной, как описано выше) в углублениях микротитерных пластин, После инкубации при 37 С в течение ночи в каждом углублении смешивают 100 мл 40-ного глицерина, Пластины выдерживают при -20 С и готовят набор из 100000 индивидуальных клонов трансформированной Е,со Х 1776,П р и м е р 4. Рекомбинантные молекулы ДНК расщепляют, денатурируют и гибридизируют с лейкоцитами поли(А)РНК, содержащими ИФН-амРНК . Гибриды рекомбинантных молекул ДН К-поли(А)Р Н К отделяют от негибридизированной поли(А)РНК (стадия С). Поли(А)РНК выделяют из гибридов и очищают(стадия Д), Выделенную РН К испытывают на активность ИФН-амРНК (стадия Е). Смесь полученных рекомбинантных молекул ДНК содержит рекомбинантную молекулу ДНК с последовательностью нуклеотидов, способной гибридизироваться с поли(А)РНК в жестких условиях гибридизации, а также вызывает образование ИФН-ав ооцитах, Если группа из 512 клонов дает положительную реакцию, клоны перегруппировывают в 8 партий из 64 и каждую партию испытывают, Этот процесс продолжают до тех пор, пока не будет идентифицирован единичный клон, Однако полученные рекомбинантные клоны не содержать полную последовательность с ДНК ИФН-а,Бактериальные клоны инокулируют на агаровые пластины с триптоновой средой, После инкубации при 37 С каждый клон разрастается в колонию несколько миллиметров в диаметре. Все колонии отмывают с пластин и собирают, получают инокулум, использованный для инокулирования 1 л триптоновой среды, заполнившей, как описано выше, 2 л колбу Эрленмейера, Культуру встряхивают при 37 С до появления ОДеы примерно 0,8 (оценено визуально). Один объем триптоновой среды и хлорамфеникола до 170,иг/мл прибавляют к культуре, которую снова встряхивают при 37 С в течение 16 ч. Прибавляют 20 мл хлороформа45 50 55 и культуру снова встряхивают 10 мин при 37 ОС, чтобы удалить бактерии, Культуру декантируют с хлороформом, клетки собирают центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин при 4 С, Полуцают примерно 1 - 2 г клеток из каждого литра рецептуры. Клетки суспендируют в 30 мл 20 мМ Трис-НС (рН 7,5), центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин и 4 С, повторно суспендируют в 30 мл 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), Прибавляют 0,25 объема раствора лизоцима (10 мг/мл в 50 мМ Трис-НС (рН 7,5, после охлаждения в течение 10 мин при 0 С прибавляют 0,33 объема (считая на объем исходной суспензии 50 мМ Трис-НС-культур), 0,5 М ЭДТУК(рН 8,0), осторожно перемешивают без встряхивания, Еще через 10 мин при 0 С прибавляют 1/16 объема (снова считая на первоначальный объем) 2% Тритона Х, Через 60 мин образец центрифугируют в течение 60 мин при 1000 об/мин и 0 С в роторе. Надосадочный слой переносят в лабораторный стакан с магнитной мешалкой и прибавляют 3 М КаОН при перемешивании до тех пор, пока не будет достигнут рН 12,5, измеряя при 20 С, используя стеклянный электрод и рН-метр, стандартизированный стандартным карбонатным буфером Бекманн рН 10 (К. 3505), После перемешивания в тецение 10 мин при 20 С устанавливают рН 8,5, После еще 3 мин перемешивания прибавляют 1/9 объема 5 М КаС и 1 объем фенола (перегнанного и уравновешенного 9,5 М КаС) и интенсивно перемешивают еще 5 мин. Разделяют фазы центрифугированием при 10000 об/мин при 0 С в течение 10 мин, Надосадочный слой, содержащий форму 1 ДНК (круговая двуниточная ДНК), осторожно удаляют из промежуточной фазы (которая содержит однониточную ДНК) и 3 раза экстрагируют хлороформом, (Фенол должен быть полностью удален на этой стадии), Фракция 1 ДНК содержит рекомбинантные молекулы ДНК (рВР 322-сДНК вставка), первоначально использованные для трансформации этих клеток организма- реципиента, которые образуют часть 512 клонов, выбранных для испытания.Прибавляют панкреатическую РН Казу А (5 мг/мл), предварительно нагретую в течение 10 мин при 85 С) к форме 1 ДНК до концентрации 20 и г/мл и инкубируют смесь в течение 60 мин при 37 С. Прибавляют 1/5 обьема 5 М КаС и смесь обрабатывают 30% полиэтиленгликолем 6000 до окончательной концентрации 7,5% ПЭГ, После 2 - 16 ц.при -10 С собирают осадок в роторе в течение 20 мин при 8000 об/мин и 0 С, растворяют в 0,075 М КаС, 0,0075 М цитрата натрия до поглощения 20 при 260 нм и доводят до 5 10 15 20 25 30 35 40 0,5% ДСН. Раствор инкубируют 30 мин при 37 С с 0,5 мг/мл проназы (20 мг/мл, 2 ч при 37 С) и 3 раза экстрагируют 1 объемом перегнанного фенола и 2 раза 1 объемом хлороформа, Центрифугируют образец (до 2 мл раствора ДНК на 1 мг/мл) при градиенте сахарозы от 5 до 23% в 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК в течение 15 ч при 21000 об/мин и 15 С. Собирают фракции и контролируют ОД 26 о Собирают фракции, содержащие ДНК, и осаждают ДНК ацетатом натрия и этанолом. Собирают центрифугированием 20 - 100,иг смеси ДНК.20,иг ДНК обрабатывают в 150 рл 10 мМ Трис-НС (рН 7,5), 6 мМ М 9 С 2, 50 мМ КаС, б мМ 2-меркаптоэтанола, 200,иг/мл БСА или желатина и 20 единиц Нпб , Эндонуклеазой Нпсрасщепляют плазмиду рВЯ 322, После 2 цасов при 37 С аликвоты (1%) подвергают электрофорезу на 1% агарозном геле в 50 мМ трис-ацетате (рН 7,8), 2 мМ ЭДТУК в течение 1 ч при 50 мА, чтобы удостовериться о завершении рестрикции. Если обработка не закончена прибавляют еще Нпби продолжают инкубацию еще 2 ч. Когда ДНК полностью расщеплена, прибавляют проназу, ЭДТУК и ДСН в количестве 0,5 мг/мл, 10 мМ и 0,5% соответственно, После 30 мин при 37 С раствор экстрагируют 30 мл смесью фенол/хлороформ (1:1). Промывают 50,ил р-ра 20 мМ Трис-НС (рН 7,5), 1 мМ ЭДТУК, объединенные фазы экстрагируют 3 раза эфиром, фильтруют через колонку 0,1 мл, обработанную ЭДТУК, и осаждают 1/10 объема ацетата натрия и 2,5 объемами этанола, После хранения в течение ночи при -20 С ДНК собирают центрифугированием,Готовят две гибридизирующие смеси, Смесьсодержит 4,ил 10-кратно концентрированного буфера (4 М КаС, 0,1 П 1 ПС (рН 6,4, 1,4-пиперазиндиэтансульфокислота),50 мМ ЭДТУК,.0,5,ил (около 5 нг " -глобин мРНК (5000 спм) и б мл индуцированной лейкоцитарной поли(А)РНК (2,иг/рл). Смесьсодержит 10 иг обработанной НпсДНК и 0,1 рг Ряс-Е-рВВ 322 (НЗ)Вс фЗ 4,13 ДНК (производная рВ 8322, которая содержит последовательность Р-глобина в Нпссайте), Обе смеси сушат в парах газообразного азота, Прибавляют 40 мл 80% формамида к остатку смесии денатурируют раствор в течение 10 мин при 100 С и быстро охлаждают на льду. Денатурированный раствор используют для растворения смеси , а полученный раствор инкубируют при 56 ОС в течение 4 ч,После разбавления до 1 мл холодным 0,9 М КаС, 0,09 М цитратом натрия и 100%ным формамидом до 4(по объему), раствор фильтруют при 0,5 мл/мин черезфильтр Миллипор (размер пор 0,45 мм), сначала фильтр испытывают на его способностьудерживать гибриды ДНК/РНК, потому чтоне все фильтры, полученные от производителя, в равной мере эффективны,Погружают указанный выше фильтр сгибридами поли(А)РНК в 1 мл 0,15 М ИаС,0,015 М цитрат натрия, 0,5 ДСН в течение10 мин при 37 С, промывают 50 мМ ТрисНС (рН 7,5), 10 мМ М 9 С 2, 2 мМ СаС 2 ипомещают в 0,6 мл свежего буфера. Добавляют 5 и л ДНКазы, обработанной иодацетатом (5 мг/мл), Фильтр инкубируют при 37 Св течение 10 мин, Удаляют фильтр и экстрагируют раствор 1 объемом фенола и 1 объемом эфира и пропускают через колонку с 0,1мл, Прибавляют к раствору 5,иг РН К-носителя (РНК очищенных дрожжей) и осаждаютРНК ацетатом натрия и этанолом, Осадоксобирают центрифугированием и ри10000 хо, растворяют в 100 мл 1 мМ ЭДТУК,нагревают 90 с и ри 100 С и прибавляют ТН Еи ДСН до 2 ТНЕ и 0,5/ДСН, АдсорбируютРНК на колонке с 100,иг олиго ОТ/целлюлозы, элюируют четырьмя промывками 0,3 млдистиллированной воды и осаждают ацетатом натрия и этанолом. После 16 ч при -20 Сосажденную РНК отделяют центрифугированием и растворяют в 2 мл буфера ТНК.Раствор поли(А)РНК, полученный ранее, инъецируют в 40 ооцитов (примерно 5нл в ооцит). Ооциты инкубируют при 23 С втечение 24 - 48 ч, гомогенизируют и центрифугируют (или инкубируют собранную среду) и испытывают, как описано ранее дляИ Ф Н-а.Проводят большинство последующихопытов с рекомбинантной молекулой ДНКиз одного клона с ДНК, связанной с бумагойДВМ или ДРТ, Бумага ДРТ дает меньшийфон,Листы ватмановской бумаги 540 (20 г)перемешивают 16 ч при 20 С со смесью 70мл 0,5 М ИаОН, 2 мг/л ИаВН 4 и 30 мл 1,4-бутадиендиглицидилового эфира. Затем бума"гу переносят в раствор 10 мл2-аминотиофенола в 40 мл ацетона и перемешивают 10 ч. Отмывают ацетоном, 0,1н.НС, Н 20, 0,1 н,НС, Н 20, сушат, БумагуАРТ диазотируют до бумаги ДРТ.ДНК (до 15,иг) связывают на 50 ммдиазотированной АВМ (ДВМ) или диазотированной АРТ (ДРТ) бумаги,Гибридную плазмиду ДНК гидролизуютРзт, обрабатывают 500,иг проназы на мл0,5 ДСН и 10 мМ ЭДТУК в течение 30 минпри 37 С, экстрагируют фенолом и эфиром,пропускают через колонку 0,1 мл и осажда 55 П р и м е р 6, Так как первичные клоны из трансформированных клеток иногда содержат более одного вида рекомбинантных молекул ДНК, НЮс выделяют из Е,со Х 776 (НЮС) клонов и очищают. Образцы НЮС и рВВ 322 гидролизуют Рз 1 и аналиют этанолом. Инкубируют денатурированную нагреванием ДНК (до 5,иг с малымиколичествами добавленной Р-ДНК в качестве метки) при 0 С в течение ночи с 1 см5 бумаги ДВМ или ДРТ в 200,ил 25 мМ калийфосфатного буфера (рН 6,5), фильтры промывают 3 раза по 5 мин при комнатнойтемпературе 50 мМ калийфосфатным буфером (рН 6,5), 14 глицина и 3 раза 99-ным10 перекристаллизованным формамидом. Далее инкубируют в 99 формамиде в течение2 мин при 68 С, потом 3 раза промывают в50 мМ калийфосфатном буфере (рН 6,5) при20 С и два раза промывают в 0,4 М чаОН15 при 37 С в течение 10 мин. На фильтрахостается около 40 - 60 радиоактивности,Фильтры инкубируют 3 ч при 38 С в предварительно гибридизованной среде А, заполненной 1 глицина, используя 330 рл на20 фильтр. Среда А содержит 50 формамида,5 хССК, 0,4 поливинилпирролидона, 0,04фикола, 0,1 ДСН, 25,иг поли(А) (Р и Л) и 100,иг дрожжевой РН К/ВДН, экстра гированная6 раз фенолом и осажденная этанолом,25 Фильтры дважды промывают в среде А, азатем гибридизуют в течение 16 ч при 38 С(поли(А)РНК, как указано, обычно 5 - 8 мг) всреде А в парафиновом масле. ПрибавляютРНК следующим образом; один влажный30 фильтр ДНК промокают и кладут в стерильную чашку Петри, 20 - 40,ил раствора РНКнаносят пипеткой на этот фильтр, а второйфильтр ДНК (или дубликат или контроль)кладут на верх и сэндвич покрывают сте 35 рильным парафиновым маслом, После гибридизации фильтры последовательнопромывают в среде А (2 раза) в растворе,содержащем 1 хССК, 0,2 ДСН, 1 мМ ЭДТУК(3 раза, 10 мин при 20 С каждый, среде А (240 ч при 38 С) и в 50 формамиде,5 хССК,0,1ДСН (3 раза, 10 мин при 20 С). Гибридизованную РНК элюируют при нагревании втечение 1 мин при 100 С в 200/сл 10 мМТрис-НС (рН 7,4), 1 мМ ЭДТУК и 0,1 ДСН.45 Отбирают клон Ш-С, который содержит рекомбинантную молекулу ДНК, способную ги 6 ридизо вать И Ф Н-а и Р Н К.Рекомбинантная молекула ДНК в этомклоне обозначена: 2-рВВ 322(РэйНсР 50 4 с/НОс), а бактериальный штамм, содержащийй ее: Е,со Х 776 (7-р В 8322) Рз 1Н с Р 04 С(Е.со Н Юс),1764515 14 13 зируют электрофорезом на 1% агарозном геле.Е.со НВ 101 трансформируют НЫС ДН К, Отбирают 6 клонов трансформированных бактерий, стойких к тетрациклину, выделяют из них ДНК, очищаюти анализируют с помощью Рзт гидролиза, электрофорезом на агарозном геле, Одну ДНК обозначают Е-рВЯ 322/Рвт (НсРс (НЫС) и используют.НОС и вставку гибридизуют с ИФН-а и РНК, подвергают гидролизу 125 единицами Раб, эктрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом, Аликвоту (10,иг растворяют в 100,ил 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), пропускают его через 0,1 мл колонку и обрабатывают его 0,6 единицами бактериальной щелочной фосфатозы в течение часа при 65 С, Добавляют 10 кратно концентрированный буфер ТНЕ (40 мл) и раствор экстрагируют 3 раза 1 объемом фенола и 3 раа 1 объемом хлороформа, ДНК осаждают 2 объемами этанола при -20 С в течение ночи и собирают центрифугированием. Для дальнейшей очистки образец в 0,5 мл ТНА адсорбируют на 0,25 мл ДЕАЕ целлюлозы, которую предварительно промывают 2 мл 150 мМ ИаС, 50 мМ Трис-НС (рН 7,5), 2 мМ ЭДТУК (НЕТ-буфер), промывают 2 мл НЕТ буфера, элюируют 0,4 мл 1,5 М чаС, 20 мМ Трис-НС (рН 7,5), 2 мМ ЭДТУК и осаждают этанолом, ДН К инкубируют с у Р-АТФ (удельная активность около 5000 кюри/ммоль) и поли нуклеотидкиназой, и очищают хроматографически на 3 мл колонке Сефадекс 0-50 в ТНЕ. Элюированные фракции собирают и осаждают Р-ДН К этанолом./мл48 ч инкубации, анализ по снижению цитопатическо сДНК остав ценоч й вы ьзую льных е мол имеющие родственные вДНК,Описанные выше 6клона, составляющихдробят на миллипористометр 8 см), помещаютнадобавкой диаминопимелналидиксовой кислоты и в рекомбиляет только ного размеше очищент в качестве клонов, соекулы ДН вки гисридн 4 бактериальныхподгруппу А-,й мембране (диапластин ку а гара (с линовой кислоты, тетрациклина, как К,) 1 мкг этой РНК дает 4600Надосадочный ооцит посэффекта П р и м е р 7, Вставка нантной молекуле Н 1-4 с с около 320 вр или треть от о ра ИФН-амРНК. Описаннь ный фрагмент НОс испол зонда для отбора бактериа держащих рекомбинантны Смешивают 90,иг немечен ной расщепленной Рзт Н 1-4 с ДНК с 6 10 дпм Р-ме 5 32ченной расщепленной Рзт НФс ДНК и роводят электрофорез через 10 х 20 х 0,7 см, 5 2% горизонтальный агарозный гель в 50 мМтрис-ацетатно го буфера (р Н / 7,8), испол ьзуя гель 2,5 см. Пленку на геле экспонируют Х-лучами и определяют положение фрагмента 320-вр. Полосу геля, содержащую ра диоактивную полосу (1,3 10 дпм),вырезают, измельчают, продавливая через 2 мл пластиковый шприц, и экстрагируют в течение ночи при 4 С при перемешивании 10 кратным по отношению к объему геля 15 объемом буфера НЕТ. ДНК адсорбируют на0,1 мл колонке гидроксиапатита, предварительно промытой 1 мл НЕТ буфера. Колонку промывают 1 мл 0,1 М калийфосфатного буфера (рН 7,5) и элюируют ДНК 0,2 мл 1 М 20 калийфосфатного буфера(рН 7,5). Элюатразбавляют 10-кратным объемом стерильной дистиллированной воды и адсорбируют ДНК, и элюируют из ДЕАЕ, осаждают этанолом. Такая ДНК называется "НЛс фраг мент". Фрагмент Н 0-4 с (120 нг) связывают сбумагой ДРТ (0,5 х 0,5 см), Для контроля 120 нг фрагмента Р-глобина сДНК обрабатыва ют с Нпбиз гибридной плазмиды Вср0-4,13 Е-рВЯ 322 и обрабатывают аналогично, Гибридизацию двойных фильтров к поли(А) РНК (В 20 мкл), промывку фильтров и выделение РНК с фильтров проводят как 35 описано выше. После введения в ооцитыопределяют следующие значения активности ИФН-а:40 45 50 указано выше) и инкубируют в течение 24 ч при 37 С. Фильтр помещают на 0,75 мл каплю 0,5 М раствора ИаОН и через 2 - 3 мин переносят на бумажное полотенце, чтобы удалить избыток жидкости, эту стадиют повторяют. Фильтр нейтрализуют, используя буфер 1,5 М Трис-НС 1 (рН 7,5) и промывают смесью 1,5 М МаС 1-0,5 М Трис-НС 1 (рН 7,4) и высушивают на воздухе, Фильтр окунают в 0,3 М раствор КаС 1, высушивают на воздухе и нагревают в вакууме 2 ч при 80 С.Фрагмент НЫс Рзт(30 нг) метят изотопом Р посредством трансляции метки, используя ф Р МАТФ и а Р с 1 ЦТФ (удельная активность, 40 Кюри/ммоль для каждого), Фильтр, несущий Лколонии, предварительно гибридизуют в 4 х СЕТ (СЕТ-это 0,15 М МаС 1, 30 мМ Трис-НС 1 (рН - 8), 1 мМ ЭДТУК), 0,1% (вес/объем) фиколла, 0,1% поливинилпирролидина, 0,1% (вес/объем) альбумина бытьей сыворотки (АБС) 0,5% ДСН и 200 мкг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося в течение 7 час при 68 С и гибридизуют с 2,10 срм меченого Р фрагмента НОс в 4 х СЕТ, 0,02% (вес/объем) фиколла, 0,02% поливинилпирролидина, 0,02% (АБС, 0,5% ДСН и 2300 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосоля при 68 С в течение 16 час), Фильтр промывают смесью СЕТ,5% ДСН при комнатной температуре, промывают 2 х СЕТ,5% ДСН в течение 5 ч при 68 С, заменяя один раз раствор, и 3 мМ основания Тризма при комнатной температуре в течение 4 ч, заменяя один раз раствор, После высушивания фильтра рентгеновскую пленку экспонируют этим фильтром в течение 80 ч, применяя экран. Три колоннии дают сильный положительный сигнал, а именно ЛО Л1-2 Н и Л-4 с, и две колонии - слабый сигнал, а именно Л-1 Е и Л-30. лМалые культуры готовят из родственных Н 1-4 с клонов, форму 1 ДНК очищают, расщепляют с Рзс и анализируют посредством электрофореза на геле агарозы, Все формы 1 ДНК создают большой фрагмент (плазмидная рВВ 322 функциональная группа) и малый фрагмент (гибридная вставка), Молекулы рекомбинантной ДНК Л-2 Н содержат наиболее крупную вставку, а именно приблизительно 900 млрд.ч, Эту молекулу рекомбинантной ДН К обозначают 2-рВЯ 322 (Рз 1)/НС 1 РН/(НОН), а ее вставку "Н 0-2 Н фрагмент",Определяют спсообность НОН связывать ИФН-амРНК посредством гибридизации по отношению к поли(А) РНК (0,3 мкг/мкл). 5 10 15 20 25 30 35 В последующем эксперименте готовят дополнительньй набор клонов Е,со, содержащих молекулы рекомбинантной ДНК, и определяют гибридизацию колоний к меченому фрагменту НЮс, Для того, чтобы обеспечить высокий выход плазмид с длинными вставками сДНК, часть меченной Р лейкоцитной сДНК, полученной энзиматически из лейкоцитной поли(А) РНК, фракционируют по размеру посредством центрифугиования через градиент плотности сахарозы, ипользуя методику, аналогичную описанной для центрифугирования поли(А) РНК. Фракции, содержащие сДНК, со скоростью седиментации, соответствующей 600 млрд.ч. фрагмента ДНК или более, объекдиняют и после осаждения этиловым спиртом выделяют сДНК. Эту сДНК удлиняют остатками с СМ Р, р В 8322, удлиненную сОМР, расщепляют Рзб и гибридную ДНК используют для трансформации штамма Е.со Н В 101. Бактерии наносят на миллипористые фильтры диаметром 8 см, помещают на пластинки агара триптоновой среды (содержащие 10 мкг/мл тетрациклина) и выращивают, пока не появляются малые колонии, Фильтр реплики готовят прессованием свежего, влажного миллипористого фильтра на фильтр, содержащий колонию, помещают его лицевой стороной наверх агаровой пластины, содержащей 4,4% глицерина, и инкубируют его, пока не появились малые колонии, Этот содержащий колонии фильтр покрывают дополнительным милли- пористым фильтром, замораживают при С и хранят, Готовят 18 фильтров, содержащих в общем около 5000 колоний, Одну реплику каждого фильтра используют для гибридизации к меченому Р Рзс НИс фрагменту ДНК. На авторадиограмме идентифицируют около 185 положител ьн ых колоний, которые субклонируют на миллипористых фильтрах и идентифицируют повторно посредством гибридизации, 95 клонов, дающих наиболее сильный отклик гибридизации, обозначают от 2-рВВ 322 (Рзт)/Нс 1 Р-ЯК до ЯМ 95 и используют для дальнейших исследований,Очевидно, при наличии способности НГпродуцировать полипептид, проявляющий иммунологическую или биологическую активность ЧеИ Ф Н, Н ОЬ и другие родственные последовательности оснований ДНК, могут применяться в этом способе отбора клонов, содержащих последовательности основания ДНК, кодирующих интерферон а 2.П р и м е р 8, Расщепленный фрагмент 2 р В В 322(НЗ)Рсфср 4,13 динатурируют в смеси 10 мкл 800 (об.) деионизированного формамидамМ буфера Пайпес (рН 6,4) в течение 10 мин при 80 С, Раствор добавляют в трубку Эппендорфа, в которой высушивают смесь лейкоцитной поли(А) РНК (5 мкг), КаС (4 мкмоль) и ЭДТУК (10 нмоль), Смесь нагревают в течение 7 ч при 48 С под слоем парафинового масла, охлаждают и разбавляют 20 мкл воды. Два ообразца разделяют на равные части и каждую из них нагревают 30 с при 100 С, Нуклеиновые кислоты осаждают этанолом, растворяют в 3 мкл воды и анализируют на активность ИФН-а мРНК в ооцитах.При гибридизации Н 1-2 Ь поли(А) РНК ингибируется трансляция ИФН-а мРНК в поли(А) РНК; после денатурирования гибрида, ИФН а мРНК снова может транслироваться, Этот эксперимент подтверждает, что НЛЬ содержит последовательность, комплементарную к ИФН-амРНК.Получают плазмидную ДНК и обрабатывают различными рестриктазами за исключением того, что альбумин бычьей сыворотки в ферментном буфере заменяют на 200 мкг-мл желатина,Леаниризованную ДНК (20 мкг) экстрагируют фенолом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 0,05 М растворе буфера Трис-НС (рН 8) и пропускают через неболь шую колонку Челекс. Фрагменты с 5- липкими концами дефосфолируют путем обработки с 0,2 единицами телячьей кишечной щелочной фосфатозы на пмоль концов 5 ДНК в 200 мкл 0,02 М раствора Трис-НС 2 (рН 8) в течение 60 мин при 37 С, Фермент дезактивируют нагреванием при 65 С в течение 60 мин. Для фрагментов ДНК с 3-липкими концами используют бактериальную щелочную фосфатазу, с тем исключением, что инкубируют при 65 С в течение 30 мин, фосфорилировэнную ДНК очищают путем адсорбции и элюирования с ДЕАЕ-целлюлозы или подвергают полиакриламидному гельэлектрофорезу, Фрагменты, выделеные из геля полиакриламида (или агарозы) в 0,15 М растворе КаС, 0,05 М-Трис-НС (рН 8), адсорбируют на 0,1-миллилитровой оксиапатитовой колонке, промывают 4 раза 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера (р Н 7) и элюируют 0,3 мл 1 М калий-фосфатного буфера (рН 7), Раствор разбавляют десятикратно, и адсорбированную на ДЕАЕ-целлюлозе ДНК выделяют,После осаждения этиловым спиртом ,ЦНК метят 5-терминально с помощью ф Р 5 АТР(12 - 34 мкКюри на пмоль 5-концов ДНК), а полинуклеотидную киназу ДНК не денатурируютдо реакции кинэзы, Получают 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 удельные активности 1 - 1,5 мкКюри Р фосфата на пмоль концов-ДНК,Для определения последовательности аминокислот меченые. фрагменты расщепляют вторым ограничивающим ферментом, и продукты выделяют электрофорезом через 5 оь-ный полиакриламидный гель в буфер трис-борат-ЭДТУК, Целевые фрагменты экстрагируют из геля и очищают. Различные фрагменты для определения последовательности аминокислотных остатков готовят следующим образом;1) расщепление НИЬс помощью ВЯр, выделение ВЯр-ВЯри ВЯр-ВЯрпосредством гель-электрофореза через 5;4 полиакрламида в буфере Доенинга;2) расщеплеие Н 1-2 Ь с помощью ВЯр, введение метки, расщепление с помощью Рзс, выделение Взр-Рзт 1-83 и ВЯр-Рзс 1-227;3) Расщепление НПЬ с помощью ВдЦ, введение метки, расщепление с Рз, выделение Вдх-Рзс 1-336 и Вд-Рзс 1-570;4) расщепление НЛЪ с помощью МЬ 011, введение метки, гидролиз с помощью Рзс 1 и Нпс, расщепление фрагмента рВВ 322, 350 млрд,ч., выделение МЬо 11-Рзс 1-519 и МЬо 11-Рзт 1-351;5) Расщепление Н 1-2 Ь с помощью Есой 1, введение метки, расщепление с Рзс 1, выделение Есой 1-Рзт 1-707 и Есо ВР зт;6) расщепление Н.-2 Ь с помощью Рзс 1, введение метки, расщепление с ВцД, выделение Рз 11-ВдПи Рзт 1-Вд;7) расщепление Н 1-2 Ь с Ача, введение метки, расщепление с Рзт 1 и ВцИ, выделение Ача -Ры 1-186 и Ача+-ВцЕ,8) Расщепление НЮЬ с Рчц, введение метки, расщепление с Рзт 1 и ВдЩ, выделение РчЫ -Рзтр,Продукты фракционируют на 0,1 х 25 х 36 см 120 полиакриламидных гелей (акриламид(бисакриламид = 18/1) в 50 мМ трис-бората, 1 мМ ЭДТУК (рН 8,3) с длительностью операций 2, 8, 18 и 26 ч при 90 в с предварительной выдержкой 6 ч при 700 в, Наилучшие результаты получают, когда гели до использования выдерживают при комнатной температуре 2 - 3 суток,Определяют нуклеотидную последовательность к ДН К вставки.Причем гетерополимерную часть вставки заслоняю сбоку остатками 236 на 5-конце и остатками 7 А(вероятно, относящимися к концевой группе поли(А) мРН К), за которыми следуют остатки 15 С на концах. Вставку пронумеровывэют от первого нуклеотида после сб-хвоста к последнему нуклеотиду до остатков поли(А),