Способ получения -аспарагиновой кислоты

(22 Зайнлено 090277 (21) 2451483/28 2 13/0 б 668,394 088,8) с присоединением занвнн23) Брнорнтет рственный комитеСССРедам изобретенийи открытий нублнноаано 300479. Бюллетень Ж нсания 30 а опублиьй ордена Ленина и ордена Трудового Красного осударственный университет им.И.Б.Ломоносов осковс намени(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь -АСПАРЛГИНОБОЙ КИСЛО Изобрете получения Ь и может быт биологии, и мьпаленности Известен рагиновой к пензии клето пример Рбеодо 1 М (.11, бо) та аммония. щей инкубац 37 Сится к техникеагиновой кислоонана в микропищевой проние отн-асп ь испол едицине спос ислоты-аспая сусаполучения 1,утем смещениорганизмов,нсойаа е и враствором Фу лом с послед чение 48 ч и клопа бводными толуией в т мара-ую- ри ля ме ак ы 4 Недостатком известного,способа является его длительность, загрязнение целевого продукта примесями и периодичность.Известен также способ получения-аспарагиновой кислоты путем куль тивирования микроорганизмов - продуцентов аспартазы с последующим выделением аспартазы из клеток, иммобилизацией Фермента на ионообменниках и пропусканием через них водного раствора Фумарата аммония.Недостатком этого способа явется необходимость выделения фернта из клеток и быстрое снижение тивности ), -аспарагиновой кислот Известен также способ полученияЬ -аспарагиновой кислоты путем культивирования продуцирующих ее микроорганизмов вида ЕасЬЕгсЫа сойна питательной среде, отделениясуспензии клеток от культуральнайжидкости, промывки, иммобилизацииклеток путем включения их в полиакриламидный гель, измельчения геля,активации клеток и промывки их фумаратом аммония,Этот спосоо является наиболееблизким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому ре"зультату.Недостатком известного способаявляется его длительность и недостаточная эффективность за счет снижения активности аспартазы при иммобилизации клеток.Цель изобретения - ускорить процесс и повысить его эффективность.Это достигается тем, чтов предлагаемом способе получения Ь -аспарагиновой.кислоты в качестве микроорганизмов из вида Еес)егсЬ а со 6используют ытамм Еес)тегсйа сой 83или Евсеи сЬа соб АН 52, илиЕэспе г с ид са 8 85, при этомактивацию клеток осуществляют после1 О Показатель Контроль Предлагаемыйспособ 74 187 13,1 77 173 257 122 72,9 210 Удельная скорость элюции 0,5-1,0 0,13 отделения их от культуральной жидкости путем нагревания суспензии клеток при 45-55 С в течение 40-60 мин, а иммобилиэацию проводят в присутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9 по весу с последующим охлаждением смеси до5 0-10 ОС при одновременном воздействии светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс в течение 5- 10 мин.Способ осуществляют следующим образом. Продуцирующие Ь -аспарагиновую кислоту микроорганизмы вида Е.эсЬеисп 1 а соб штаммы лй 52, 83 или 85 15 культивируют 6 ч на питательной среде (МПБ) при 30-37 ОС, затем клетки отделяют, активируют их нагреванием при 45-55 ОС, преимущественно при 50 ОС, в течение 40-60 мин и далее промывают.Последующую иммобилизацию проводят в присутствии одной из солей Длительность процесса,ч Удельная активность аспартазы,включенныхв гель нативных,клеток;ЕьсЬегс 1(а соб ед.активности Удельная активность аспартазы иммобилизированных нативных клетокЕас)1 есЬа соГ 1 % отсвободных клеток Удельная активностьаспартазы включенныхактивированных клетокЕзсИ ег(с)1 а со 1(,единицы активности Эффективность иммобилизации,Ъ Результаты таблицы показывают, 55 что уменьшение времени культивирования микроорганизмов впродуцентов аспартазы .и времени активации сокращает длительность процесса примерно в 8 раэ. 60П р и м е р 1. Односуточные клеткиЕасИеисЬа со 0( штамм В смывают с поверхности мясо-пептонного агара (МПА) 1-2 мл жидкой стерильной среды и с помощью стерильной пипетки переносят в посевную жидкую стерильную аспарагиновой. кислоты в количестве 3-9 вес.В и смеси,содержащей вес.%: акриламид 10-20, метиленбисакриламид 0,33-0,66;И,И, И, 3 -тетраметилэтилендиамин 0,00025-0,0005 у персульфат аммония 0,0375;.рибофлавин 0,005. Клетки вместе со смесью освещают светом видимой области с интенсивностью 15-20 тыс.люкс с одновременным охлаждением до 0-10 С в течение 5-1.0 мин.Затем гель измельчают и пропускают через него водный раствор Фумарата аммония со скоростью элюции 0,5-1,0 при 25-37 С.Получают чистый продукт с выходом 88-95% потребленного фумарата.Продукт кристаллизуют подкислением раствора до рН 2,5-3,0, кристаллы отделяют фильтрованием, осадок про" мывают этиловым спиртом и высушивают на воздухе.Данные сравнительных испытаний по предлагаемому способу и известному (контроль) приведены в таблице. среду того же состава.Культуру выращивают 12-18 ч глубинным способом при .30-35 дС в качалочных колбах 750 мл (объем среды 50 мл) . Затем посевной материал в количестве 2-3 вносят в среду того же состава и выращивают тем же способом 6 ч в аналогичных условиях в качалочных колбах с объемом среды по 125 мл. Клетки отделяют от среды на центрифуге С. Из 4 л среды6596получают 50 мл исходной суспенэииклеток Еэс)епсйа со 1 штамм В,которые содержат 56, 92 мг белкав 1 мл (определение по методу Лоури)и имеют удельную и общую аспартаэнуюактивность, соответственно равные57 ед на 1 мг белка за 1 ч и 5161500 ед (1 ед равна 1 микромолюобразованной. аспарагиновой кислотына 1 мг белка за 1 ч)После трехкратной промывки суспензии клеток порциями по 230 мл стериль ной водопроводной воды или 0,01 Мфосфатного буфера с рН 7,0 последующего центрифугирования в течение10 мин при 6 тыс об/мин получают50 мл промытой суспензии клеток Евсее"а соб штамм В с содержанием белка29,70 мг в 1 мл и удельной и общейактивностью, равной соответственно180 ед на 1 мг белка эа 1 ч и154850 ед.Аспартазную активность свободныхклеток определяют следующим образом.. К 1,7 мл суспенэии клеток добавляют 13 мл 0,1 М Фосфатного буферас рй 8,0 и 15 мл 1 М (11,6) раствораФумарата аммония, приготовленного25добавлением и 116 г фумаровой кислоты концентрированного раствора аммиака до рН 8,5 и воды до 1 л. В 1 Мраствор фумарата аммония вводятхлористый магний в количестве 0,001 М ЗС(0,002032). К реакционной смесидобавляют 0,3 мл толуола, Реакционнуюсмесь инкубируют при постоянном перемешивании при 37 С, отбирая аликвотыпо 3 мл через 30 мин в течение 2 ч. 35Реакцию в аликвотах останавливают,отделяя клетки бактерий центрифугированием в течение 10 мин при 10 тыс.об/мин. В надсадочной жидкости определяют содержание Фумаровой кислоты 40по поглощению при 240 нм и аспарагиновой кислоты нингидриновым методомпо общепринятой методике.Пои включении клеток сьсИегСЫасо 8(,в полиакриламидный гельк 2,0 мл 50-ного раствора акрилами-.да добавляют 1,1 мл 3-ного раствораметиленбисакриламида, 0,1 мЛ0,025 Ъ-ного раствора рибофлавина,0,1 мл 0,1875-ного раствора персульфата аммония, 0,1 мл 5-ного50раствораИ,И,;( -тетраметилэтилендиамина, 150 мг дикалиевой солиаспарагиновой кйслоты и 1,7 мл суспензии отмытых от балластных бел-ков клеток Еасйеп(сЫс соП штамм В, 55содержащих 80,78 мг белка и имеющихудельную и общую аспартазную активность, соответственно равные 108 ед.на 1 мг белка за 1 ч и 9500 ед. Смесьбыстро перемешивают, ставят в ктакан со льдом и водой и освещаютлампой 300 вТ, помещенной на расстоянии 14 см,в течение 5-10 минБлок полиакриламидного геля с включенными в него клетками бактерий11 6весом 6 г растирают в ступке 2 м;,получая частицы геля размером ст0,2 до 2,0 мм, Их отмывают отсвободных клеток микроорганизмов,добавляют последовательно четырераза по 30 мл дистиллированной водыи отделяют промывные воды декантацией после отстаивания осадка 5 мин,ПромЬвные воды собирают вместе, получая 90 мл с .общим содержанием белка33,0 мг, т.е. 41 от внесенногоколичества, В полиакриламидный гельвключены клеки ЕвсИеяс)1 а со 8штамм В в количестве, соответствующем 47,87 мг белка или 59. Удельная активность иммобилиэованныхклеток повышается до 187 ед, на 1 мгбелка эа 1 ч, общая активность равна 950 ед., что составляет 94,5от внесенной общей активности,Объем суспензии частиц полиакриламидного геля, равный 15 мл, с включенными клетками Ебсег(с 1 са соРштамм В после последнего промыванияколичественно переносят в 15 мл 1 М(11,6) раствора Фумарата аммония,приготовленного, как указано вышес О,З мл толуола. Реакционную смесьвыдерживают при 37 С при постоянномперемешивании и через 30 мин в течение 2 ч отбирают аликвоты по 5 мл,Реакцию в аликвотах останавливаютфильтрованием через бумажный Фильтрчастиц геля с включенными клеткамибактерий.В Фильтрате определяют содержание Фумаровой и аспарагиновой кислот методом, описанным выше.Во всех случаях проводят идентиФикацию образовавшейся аспарагиновой кислоты при помощи тонкослойной хроматографии на пластинках фСилуфол в системах растворителей хлороформ" метаноламмиак- вода в соотношении40:40:7:3 и на пластинках Фиксион при использовании 0,4 М цитратного буфера рН 3,3. Стандартом служитЬ -аспарагиновая кислота хроматографически чистая фирмы Реанол(ВНР),Приготавливают три одинаковых образца полиакриламидного геля с включенными в него клетками Е,со 8 штамм 83, отличие между которыми состоит только в том, что полимеризацию одного геля проводят, обычным способом при освещении светом видимой области с интенсивностью 15- 20 тыс.люкс и при охлаждении в стакане с водой и льдом, второй освещают в воде при комнатной температу" ре, а в третьем проводят полимериэацию без освещения и при охлаждении.Иммобилизованные при освещении и охлаждении до 8 С клетки Е.соб 83 имеют удельную и общую аспартаз-. ную активность, соответственно рав" ные 187 ед, на 1 мг белка за 1 ч и 8950 ед. (94,5 от внесенной), при освещении без охлаждения, соответственно равные 21,6 ед. на 1 мг белка659611 10 за 1 ч с 1100 едГ 6 5",. О 1 п.,-.ной), а без освещения - .р е"1 мг белка за 1 ч и 230 ст; 3 81От Внесенной) и поли.;еризаци:. В ;сомслучае протекает 60 мин П р и м е р 2, Клетки Е,:-о.;штамм Ай 52 Выращиваю", и го".о" вят суспензию согласно примеру 1. Содержание белка равно 39,368 1 мл суспензии клеток, удельная активность - 25 ед. На 1 мг бе:п.а за 1 ч. Иммобилизацию клеток бактерий проводят, как В примере 1, В двух одинаковых образцах, внося В каждый по 67,5 мг белка с общей активностью аспартазы 1685 ед, Отличие между образцами состоит в том, что в одном случае в смесь для Фотополимериэации полиак 1 рилау 1.:пк-о геля,цобавляют 150 мг дикалиевой соли,аспара 1.ис:,свой кислоты, а другом не добсавляют. Аспартазную актиВность включен"ных в полиакриламиднЬ 1 й гель клетокбактерий опрЕделяют, как В примере 1.Клетки бактерий, иммобилизованпые 2,в присутствии соли аспарагиновойкислоты, имеют удельную и общую активность соответственно 74,0 ед.на 1 мг белка за, 1 ч и 3530 ед.,т,е 210 от исходной; без соли 80аспарагиновой кислоты соответственно2,58 ед. На 1 мг белка за 1 ч и130 ед., т,е 8,7% от исходной общейактивности,П р и м е р 3. Клетки Е,соРштамм Кр выращивают, как В примере 140 мл суспензии непромытых клетокс содержанием белка 57 0 мг В 1 мл:,удельной активностью 57 ед., на 1 мгбелка за 1 ч разделяют на две равныеДОзы, 20 мл этой суспензии пр(эть 1 ваютот балластных белков как в пример., 1,и получают 20 мл суспензии клетокбактерий с обозначением натр 1 вны:.и ссдержанием белка 29,7 мг в 1 м 11,Другие 20 мл суспензии неотмытых 45бактериальных клеток вначале нагре-.вают 40 мин при 50 ВС, а затем отмывают от балластных белков как В примере 1, получая 20 мл суспензииклеток с Обозначением активирован-. 50ных с содержанием белка 27,06 мгв 1 мл, Включение бактериальных клетокв полиакриламидный .гель осуществляют,как в примере 1.Затем определяют;аспартазную актив- "ность. свободных и включенных Вполиакриламидный гель нативныхи активированных клеток Е.СОЦштамм Кр, как в примере 1, Получаютсвободные и иммобилизованные нативные клетки Е.со 11 ",.о с удельной аспартазной,активностью, соответственно равной 108 и 187 ед. на1 мг белка за 1 ч, а также свободныеи иммобилизованные "активированпыеклетки Е соби Кр с удельнбй аспар В 1:с й 00 и 257 ед, ".: 1 Мг белка 1 , и м е 1 э 4 ., клетки Е с 001 1." ,сер э 1 К 1 р Выращи лают к сп В примере 1и.: суспен-ии клеток нагревают,-и до 50 С, а затем отмывают ст ба:.Ласнь 1 х белков, как В приме;с. учая 10 м Суспензии акти- :".:11,:.",аппых .;лето содержащих 35,2 мгмВ 1 смл и имеюцих удельную активость аспартазы 27,8 ед.на 1 мг белка за 1 : 5,1 мл этой суспензии с содержанием 179 мг белка с общей аспартазной активностью 4999 ед. скрбавляют к трой 11 ому количестВу Всех сос"авных частей для Фотополимеризации -1 олиакриламидного геля, указанных В.,1 римэре,;1 ОС:с;с ге;.ОП:.),.; МЕриэацИИ И ИЗ:.ЬЧ асс.ИЯ НОГИанпплаМИДНОГО ГЕЛЯ, КаКПГр 1"мере 1, 1 ас:,:и,Ь 1 измельченного -,з 1 р;:т 1 ээ 9.;1 вают 4 Оаза. Порциями 0.01 И )росФатного буФера рН 7,0 по "0 .,. и -.Оби,эют 150 мл проМыВных - .с - , ",о со 1 эые соле 1 рр;ат 69 мг белка1 9 "р 0;,добщей активности аспартапот.,акриламидный гель включают"рк г"1 ;, с о 81 К 1 э количестВО кототрс:х;ответствует 110 мг белка или-с.: дчо.эо количества. Включенгель клетки имеют удельнуюта, р активность 119 ед. наза 1 ч и общую 13200 ед.;:исслоты равно 0,865 И, а фумаровой0,012 И, .Т.е. молярный выход образоВПВШЕЙСЯ с.СПаРаГИНОЬОй кислоты ПОотношению к потребленному Фумаратуравен 88,К 1 л элюата добавляют концентрированную серную кислоту до рН 3,0,выпавший обильный осадок отделяютФильтрованием, промывают последовательно двумя порциями холодной водыдо 50 мл и 50 мл 96-ного этиловогоспирта и сушат до постоянного весана воздухе, получая 110 г аспарагиновой кислоты, которая в 6 г НСимеет (а)"= +25,5 э. Это указываетна 100-ное содержание Ь -ФормыВ целевом продукте.В целевом продукте не обнаруживают Фумаровой кислоты - исходногоссырь яПолученная-аспарагиноваякисрота дает одно пятно при хро.1 атографировании на пластинках659611 10 Составитель А.БражниковаРЕ акто И. мит нева Тех Ед З.Фанта Корректор О.Билак И 2Тираж 525 ПодписноеНИИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва ЖРашская наб., д,45Филиал ППП фПатент, г.ужгород, ул.Проектная,4 й и АЗаказ 2120/6 Силуфолф и ффиксион, как указано в примере 1, и один пик на аминокислотном анализаторе Фирмы Хитачи (Япония), точно соответствующий стандартной Ь -аспарагиновой кислоте. Целевой продукт не загрязнен клетками микроорганизмов, Злемен тарный микроанализ содержит,Ъ: 4,90 Н, 36,48% С, 10,49% М, что соответствует теоретическому содержанию этих элементов в аспарагиновой кислоте (з,301 И, 36,095 С, О 10,52 К)Предлагаемый способ.получения ) - аспарагиновой кислоты по сравнению с известным техническим решением той же задачи обеспечивает повышение эФФективности процесса за счет сокращения времени активации клеток микроорганизмов и повышения их активности перед иммобилизацией, а также увеличения скорости элюции20 исходного сырья через колонку. Формула изобретения Способ получения Ь -аспарагиновой кислоты путем культивирования про 25ду 1 ирующих ее микроорганизмов видаЕбсЬЕгс)а Со 1 на питательнойсреде, отделения суспензии клетокот культуральной жидкости, промывки,иммобилизации клеток путем включенияих в полиакриламидный гель, измельчения геля, активации клеток и промывки их фумаратом аммония, о тл и ч а ю ш и й с я тем, что, сцелью ускорения процесса и повышенияего эффективности, в качестве микро"организмов из вида ЕвсесЬа со 3используют штаммы ЕвсеесЬа со 183 или Гас)егсИа со 1 АК 52, илиуспелспа со 8 85, при этомактивацию клеток осуществляют послеотделения их от культуральной жидкости путем нагревания суснензииклеток при 45-55 С в течение 4060 мин, аиммобилизацчю проводят вприсутствии одной из солей аспарагиновой кислоты в количестве 3-9вес.Ъ с последующим охлаждениемсмеси до 0-10 С при одновременномвоздействии светом видимой областис интенсивностью 15-20 тыс.люкс втечение 5-10 мин,