Способ получения нерастворимого фермента

5279 Соив Советски Социалистических Реслублии(31) 40859 (33) Великобритания Государственный комитет Совета Министров СССР ло делам изобретенийн открытий(088.8) Опубликовано 30.04.76. Бюллетень Лд 16 Дата огубликования описания 06.08.76(72) Авторы изобретения Иностранцы Сидней Алан Баркер и Джон Фредерик Кснеди(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕРАСТВОРИМОГО ФЕРМЕНТА Изобретение относится к области получения нерастворимых ферментов и может найти применение в медицинской, микробиологической и пищевой промышленности.Известен способ получения нерастворимого фермента путем смешивания его с водной суспензией носителя с последующим отделением твердой фазы. Однако он многостадиен и сложен.Предложенный способ позволяет упростить процесс получения нерастворимого фермента. Для этого в качестве носителя используют полимер, содержащий повторяющиеся пары смежных гидроксильных и кар боксильных групп. Таким полимером служит полимер ортогидроксибензойной кислоты, имеющей в качестве заместителя ароматического кольца ненасыщенный радикал формулы- Х - (СО) и - СК=СКК,где К, К и К - независимо водород, алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, или галоген;п=1 или 0;Х - кислород, сера, иминогруппа или метилен, В качестве полимеров ортогидроксибензойной кислоты используют, например, гомополимеры Х-акрилопл-ампносалпциловой (поли-кислота) и Х-акрилопл-аминосалициловой (полп-кислота) кислот и комплексы этих гомополпмеров с солями бора и титача.Нерастворимые ферменты получают простым смешиванием фермента с водной суспензией полимеров с последующим отделением твердой фазы.П 1 эиыерази козПлексов фермент/полимер,имеющих удовлетворительные свойства, по данному изобретению могут служить:З-глюкозпдаза/титановы комплекс гомополимера Х-акрплоил-аминосалицпловой кис лоты;Р-глюкозидаза/титановый комплекс гомополимера Х-акрплопл-аминосалпцпловой кислактатдегидрогеназа/боратны комплекс го мополимера Х-акрилоил-ампносалицпловойкислоты:лактатдегидрогеназа/гомополимер Х-акрилоил-аминосалпциловой кислоты;р-глокозидаза/гонополизер Х - акрилоил- 25 аминосалицпловой кислоты;р-глюкозидаза/го ополпмер Х-акрилоиламиносалпциловой кислоты;лактатдегпдрогеназа/боратный комплекс го 3 512719мополимера 1-акрилоил-аминосалицилОВОЙ КИСЛОТЫ;лактатдегидрогеназа/гомополимер Х-акрилоил-амипосалициловой кислоты;а-амилаза/титановый комплекс гомополиме ра Х-акрлоил-аминосалицилОВОЙ кислОты;с-амилаза/титановыЙ Комплек Гомополимера Х-акрилоил-аминосалициловой кислоты;глюкамилаза/титановый комплекс гомополимера 1 х 1-акрилоил-амипосалициловой кис лоты;глюкамилаза/титановый комплекс гомополимера х 1-акрилои ч-аминосалициловой кислоты.В процессе использования полимерно-фер ментпые ком,чексные соединения загружают в колонну, заполненную твердым инертным осиелем, нап 1 и.мер стекляПЫМГ оусипами.П р и м е р 1. Взаимодействие комплексной боратной и некомплехсной поли-кислоты с 20 л акт атдегидро ген азой.Водный раствор лактатдегидрогеазы добавляют к суспензии поли-кислоты или ее боратному комплексному производному, немедленно центрифугируют и выделяют твердофаз ЫЕ КОМПЛЕКСЫ:поли-кислота/лактатдегидрогеназа иборатная комплексная поли-кислота/лактатдегидрогеназа.30Получение Ж-акрилоил-аминосалицилово 11кислоты400 г аминосалицилата натрия и оО г двууглекислого натрия растворяют в 250 мг дистиллированной воды и размешивают в течение 35 1 час. Затем к раствору двакды добавляют хлористый акрилоил (20 мл и 10 мл), перемешивая смесь после каждой добавки 1 час рН смеси доводят до 4 - 5 10 н. соляной кислотой, Затем смесь фильтру 10 т и Осадок промывают 40 500 мл дистиллированной воды.К-Акрилоил-аминосалици Овую кислоту перекристаллизовывают из водного этапола, выход 27 г, т. пл. 227 - 229 С.Вычислено, %: С 58,0, Н 4,35; Х о,76. 45 Найдено, %: С 57,7; Н 4,35;6,65.Получение полимера Х-акрилои.ч 4-аминосалициловой кислоты 150 мм акрилоил-аминосалициловой кис лоты и 9,36 г буры растворяют в 180 мл дистиллированной воды и доводят рН раствора до 9,0 10 н. едким натром. В полученный раствор добавляют 150 мг азобпсизобутиронитрила, растворенного в 50 мл этанола, и нагре вают 48 час при 80 С с обратным холодильником. Полученный вязкий раствор разоавляют 200 мл дистиллированной воды. При подкислениипоследнего до рН 2 5 и. соляной кислотой образуются тяжелые белые хлопья полимера, Осадок 10 раз промывают дистиллирова; ной Водой, которую всякий раз берут в 11-кратном избытке по отношению к объему осадка. Следы борной кислоты удаляют приПаРИВ 211 ИИ В РОТаЦИОННОМ ИСПВРИТЕЛЕ Раствора полимера в метаноле. Полимер хрант в виде суспензии в 200 мл дистиллированной воды, Для определения содержания воды в полимере последний отфильтровывают и высушивают пад пятиокисью фосфора в вакууме при 60=С. После сушки получают твердое, хрупкое, коричневое, прозрачное вещество. Отфильтрованный полимер содержит 93 вес. % воды.Получение боратного комплекса поли-кислоты Боратный комплекс полимера получают суспендирОВанием 000 МГ ОтфильтроВанноГО пОлимера в 1 мл водного раствора буры; рН смеси доводят до 7,0. Образующийся комплекс отделяют цептрифугированием.Боратный комплекс получают также и другим способом, Для этого 5 г вязкого раствора, полученного после полимеризации поли-кис,Оты, разбавляют 70 мл дистиллированной воды и полученный раствор подвергают диализу в те: ение 48 час с 10 ооъемами (по 5 л каждый) против 0,005 Н боратного буферного р 1 створа с рН 7,0.Удаление лактатдегидрогеназы из комплексаполи-кислота/лактатдегидрогеназаОбразец комплексного соединения поли- кислота/лактатдегидрогеназа, приготовленный вышеуказанным способом, центрифугируют и отделяот твердофазный фермент.11 рочность связи фермента с носителем определиот многократно, промывая комплекс пол-кис.чоч а/.Пактатдегидрогеназа дистиллированной водой и измеряя активность фермента В промывных водах, Лктивность определяот по изменению ОптическоЙ Плотности при 340 пм 0,4 М растворов пирувата натрия объемом в 1 мл, в которые добавляют пробы промывпых вод и надосадочной жидкости объемом в 0,5 мл.В заключение комплекс поли-кислота/лактатдегидрогеназа промывают 1 мл растворамолочной кислоты, в котором также измеряют актВость выше 1 казанным спосооом. Параллельно г роводят контрольные опыты с использованием 0 4 М раствора пирувата натрия (опыт А), а также раствора пирувата натрия в 1 М молочной кислоте (опыт Б).КО;Це 11 Т 112 Ц 5151 лактатдеГиДРОГеназы В кОнтроль:ых опытах - 0,4 ммоль в 1 мл. Полу,сн ые результаты представлены в табл, 1,512719 Т аблица 1 Оптическая плотность Разность Среда определения активности фермента начальная конечная 0,630 0,910 0,940 0,960 О, 610 0,290 0,200 0,140 1,240 1.200 Надосадочныи слой после центрифугирования То же+промывная вода после первой прогяывкп То же+прогяывная вода после второй промывки То же+прогяывная вода после третьей про- мывки 1,140 1,100 0,885 0,215 1,100 То же+прогяывной раствор после промывки молочной кислотой 1,042 0,162 1,204 Контрольный опыт А Контрольный опыт Б 0,034 0,135 1,170 А. Пали-кислоту (5 г) дцспергцруют в дцстцллрованной воле цзмельчцтелем лля ткаи; рй Проб дцСПЕрГрОВ 21 гНОГО ПОЛИМЕра ( 1,0 11,) устап авлцв 21 от с помощью 5 и. соля . ой кислоты цлц ел: ого патра. В каждую пробу добавляют лактатдегплрогецазу (10 мл) и выдерживают перел центрпфугцрованием в течение пол,часа. Осадок лважлы промывают лцст; ллцрова 1 п 1 ой водой (1 мл) ц после каждой промывк:1 це:1 трцфугпруют. В заключение пслц.1" р лважы промь 1 В 210 т 1 Л молочной к 11 слсто 111 (1,0 мл) ц 11 етрпфугпруют. В каждом цалссалочцом слое после цепт 1 зцфугирова я Опсд "ля 1 От актцВпОсть лактатдегцдрОгецазы прц 340 пм. Результаты приведены в Т 20.1. 2. Вышеуказанные результаты свидетельствуют о том, что полц-кислота:1 ооратнокомплексная поли-кислота взаи:,1 олействуют с лактатлегилрогеназой и что лактатдегидрогеназу можно удалить чз этих комплексных сое дине:1 ий путем промывки конце:1-.рированным суостратсм фермента, априм р молочной кислотой.Необходимо отметить, что г линцом случае комплекс фермент/полимер не имеет фермен тативной активности, хотч и является источником актпгцого фермента. П р и.;1 е р 2. Взаимодействиеекомплексной поли-кислоты и поли-кислоты с лактат дегидрогецазой и глюкамилазой,Таблица 2 Разность в оптической плотности после Оптическая плотностьпервого надосадочногослоя рН 2-ой 1-ойпромывки промывки молочной кислотойраствора 0,91 0,66 0,30 0,16 0,110,250,20 0,13 0,00 Вышеуказанные результаты показывают, что поли-кислота образует комплексные соединения по мере увеличения рН от 2 до 9 с увеличивающимся содержанием лактатдегидрогеназы.Б. Пробу (2,0 мл) суспецлироваь 1 ого полимера цецтрифугируют и осадок дважды промывают уксуснокислы 1 буферным раствором (рН 4,5). В полимер добавляют водный раствор гл 1 скаа 111 л 2 зы (1,0 х 1 л, 18,о мг/ыл) В лактатлегцдрогеназе (10 мл), полученную смесь центрцфугцруют. Осадок дважды промывают водой (1,0 мл) и 1 М молочной кислотой, после каждой промывки проводят центрифугированце. Для каждого надосалочного слоя после центрифугцровацця определяют активность лактатдегидрогс:.азы и глюкамцлазы, 25 Полученные результаты приведены в табл. 3. 2 3 4 5 б 7 8 9 0,93 0,73 0,54 0,45 0,20 0,00 0,07 0,07 1,06 0,05 0,26 0,34 0,14 0,29 0,26 1,08 1,15 1,25 ,49 1,15 1,53 1,36 1,45512719 Т аб лица 3 Разность оптических плотностей для Среда определения активности фермента лактатдегидрогеназыПервый надосадочный слойТо же - промывная вода после первой про- мывки 0,609 0,235 0,09 0,37 То же+промывная вода после второй промывкиТо же Рпромывной раствор после промывки1 М молочной кислотой 0,039 0,060 0,04 1,67 Из данных табл. 3 видно, что образование комплексных соединений фермент/полимер протекает с лактатдегидрогецазой лучше, чем с глюкамилазой, открывая тем самым путь для раздслсция этих ферментов,В. Опыт проводят по методике примера 2 Л. цо с использованием поли-кислоты, Полученные результаты приведены в табл. 4. Таблица 4 Разность оптических плотностей после Оптическая плотностьпервого надосадочногослоя рН промывки молочной кислотой первой промывкираствора 71 ф При РН 7 полц-кистота проявляет теплепино к гелеобразованцю. Стандарт 0,92. Вышеуказанные результаты показывают, 5 что поли-кислота по мере увеличения рН (с 2,0 до 7,0) интенсивнее образует комплексные соединения с лактатдегидрогецазой,Г. Методика опыта аналогична примеру 2 Вс использование.; поли-кислоты. Полученные результаты приведены в табл. 5. Таблица 5 Активность"глюк амилазы мг/1 моль Среда определения активности фермента Первый надосадочный слойТо же+ промывная вода после первой промывки То же+промывная вода после второц промывки То же-,-промывной раствор после промывки 1 М молочной кислотой 15,0 5,0 Вес глюкозы, выделяемой стандартным раствором крахмала. Результаты табл. 5 показывают, что комплексные соединения поли-кислоты образуются предпочтительно с лактатдегидрогеназой, и не с глюкамилазой, Это указывает на возможный путь разделения этих ферментов,Д. Опыт проводят по методике примера 2 В с использованием одной глюкамилазы (1 мл, 18,6 мг) с промывкой уксусцокислым оуферцым раствором (2 мл, рН 4 - 5).Полученные результаты приведены в табл,б. 2 3 5 0,80 0,79 0,42 0,10 0,20 0,07 0,52 0,43 0,40 0,24 0,00 0,11 0,46 0,40 0,26 0,00 0,10 0,00 Разность оптической плотности лактатдегцдрогевазы прц340 нм 0,32 0,20 0,10 0,85 0,68 0,80 0,80 0,90 0,92 0,92Среда определения активности фермента Первый надосадочный слойТо же+промывной раствор после первои промывкиацетатным буферомТо же-,-промывной раствор после второй промывкиацетатным буферомСтандарт 18" Вес глюкозы, выделяемой стандартным раствором крахмала. Таблица 7 Разность оптических плотностей при 420 нм для надосадочного слоя после соединения фермента с полимером (25 мл)исходного раствора фермента (25 мл) Образец твердофазного фермента 2,000 Больше 2,000 2,000 Больше 2,000 1,950 1,3000,052 0,048 0,034 0,064 0,0500,062 0,800 0,800 0,800 0,800 0,800 0,800 4 Б 4 В 5 А 5 Б 5 В 0,042 0,014 0,013 Некаталитическая реакция Данные табл. б свидетельствуют о том, что поли-кислота не образует комплексных соединений с глюкамилазой (см. приведенный ниже пример),Получение поли-кислотыПрименявшуюся в вышеприведенных примерах поли-кислоту готовят по способу, приведенному в примере для поли-кислоты. Отличие состоит в том, что в данном случае используют 5-аминосалиццловую кислоту (40 г), а це 4-аминосалицилат натрия. Выход Я-акрилоил-аминосалициловой кислоты 25,8 г, т. пл, 218 - 219 С.Вычислено, /О: С 58,0; Н 4,35; 11 б,75.Найдено, %: С 57,5, Н 4,5, М 6,5.Конечный продукт имеет розовую окраску.Боратнокомплексная поли-кислота может быть получена по методу, описанною в примере 1, Исходным материалом служит 5-аминосалициловая кислота или поли-кислота.П р и м е р 3. Взаимодействие титанокомплексной и некомплексной поли-кислоты ц поли-кислоты с глюкозидазой.р-Глюкозидазу вводят во взаимодействие со следующими образцами:4 Л - комплексное соединение полц-кислоты с высушенным титаном;4 Б - комплексное соединение поли-кислоты с обезвоженным титаном; 4 В - некомплексцая полц-кислота;5 А - комплексное соединение поли-кислоты с высушенным титаном;5 Б - комплексное соединение пали-кислоты с обезвожецным титаном;5 В - некомплексная пали-кислота.Каждый образец (20 мг) промывают пятьраз (по 5 мцн) дистиллированной водой, В каждый образец добавляют р-глюкозцдазу 10 (1 мг) в дистиллированной воде (5 мл). Смесьразмешивают 16 час прц температуре около 4 С. Затем смеси цсцтрцфугцруют. Из исходного раствора фермента ц цз каждого надосадочцого слоя, после саедццецця фермента с 15 полимером, берут пробы (25 мл). В этих пробах определяют активность фермента с целью определения прочности связи -глюкозцдазы с полимером. Образцы пять раз промывают (каждая промывка продолжается 5 мип) ди стцллированной водой ц удаляют надосадочный слой. Затем добавляют 2 мл 0,005 М уксуснокцслога буфера (рН 5), и цз надосадочцага слоя отбирают пробы для определения активности.25 Активность р-глюкозцдазы в вышеуказанных пробах определяют по скорости образования о-нцтрофенцл анцоца в растворах о-штрофенилу глюкопцранозцда. Полученные результаты приведены в табл. 7.5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приведенные результаты показывают, что почти вся содержащаяся в исходном растворе 1-гл 1 окоз 11 даза соединяется с полимером.Десятикратная промывка (по 5 миц каждая) 0,005 М уксусцокислым буферным раствором, 0,1 М уксусцокислым буферным раствором цли 0,5 М раствором хлористого кальция цс приводит к существенному снижению активности твсрдофазш 1 х фсрмец гои. Однако пять пятиминутных промывок 1 М раствором сахарозы в 1 М растворе хлористого цатрчя и затем в 0,005 М уксуснокислом буфере снижают активность примерно до 1/3 от наблюдавшегося до промывки уровня.Использование в примерах 4 А, 4 Б, 5 А и 5 Б титанокомплексные полимеры готовят следующим образом.Полученную, как в примере 1, поли-кислоту дважды промывают 5 н, соляной кислотой, потом дважды дистиллированной водой, а затем суспензируют в 12,5 вес./об, /о растворе хлористого титана (10 мл) и размешивают 15 мин. Смесь отфильтровывают для удаления окислительной среды. Остается твердый, окрашенный в оранжевый цвет продукт. Образец делят на две части. Одну часть высушивают в течение ночи в печи при 45 С, Получают образец 4 А. Вторую часть оставляют на ночь в эксикатере при температуре 4 С, Получают образец 4 Б.Соответствующее комплексное соединение поли-кислоты получают по тому жс методу, но с использованием не белой поли-кислоты, а розовой поли-кислоты, полученной в примере 2. Оставшийся после фильтрования остаток имеет темно-коричневую окраску. Образец разделяют на 2 части, обрабатывают вышеописанным образом и получают образец 5 А (соответствующий 4 А) и образец 5 Б (соответствующий 4 Б),П р и м е р 4. Взаимодействие титанокомплексной поли-кислоты и поли-кислоты с а-амилазой.Указанные в примере 3 образцы (20 мг) 4 А, 4 Б, 5 А и 5 Б промывают пять раз (по 2 мин) дистиллированной водой (5 мл). Последний надосадочный слой отделяют. В каждый образец добавляют раствор а-амилазы из Вас 111 цз зцЬИ 1 з (1 мг в 5 мл дистиллированной воды).Смесь размешивают 16 час при 4 С, Надосадочный слой удаляют и продукт деггерирования промывают пять раз дистиллированной водой (по 5 мл) и десять раз (по 2 мцц) 0,1 М уксуснокислым буферным раствором с рН 5 (5 мл),Твердофазные ферменты суспендируют в 2 мл 0,005 М уксуснокислого буферного раст 12вора с рН 5 и размешивают до получения однородной суспснзии, Пробы (по 1 мл для 4 А и 5 А и по 0,5 мл для 4 Б ц 5 Б) твердофазных ферментов испытывают ца активность по конверсии крахмала в мальтозу по методу Бернфельда и др. (Самуэльсон и Страмберг. СагЬОЬус 1 га 1 с ЯсэсагсЬ, 3, 1966, 89), Активность твердофазцых энзимов 4 А, 4 Б, 5 А, 5 Б составляет соответственно: 2,56, 2.27, 1.5 и 4,44 сд/мг.За единицу активности а-амилазы принимают количество фермента, выделяющееся в 1 миц при 20 С восстановленный сахар, эквивалентный 1 ммолю мальтозы.Вьццсцриведенныс результаты свидетельствуют о том, что а-амилаза образует комплсксныс соединения с титанокомплексной поли-кислотой и поли-кислотой и что полученные таким путем твердофазные ферменты обладаГот существенной энзимной ферментцой активностью.П р и м е р 5. Взаимодействие титанокомГГлсксц 011 полн-кислоты и пОли-кислОты с глюкомилазой.Описанный з примере 4 оп 1 ят повторяют, исгцльопав вместо а-амилазы 5 мл препарата Лг 11 декс глюкамилазы (примевцо 1 мг/мл).Пробы (0,5 мл) однородной суспензии твсрдофазцого фермента в 2 мл 0,005 М уксусцокислого буфера с рН 4,5 испытывают ца активность по конверсии крахмала в глюкозу по мстоду Бернфельда и др. Активность твердофазных ферментов 4 А, 4 Б, 5 А и 5 Б составляет соответственно: 0,304,.0,630, 0,323 и 0,450 ед/мг,За единицу активности глюкамилазы принимают количество фермента, выделяющееся в 1 миц гГри 45 С ц восстановленнь 1 й сахар, эквивалентный 1 ммолю глюкозы.ВЫГцспригеденныс результаты свидетельствуют О том, что глюкамилаза образует комплексные соединения с титанокомплексной поли-кислотой и что полученные таким образом твердофазные ферменты отличаются существснной ферментной активностью.Изменение активности твердофазных ферментов, в зависимости от частоты их использования, определяют путем суспендирования продукта диспергировация после определеция активности в 0,1 М ксус.Гокислом оуферцом растворе (5 мл, 2 мин), удалсци цадосадочного слоя, суспендипования продукта диспергирования в 0.005 М уксуснокислом буферном растворе рН 5 ( мл) и повторного определения активности. За ем эту опсрацию повторяют еще два раза. Результаты измерения снижения активности (в процентах от исходной) приведены в табл, 8,512719 14Табтица 8 Ант;вность тверлофазного фермента при использовании Образец 47,0 35,0 57,5 59,5 58,0 54,0 46,0 61,0 53,5 100 100 100 100 58,0 60,0,72,5 Приведе: ныс данные показывают, что после потери начальной активности на 80 - 40%, ферментативная активность твердофазН 1 х фсрмснтов остается при последующем использовании на полезном и достаточно постоянном уровне. Такие твердофазныс ферменты используют, обеспечения экономическую эффективность, в течение 10 - 20 час.П р и м е р 6. Гомополимер Х-акрилоил- 21 нносалтциловои 1 сислоты В комплексном соединении с титаном, приготовленный описанным ниже образом, промывают пять раз Дисти:1 лированпой водой (5 мл, по 2 мцн) и последний надосадочный слой удаляют, к осадку добавляют 5 мг о 5-амилазы ь дистиллированной воде, продукт диспергцрованця размешиваОт 10 час прц 4 С. Из каждого надосадочного слоя берут пробу (25 мл), в кототой определяют активность фермента по конверсии крахмала в глюкозу, Используют метод Бернфельда и др.Твердый материал промывают 10 раз 5 мл 0,1 г 5 уксуснокисльм буферпьм раствором, рН 5,0 ПО 2 МИН. ПОСЛС удаЛС 1 я ЗОСЛЕдСГО надосадочнОГО слоя продукт дцсперГ 11 рОВания суспензируот в 2 м; 0,005 М уксус.о 11 цслого буферного раствора (рН 5). Пробы (500 мл) продукта диспергирования испытывают описанным выше образом на активность фермента.Результаты измерспий актцвности ферментов приведены ниже в табл. 9.Комплексное соединение Гомополцмсра Х-ак 1 эилоил-аминосалици;ОВОЙ кислоты ц титана, которое используют з данном опыте, готовят следуОп;им об 1 зазом.,-.ткрцлоил-амцносалиццлову 10 кислоту (15 Г) суспепдиру 10 т В Д 1 стцл;ровацн 01 Вс(180 мл), В кОтор 10 затем дооавляОт б- (9,86 г). 1 рН Доодя с по:,Ощью 10 н. едкого па.ра до 9 Затем добавляют агобцсизобутцропнтрил (150 .л) в этаполс (50 мл) ц раствор нагревают 48 час па водяиои оанс при о 0" С. ГастВОр разоаВ;1 яют "цстилли 1 эоапной зодой (200 м 1) и дОбавя 10 т к немун, сол 51 Г 110 :,:1 слоту. ОсаждаОт погимер ослого цвета.ПО;121 ср путем декантации п 1 зомыва 101 дс. сять раз дстиллированной водой (11 порций), затем в ротациошом цспарител" выпар 51 ваОт цз этанола пять раз подряд, ПОЛС чего полимер суспендируют в дистиллированной воде. Выход продукта 14,2 г (сухой вес). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 г полученного полимера размешивают 20 мин с 12,5 вес./об. ов РаствоРа хлоРистого титана (10 мл) . Получают твердый продукт оранжевого цвета, который отфильтрогывают и промывают дистиллированной водой (100 мл). Выход продукта 980 мг (сухой вес).П р и м с р 7. Описанный в примере 6 способ используют для получения комплексного соединения гомополимера М-акрилоил-аминосалиццловой кислоты с титаном. Получаот гомополимер розового цвета ц комплексное соединение гомополимера и титана красновато-коричневого цвета,Результаты измерений активности этик ферментов представлены в табл. 9.П р и м е р 8, Описанный в примере 6 способ используют для получения комплексного соединения гомополимера Х 1-акрилоил-амцнос 2;иццлОВОЙ 1.пслоты с титаном. 1-Лкрилоил-аминосалициловую кислоту (1 г) суспендируют в дистцллированнои воде (20 мл) ц рН доводят до 9,0. На этой стадии опыта мономер растворим. В раствор вводят азобцсцзобутцронитрил (10 мг) в этаноле (10 мл), Затем 48 час смесь нагревают на водяной бане прц 80 С. Осажденный 2 н. соляной кислотой белый осадок полимера промывают дцстцллпрованной водой (250 мл) путем Декаптац ц.1 г полимера размешивают с 12,5 вес./об. ;. раствора хлористого титана (10 мл) в тсчснпе 20 мин. Полученный желто-Орапжсвый твердый продукт отфильтровывают и промыВают дистцллированноЙ водой (100 мл). Выход продукта составляет 612 мг (сухой все).Пример 9. Описанный в примере 8 с .О- соб используют для полученя комплексно 0 соед 1 Ненц 5 гомополимера Х-акр:лоцл-амв посалиццлОВОЙ кислоты с титано 1, примеч 51 я прп этом нс 4-аминокислоту, а Х-акрилоцл 5- аминосалцццловую кислоту,Резусьтаты цзме 1 зени 1 2 ктцвностц тгсрдофазного фермента приведены в табл. 9.П р ц м е р 10. Описанный в примере 6 спотСпользуют для получениясоедицсния Гомополимер 2 М-акрцлоил-2 мц. цосалццилово кцслоты ц титана. Х 1-Л рило ИЛ-аМПНОСал 1 ццЛОВуЮ КИСЛОту (1 аГ) Суспсндируют в дцстцллированноц воде (20 мл) ц устанавливают рН 10 н. едким натром до постоянной величины 4,5. В полученныц раствор добавляют азобцсцзобутпронцтрцл (О мг) в этаноле (10 мл). Растгор нагрсва512719 Таблица 9 Активность фергаента Началпав скорость образова- Н 5 ГЛОКОЗ 1,Гризер, ЛЪ Наноса оч- Твер:ый ный слой оса ок5,9 0,110 0,104 0,002 0,002 0,001 0,064 0,180 0,024 О,30 0,089 0,210 0,086 0,2 Г)8 О,80 0,196 5,1 0,002 0,155 О, 1;50 0,002 0,210 0,211 5,5 0,010 0,175 0,208 6,6 Примеч ание. 3 качестве субстрата ферменга во всех нригверах используют 520 гвгглюкозы, - -Х- - 1 СО), - СЕ= СКК,актаггсгн, С. Беллев Редактор Н. Спиридонова Тсхред 3. Тараненко Корректоры: В, Петрова и О. ДанишеваЗаказ 638 3 Изд. ЛЪ 14 Тирани 575 По,снос Ц 1-ИИПИ Госуларстсивого комитета Г,оста Мипетро 3 Г,СОР но ислам изоорсгсннй и откртй 13035, Моск 33, 7.33, атшс;анаб., д. 4 5Т 3 игрфин, нр Сауна, 2 ют 48 час па водяной банс при 80 С. 11 ослс разбавления раствора дпст 11прот иной 3 О. дой (20 мл) добавляют 12,5 вес./Об. % раствора хлористого титана (20 мл). Прп атом в осадок выпадает желто-оранжевое комплексное соединение титана. 1 чго о" фпльтроП р и м е р 11. Описанный в примере 10 способ используют для получения комплексного соединения гомополимсра Х-акрилопл- аминосалициловой кислоты с использованием место 4-аминокис;1 оты М-акрглонл-аминг 1- салициловой кислоты. Формула изобретения1. Способ получения нерастворимого фермента путем смешивания его с водной суспензпей носителя с последующим отделением твердой фазы, отл ич а ю щи й ся тсм, что и качестве носителя используют полимер, содержащий повторяющиеся пары смежны.; гидроксильных и карбоксильных групп.2, Способ по п. 1, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве полимера, содержащего повторяющиеся пары смежных гндроксильных карбоксильных групп, используют полимер ортогидроксибснзойной кислоты, имеющей и качестве заместителя ароматического кольца ненасьпценпый радикал формулы ы 13 а 1 О11 11 Омь 113 аот д 11 стилл 113013 йнпо 1 130- до ( 00 м1, исОл 3. 5 насос, Выход продув га 920 мг. Рсзультаы измерения активности твердофазых фср:,.сл 38 прпвсдсны в табл. 9. где К, К и 1(, - независимо водород, ал кил, содсркащий от 1 до б атомов углерода,ил галоген;и=1 или 0;Х- - кислород, сера, иминогруппа или мстил си.15 3. Способ 1 о и, 2, отл ич ающийся тем,то и качестве полимера ортогидроксибензойой кислоты, пме 1 о 1 цей в качестве заместителя ароматического кольца ненасыщенный радикал, используют гомополимсры М-акрило 3 л- 20 ипн 1 салициловой пли Х-акрилоил-аминосал 1 ц ил о вой ки сл от.4. Способ по п, , отличающийся тем,что в качестве полимера, содержапего повторя 1 О 1 цисся пары смежных гидроксильных и 25 карбоксп 1 ьных групп, используют комплексыгомополимсров Х-акрилонл-ахпносалициловой кислоты пли Х-акрилоил-ам 3 носалцило 131 кнслоть 1 с солями титана или бора.