Способ получения -яблочной кислоты

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) 01 4 04 С 12 Р 7/46 ННЫЙ НОМИТЕТ ССС ОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ГОСУДАРС ПО ДЕЛАМ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ДЕТЕЛЬСТВ ВТ ОМУ ание дрожжей,пользуют в осуществляю а фумаровую виде водног расчета 34, кислоты на жей. ви ту с о ра 8-11 1 г вора ее соли из,О г фумаровойхой биомассы дрож тличаюивированиев е живания(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛЧЕНИЯ Т.-ЯБЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ, предусматривающийвведение свободных или нммобилизованных дрожжей рода Сап 61 йа илиЗассЬагошусез в раствор соли фумаровой кислоты с последующим инкубированием и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я темчто, с целью увеличения выхода целевого продукта, перед введением 2. Способ по п. 1, о щ и й с я тем, что акт дрожжей проводят путем ыд р в замороженном состоянии.3. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что иммобнлизацию осуществляют путем введения дрожжей в камеру, образованную полупроницаемой мембраной, а инкубирование их осуществляют путем помещения в ф верхний слой раствора соли фумаровой кислоты.4. Способ по п.3, о т л и ч а ющ и й с я тем, что при иммобилизации дрожжей рода ЗассЬагошусез в камеру дополнительно вводят от 7 до 4507. суспензии эритроцитов от объема содержимого камеры.1Изобретение относится к микробиологической промышленности, аименно к способу получения 1;яблочной кислоты из фумаровой путемФерментативной гидратации последнейпод воздействием фермента Фумаразыдрожжей.Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта,Способ осуществляют следующимобразом,Превращение Фумаровой кислоты вяблочную проводят с помощью обладающих Фумаразной активностью свободныхили иммобилизованных дрожжей ЯассЬа -говусез сегечхз 1 ае, ЯассЬагошусез чьпх или СапдЫу 1 хро 1 ухса.Дрожжи подвергают предварительному активированию.Для активирования С, 1 хро 1 уС 1 саи БассЬ.,чхпх используют влажныебиомассы, полученные после выращивания на среде с н -алканами (С.1 хро 1 уйдса) или мелассой (ЯассЬчапа), сепарирования и последующейпромывки водой.Для активирования ЯассЬ, сегеч 1. -зхае приготавливают смесь, содержа. -щую, Ж: дрожжи 44,15-44,4, вода4415-44,4; калий фосфорнокислыйдвухзамещенный 1,55-1,99; магнийсернокислый 0,18-0,26; фумароваякислота 0,88-0,89 и гидроокись калия" 0,88-0,90, рН смеси 7,2-7,4.Дрожжи в этом растворе инкубируют при 28-30 С и встряхивании втечение 18-22 ч. Затем добавляют7,68-7,73 толуола и продолжаютинкубировать при 35-39 С и встряхивании в течение б 0-80 мин.Активирование осуществляют путемвыдерживания полученных биомассдрожжей в замороженном состоянии.Для этого достаточно выдерживать ихйри температуре от -5 до -9 С,Для определения активированиядрожжей ставят опыты с добавлениемразных количеств субстрата реакции(Фумаровой кислоты) в расчете на 1 гсухой биомассы дрожжей, Об эффектеактивирования судят по времени, втечение которого не менее 80 Фумаровой кислоты превращается в яблочную, а также по максимальному коли: -честву образовавшейся яблочной кислоты в расчете на 1 г сухой биомассы дрожжей.Результаты экспериментов представленм в табл. 1-3, 254004 2 ковых условиях,50 При иммобилизации дрожжей ЯассЬ.сегеч 1 зхае для их стабилизирования в камеру из полупроницаемой мембра.ны вводят гемоглобин в количестве 3-20 мас.7 или суспензию зритроци тов в количестве 7-450 об,Ж от объема содержимого камеры (табл,5 и 6).Суспензию эритроцитов получают центрнфугированиеи крови быка с послеО 20 ЗО 35 4 О 45 Как видно из таблиц, использование активированной путем замораживания биомассы дрожжей во всех случаях приводит к ускорению ферментативного превращения Фумаровой кислоты в яблочную по сравнению с ис" пользованием неактивированных такимспособом дрожжей при прочих одинаНаиболее оптимальный режим работы в диапазоне 34,8-11 12 г фумаровой кислоты (субстрата) на 1 г сухой биомассы дрожжей. Ниже 34,8 г Фумаровой кислоты в инкубационной среде проводить процесс нецелесообразно из-за низкого абсолютного выхода яблочной кислоты. Верхний предел оп- тимального содержания фумаровой кислоты в инкубационной смеси - 1112 г на 1 г сухой биомассы дрожжей ЯассЬагошусез чпх. При увеличении количества субстрата выше этого значения эффектив ность превращения фумаровой кислоты в яблочную при использовании активированных дрожжей понижается(табл.2, вариант 7). Для более эффективного превращения фумаровой кислоты в яблочную активированные дрожжи иммобилизуют.Жмобилизациюдрожжей осуществляют путем помещения их в камеру, выполненную из полупроницаемой мембраны, например в герметичный целлофановый мешок или трубку. Превращение Фумаровой кислоты в яблочную происходит эффективнее, если дрожжи в целлоФановом мешочке или трубке погружать в верхние слои раствора Фумаровой кислоты (табл.4).Как видно из таблицы, при нахождении иммобилизованных дрожжей в верхйих слоях раствора фумаровой кислоты скорость реакции намного выше, Это объясняется тем, что образующаяся яблочная кислота перемещается в нижние слои инкубационной смеси из-за большей удельной массы по сравнению с фумаровой кислотой.3 1254дующим промыванием 0,97-иым раствором хлористого натрия,Из табл.5 видно, что при увеличении количества гемоглобина в целлофановом мешочке с хлебопекарнымидрожжами, катализирующими превращение фумаровой кислоты в яблочнуюв последовательных циклах, увеличивается число циклов, осуществляющих807-ное превращение, уменьшается 10время их завершения, а также возрастает число последовательных циклов с сохранением каталитическойактивности дрожжей, наблюдавшейсяв первом и втором циклах, Минимальное число циклов, в которых имеетместо 807-ное превращение фумаровойкислоты в яблочную, наблюдается вотсутствие гемоглобина. Все это свидетельствует о стабилизирующем действии гемоглобина на фумаразнуюактивность иммобилизованных хлебопекарных дрожжей,Из табл.б видно, что аналогичное стабилизирующее действие на фумараз- ную активность иммобилизованных хлебопекарных дрожжей при их функционировании в последовательных циклахЗО оказывают добавки суспензии эритроцитов быка. Целесообразно вводить 7- 450 об,7 суспензии эритроцитов от объема содержимого камеры. Более низкие концентрации оказывают пониженный стабилизирующий эффект. Вводить количества суспензии эритроцитов больше 450 об.7. нецелесообразно, так как уже это количество занимает почти весь целлофановый мешочек.П р и м е р 1. 1 г влажной биомассы Сапдда 11 ро 1 уС 1 са, выращенной 4 О на среде с н -алканами, отсепарированной и промытой водой, замораживают до (-5)-(-9)С и выдерживают в замороженном состоянии в течение 7 сут, Затем дрожжи смешивают с 45 800 мл 1,5 М раствора Фумарата аммония, содержащего 180 г соли (рН 7,9), до образования гомогенной суспензии. Полученную суспензию, содержащую 558 г Фумаровой кислоты в расчете 50 на 1 г сухой биомассы С, 11 ро 1 уй 1 са, выдерживают при комнатной температуре (18-25 С), Превращение фумаровой кислоты в яблочную контролируют методом тонкослойной хроматографии 55 на пластинках "Силуфол" в системе этанол : концентрированный раствор аммиака (8,5:1,5 по объему). Ирояв- . 004ление пластин после высушивания при.110 С осуществляют после обработки 0,1%-ным водно-спиртовым раствором бромфенола синего.О количестве образующейся яблочной кислоты и уменьшении количества фумаровой кислоты судят путем сравнения интенсивности пятен с контроль. ными (наносимыми на пластинку разными количествами яблочной и фумаро-. вой кислот). На стартовую линию хроматограммы наносится также некоторое количество янтарной кислоты, что позволяет судить о ее наличии в инкубационной смеси.В табл.7 приведены результаты превращения Фумаровой кислоты в яблочную в процессе инкубирования дрожжей С, 11 ро 1 ус 1 са.Из таблицы следует,что за 16 сут в растворе получено 515 г яблочной кислоты в расчете на 1 г сухой биомассы.После окончания процесса в инк. -бационную смесь добавляют концентрированную соляную кислоты до рН 1-2.Полученную смесь выдерживают при (+5)-(+10)С в течение 16-20 ч, затем отфильтровывают от осадка фумаровой кислоты, которую высушиваот и оставляют для регенерации. В полученном фильтрате, нагретом до 48- 55 С, при размешивании растьоряют 35,6 г растертой гидроокиси кальция. Полученный раствор охлаждают при размешивании, при этом, начиная примерно с 30 С, выпадает белый осадок.Полученную суспензию выдерживают при периодическом перемешивании при (+5)-(+10) С в течение 16-20 ч, затем выпавший в осадок кислый.яблочно-кислый кальций отфильтровывают и растворяют в 1990 мл воды при 55 С и помешивании. Необходимое количество гидроокиси кальция для получения кислого малата кальция и необходимое количество воды для получения 87-ного раствора последнего рассчитывают на основании достигнутой степени превращения фумаровой кислоты в яблочную во взятом объеме 1,5 М раствора Фумарата аммония). Раствор кислого малата кальция пропускают через термостатируемую при 55 фС колонку с катионитом КРСв водородной форме. Получаемьй кислый раствор яблочной кислоты упари1254004 5 10 15 20 25 30 35 40 45 П р и и е р 4. 50 г хлебопекарных дрожжей производственного объединения "Друва" смешивают с 50 млраствора, содержащего 1,75 г калияФосфорнокислого двухэамещенного,0,2 г сульфата магния и 1 г фуиаровой кислоты (рН 7,2-7,4). При необходимости рН доводят до требуемого 55значения с помощью КОН.Полученную суспенэию выдерживаютпри 28"30 С и встряхивают в течение18-22 ч. Затеи к ней добавляют 10 ил 5ют в вакууме досуха, не допускаянагревания выше 60 С,Выход яблочной кислоты - 88,75 г.П р и и е р 2. К суспензии товарных хлебопекарных дрожжей производственного объединения "Друва"приготовленной как описано выше ихранившейся в течение 87 сут при(.-5)-(-20)С, добавляют пенопластв кусочках (прщяерно 222 мм) допокрь 1 тия всей поверхности, все осторожно перемешивают. Освобожденную спомощьв пенопласта от толуола суспензию сливают с кусочков пенопласта и центрифугируют. К 0,62 мл полученного после центрифугирования прозрачного экстракта суспензии хлебопекарных дрожжей (что соответствует0,31 г влажных дрожжей, удельныйвес которых приблизительно 1 г/мл)добавляют 0,5 г сухого Фумарата аммония и 1,3 мл хранившейся при (-5)(-9)С суспензии эритроцитов быка,переносят все в целлофановый мешочек, и удаляют иэ него воздух.Завязанный целлофановый мешочекс раствором экстракта суспензии хлебопекарных дрожжей с общей рабочейповерхностью 31 см выдерживают прикомнатной температуре (18-25"С) вверхних слоях следующих друг за другом порций объемом 58 мл 1,5 М Фумарата аммония, содержащих 13 г сож (рН 7,9) до достижения 80-853превращения фумарата в яблочную кислоту. Прореагировавшие смеси сливают вместе и хранят до выделенияЬ-яблочной кислоты при температуреот 0 до +5 С, Контроль эа процессомосуществляют по примеру 1. Примесиянтарной кислоты не обнаружено,Первый цикл завершен за 10 сут,последующие 6 циклов завершены эа9-10 сут каждый, т.е. в течение66 сут на протяжении 7 циклов препарат работает с полным сохранениемначальной Фумаразной активности, Последующие 5 циклов завершены эа 1517 сут каждюй, Таким образом, до завершения 12-го цикла включительно,т.е, около 5 мес препарат работаетс активностью, превышающей 507. начальной. Дальнейшие циклы завершаются за 25-28 сут каждый, Поде завершения 23 циклов (14 мес. работы) получено 1304 мл прореагировавшей инкубационной смеси, из которой выделен 131 г яблочной кислоты способом,описанным в примере ЬТаким образом, в расчете на 1 г сухой биомассы дрожжей образовано 2700 г .яблочной кислоты.П р и м е р 3. Иэ дрожжей ЯассЬа. гощусез ч 1 п (расса "Феодосия" ), выращенных на среде с мелассой, отсепарированных, промытых водой и хранящихся при температуре от -5 до -9 С в течение 42 сут, готовят однородную суспензию путем смешивания 0,1 г прессо.занной биомассы с 1 мл 1,5 М Фумарата аммония, содержащим 0,225 г соли (рН 7,9), К 0,2 мл полученной суспенэии, содержащей 0,02 г влажных дрожжей, добавляют 346 мл 1,5 М Фумарата аммония (0,78 г) переносят в целлофановый мешочек, из которого удаляют воздух. Завязанный мешочек с суспензией дрожжей общей рабочей поверхностью около 31 см выдерживают при комнатной температуре (18-25 С) в верхних слоях следующих друг за другом порций объемом 60 мл 1,5 М фумарата аммония, содержащим 13,5 г соли (рН 7, 9), до дос-тижения 80-957. превращения Фумаратаа в яблочную кислоту. Прореагировавшие реакционные смеси собирают и хранят при температуре от 0 до +5 С до выделения яблочной кислоты, которое осуществляют по примеруПервый цикл завершен эа 20 сут, последующие 5 циклов завершены за 20-22 сут каждый, седьмой цикл завершен за 1 9 суток, Таким образом, в течение 143 сут на протяжении 7 последовательных циклов препарат иммобилизованных дрожжей работает с полным сохранением исходной фумаразной активности. На этой стадии получено 416 мл прореагировавшей реакционной смеси, из которой выделено 56,4 г яблочной кислоты способом, описанным в примере 1. Таким образом, в расчете на 1 г сухой биомассы дрож" жей получают 13400 г явлочной кислотыИнкубирование осуществляют при комнатной температуре, через 11 сут 803 фумаровой кислоты превращается в яблочную. Выход яблочной кислоты составляет 1028 г на 1 г сухой биомассы двожжей.При применении дрожжей, хранившихся при температуре от О до +5 С в течение 8 сут, т,е. не подвергну" тых активированию путем замораживания, при прочих одинаковых условиях за этот же период времеи только 307 50 1254толуола и продолжают встряхивать прн 37+2 ОС в течение 1-1,2 ч, Обработанную толуолом суснензию выдерживают 30 сут при температуре от -5 до -20 С, Затем к ней добавляют кусочки пенопласта (22 2 мм) до покрытия всей поверхности и осторожно перемешивают, Освобожденную таким способом от толуола суспензию дрожжей сливают с кусочков пенопласта и центрифуги О руют.К 2 мл полученного после центрифугирования прозрачного экстракта суспензии хлебопекарных дрожжей,что соответствует 1 г влажных дрожжей, 15 добавляют 50 мл 1,5 М раствора Фумарата аммония, содержащее 1 1,25 г соли (рН 7,9). При таком соотношении на 1 г сухой биомассы дрожжей приходится 34,8 г фумаровой кислоты. 20Смесь инкубируют при 40 С. Через сутки 852 фумаровой кислоты превращается в яблочную, что соответствует образованию 34,2 г яблочной кислоты на 1 г сухой биомассы дрожжей, 25.При использовании хлебопекарных дрожжей, не подвергнутых активированию, при прочих одинаковых условиях 853-ное превращение Фумаровой кислоты в яблочную наблюдается только ЗО через 3 сут.Контроль за процессом и выделение яблочной кислоты осуществляют по прккеруП р и м е р 5. Из дрожжей ЯассЬа-З говусев шп (расса "Феодосия" ), выращенных на среде с мелассой, отсепарированных, промытых водой и выдео. жанных при -(5)-(-9)С в течение 17 сут, готовят однородную суспензию путем смешивания 1 г прессован" ной биомассы с 1 бОО мл 1,5 М раство- . ра фумарата аммония, содер,кащего 360 г соли (рН 7,9), что соответствует 1112 г Фумаровой кислоты на 1 г сухой биомассы дрожжей. 004 8Фумаровои кислоты превращено в яблочную.Контроль за процессом и выделениеяблочной кислоты осуществляют по примеруП р и м е р 6. 0,1 г влажной биомассы хлебопекарньж дрожжей, хранившихся при температуре от -5 до -9 Св течение 145 сут, помещают в целло"фановый мешочек, в который добавляют0,84 мл 1,5 И раствора Фумарата аммания, содержащего 0,19 г соли(рН 8,2), 0,01 г Фумарата аммонияи ООб 3 мл суспензии эритроцитов быка, что составляет приблизительно7 об.7 от объема содержимого камеры.Целлофановый мешочек с общей рабочейповерхностью 9,9 см, из которогопредварительно удален воздух, завязывают и помещают в 1,5 М растворФумарата аммония (рН 8,2) объемом14 мл, что соответствует содержанию3,15 г соли.За протеканием процесса следятпо примеру 1. После превращения 80907 фумаровой кислоты в яблочнуюцеллофановый мешочек переносят в новую порцию фумаровой кислоты.Результаты представлены в табл.б.Как видно из таблицы, добавлениесуспензни эритроцитов быка оказываетзаметное стабилизирующее действие.В циклах 1-4 не менее 807 превращения Фумаровой кислоты в яблочнуюпроисходит в течение 7-11 суток, ав последующих циклах - в течение 2122 сут,Без добавления суспензии эритроцитов уже во втором цикле в течение10-2 суток достигнуто только 407превращения Фумаровой кислоты вяолочную,П р и м е р 7. 0,1 г влажной биомассы хлебопекарных дрожжей, хранившихся при температуре от -5 до -9 Св течение 145 сут, помещают в целлофановый мешочек, в который добавляют 0,2 г сухого Фумарата аммонияи 0,9 мл суспензии эритроцитов быка,что составляет 450 об.Е от объема содержимого камеры. Целлофановый мешочек, из которого предварительноудаляют воздух, завязывают и помещают в 1,5 М раствор Фумарата аммония (рН 8,2) объемом 14 мл, что соответствует содержанию 3, 15 г со,ли.1 За процессом следят по примеру 1.1254004 Т а блица 1 Влияние активирования дрожжей на превращение фумаровой кислоты в яблочнуюУсловия активирования Вариант Количество образованной яблочной кислоты, г, на 1 г сухой биомассы дрожКоличество Фумаровой кислоты, гна 1 г сухойбиомассы дрожжей Состояниедрожжей Биомасса н заморожена 7 ф е За 19 в яблоо около ую кислоту7 фумаровой превра кислот 2 7,45 иомасса орожена 273,4 15,0 Таблица 2яассЬагошусез чых на превращениеы в яблочную ние активировавия дрожжфумаровой кис Время,в которог 803 фум лоты пр в яблоч вант слов тивирования Количество об эованной ябло кислоты, г, н сухой биомасс дрожжей ечение не менее овой кис ращаетсяую, сут Количество фу. аровбй кислоы, г, на 1 г ухой биомассы рожжей остоянирожжей а 1 г,Биомассане заморжена 7,о же 9После превращения 80-9 ОХ фумаровой кислоты в яблочную целлофановый мещочек переносят в новую порцию раствора фумарата аммония. Результа-. ты представлены в табл.б.Как видно из таблицы, длительность превращения основного количества фумаровой кислоты в яблочную в первых двух циклах составляет 7 сут, в следующих трех циклах-11 сутю Реализация предлагаемого изобретения позволяет значительно увеличить скорость поучения Е-яблочной кислоты и выход продуктав расчете на 1 г биомассы дрожжей, упроститьпроцесс при использовании дрожжей, иммобилиэованных предложен:щм способом, а также снизить затраты на получение целевого 10 продукта. Время в течениекоторого не менее 803 фумаровой кислоты пре"вращается в яблочную, сут12 1254004 Продолжение табл 2. Условия активирования Вариант Количество образованной яблочнойкислоты, г, на 1 гсухой биомассыдрожжей Время,в течениекоторого не менее80% фумаровой кислоты превращаетсяв яблочную, сут Состояниедрожжей В яблочную кислоту превращаетсяне более 30% фумаровой кислоты 3 1112,0 4 Биомассазаморожена 16,8 5 То же 55 ю 01112,0 514,61028,0 ю За 24 сут в яблочную кислоту превращается не более 70% Фумаровай кислоты у ее 2224,0 Т а блица 3 Влияние активирования дрожжей Зассйагоаусез сетечхздае на превращение Фумаровой кислоты в яблочную Условия активирования Время, в течение которого не менее 80% Фумаровой кислоты превращается в яблочную, сут Вариант Количество Фумаровой ки лоты,г,на 1 г сухой биомассы дрожжей Состояние дрожжей 34,8 Биомасса не заморожена Биомасса заморожена 34,8 16,1 То же(Другой образец) 32,2 Количество фумаровой кислоты, г, на 1 г сухой биомассы дрожжей.3 Количество образованной яблочной кисна 1 г сухой биомассы дрож- жей13 1254004 Таблица 4 14Продолжение табл.5 О икл 15 7нижнего верхнего 54 П р и м е ч а н и е, В цикле 3 через 22-31 сут достигнуто лишь 60% превращения фумаровой кислоты в яб- лочную, в цикле 4 через 10-17 сут достигнуто лишь 0% превращения фумаровой кислоты в .яблочную; в цикле 6 через 21-28 сут достигнуто лишь 20% превращения фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 7 через 10- 16 сут достигнуто лишь 40% превращения фумаровой кислоты в яблочную; в цикле 10 через 6-9 сут достигнуто лишь 40% превращения фумаровой кислоты в яблочную.Таблица б Таблица 5 Влияние суспен на превращение лоты в яблочну ными дрожжамисегеч 1. ии эритроцитов умаровой кис- иммобилиэован ассЬагошусеь.ае ение кокле ней кислояблочную,оличест 7 721 11 оцитовкамере с 5 О Цик О 10 1( 10 1 51 2 б Влияние положения полупроницаемой камеры с дрожжами в инкубационной среде на превращениеФумаровой кислоты в яблочную ремя (сут), в течение котоого в каждом цикле не меее 80% фумаровой кислоты превращается в яблочную, в ависимости от слоя инкуба" ционной среды Влияние гемоглобина на превращение фумаровой кислоты в яблочную иммобилиэованными дрожжами БассЬагошусез сегеухзае/" Время (сут), в течение которого в каждом цикле не менее 80% фумаровой кислоть превращается в яблочную, в зависимости от количества гемоглобина в полупроницаемой камере с дрожжами,мас.%. 0 3 5 10 20 4Время (ут), в течение ко-, торого в каждом цикле не менее 80% фумаровой кислоты превращается в яблочную, в зависимости от количества гемоглобина в полупроницаемой камере с дрожжами, мас.Х. Время (сут), в теч торого в каждом ци менее 80% фумарово ты превращается в в зависимости от к ва суспенэии эритр в полупроницаемой дрожжами, об.%7 143310045 ,106 716 Таблица 7 254004 15Продолжение табл, 6 Время (сут), в течение которого в камдои цикле неменее 80 Фуиаровой кисло"тм превращается в яблочную,в зависимости от количества суспеизии эритроцитовэ полупроницаемой камере сдрожжами, об.Х Превращение фумаровой кислоты в яблочную свободными дрожжами СапйЫа 11 ро 1 у 11 са Наличиеянтарнойкислоты винкубационной смеси Степень превращения Фумаровой кислоты в яблочнуюу Й Время отначалаЦикл 10 опыта,сут10 13 12 7 10 11 11 11 7 11 22 11 11 7 11 21 22 - 14 15 21 --- 13 10 30 70 80 Нет 21 ----25 20 Нет 80 П р и м е ч а н и е. В цикле 2 через 10-21 сут достигнуто лишь 407 превращения. фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 7 через 21 сут достигнуто лишь 707 превращения фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 6 через 14-15 сут достигнуто лишь 7 ОЖ превращения фумаровой кислоты в яблочную в цикле 7 через 14-15 сутУ35 достигнуто липь 703 превращения фумаровой кислоты в яблочную, в цикле 8 через 13-15 сут достигнуто лишь 657 превращения фумаровой кислоты в яблочную. Составитель Л. МинееваТехред М.Ходанич Корректор А. Обручар Редактор Л. Повхан Заказ 4687/29 Тираж 490 Подписное ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5