Способ получения имидазопиридазинов

(ГОСПАТЕНТ ССС ТЕНТНО ИЗОБРЕТЕН И ИС К ПАТЕНТУ М-СО 82 где Я 1 - фенил, необязательно замещенный одной-тремя С 1-С 4-алкоксигруппами; Я 2 - С 1-С 4-алкил, необязательно замещенный С 1-С 4-галоидалкилом, гидроксильной группой, алкоксильнай группой или атомом азота, входящим в морфолиновый цикл, или моно- или ди-С 1-С 4-алкиламиногруппой, или Я 2-фенил; Яз- водород или С 1-С 4-алкил, Реагент 1. соответствующий азидимидазо 1,2. Ь)пиридазинкарбоновой кислоты, реагент 2; ЯЗОН, где Яз имеет указанные значения. Возможно последующее элкилирование, 5 табл. митед (6 Методы зкспериимии. М.: Химия,МИДАЗОПИ- противоопуь изобретеЯ стае ност группой, или Я или ди-С 1-С 4-алкиламинообозначает фенил;Яз обозначает водород илХ - кислород;У обозначает СН 2,обладающих цитотоксиче Предлагается способ получения новымидазопиридазинов общей формулы С 4-алкил,Мкой активно ст ния - синтезмидазопиридизвестногоивоопухоле Цель изобретеса производных ипользованиемобладающих простью,Получение проПромежуточно6-(3,4,5-триметокс НОВОГО Клдсазинов с исспособа, ой активногде Я 1 обозначаетфенильзательно замещенную оалкоксигруппами;Я 2 обозначает С 1-С 4-алкильную необязательно замещенную С 1-С далкилом, гидроксильной группой сильной группой или атомом входящим в морфолиновый цикл, ил ную группу, дной-тремя руппу -галои алкок азота моно(21) 4614684/04(71) Дзе Велкам Фаундей(72) Симон Тинби Ходгсо3,4,5-Триметоксибенэиловый спирт (19,82 г, 0,1 моль) растворяют в ДМЭ (20 мл), добавляют за 15 мин к суспензии трет-бутоксида калия (11,22 г, 0,1 моль) в ДМЭ при перемешивании в атмосфере азота и при охлаждении в ледяной бане. Спустя 0,5 ч полученную смесь обрабатывают 3-амино-хлорпиридазином (12,95 г, 0,1 моль) и спустя 1,5 ч нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 3 ч. Полученную смесь охлаждают и фильтруют и отфильтрованный твердый продукт промывают эфиром. Полученный фильтрат выпаривают в вакууме до получения масла, которое разделяют между этилацетатом и водой, Органическую фазу промывают водой, сушат (Йа 23 Оа) и выпаривают до получения масла (А), которое хроматографируют на силикагеле, элюируя смесью 5 метанола/хлороформ. Элюированные фракции обьединяют до получения масла (В), которое тщательно растирают с хлороформом и дииэопропиловым эфиром до получения указанного в заглавии соединения в виде не чисто белого твердого продукта (9,44 г) т,пл. 142-144 С,ЯМР дн (СОСз): 6,87 (1 Н, 3 АВ, 8,8 гц 5-Н), 6,78 (1 Н, 3 АВ, 8,8 гц, 4-Н), 6,72 (2 Н, с, АрН), 5,38 (2 Н, с, СН 2), 4,45 (2 Н, с, МН 2), 3,87(6 Н, с, ОМе) и 3,84(ЗН, с, ОМе).,П р и м е р 1. 2,2,2-Трифторэтил-й- (6)3,4,5-триметоксибензилокс иимидазо 1, 2-Ьпиридазин-илкарбамат,А, Этил-(3,4,5-триметоксибензилокси)имидазо 1,2-Ьпи ридазин-карбоксилат.Этилбромпируват (117 г, 0,6 моль) добавляют к 3-амино-(3,4,5-триметокси)пиридазину (174,6 г, 0,6 моль) и 2,6-лютидину (62,4 г, 0,5 моль) в сухом ДМ (600 мл) при перемешивании в атмосфере азота. Полученную смесь нагревают при 100 С в течение 3 ч, охлаждают и концентрируют в вакууме, а затем обрабатывают водой и фильтруют до получения твердого продукта коричневого цвета, который промывают водой и эфиром. Твердую часть кристаллиэуют из ДМФ и воды до получения укаэанного в заглавии соединения в виде твердых кристаллов (38 г), т,пл. 159-163 С.ЯМР дн (СОС 1 з): 8,31 (1 Н, с, ЗН), 7,84 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц 8 Н),6,82(1 Н, 3 АВ,8,8 Гц,7 Н), 6,70 (2 Н, с, АрН). 5,30 (2 Н, с, СН 2 Ар), 4,46 (2 Н, кв, 3 7 Гц, ОСН 2 СНз), 3.88 (6 Н, с, ОСНз), 3,86 (ЗН, с, ОСНЗ) и 1,44 (ЗН, т, 3 7 Гц, СНз).Б, 6-(3,4,5-Триметоксибенэилокси)имидазо 1,2-Ьпиридазин-карбоновая кислота.Продукт со стадии А (1.94 г, 5 моль) нагревают при кипячении с обратным холодильником при перемешивании с раствором гидроксида натрия (1 мл, 10 М, 10ммоль), водой (9 мл) и метанолом (5 мл) втечение 20 мин. Полученную смесь охлажда 5 ют и подкисляют разбавленной солянойкислотой и фильтруют до получения твердого продукта, который сушат при 60 С в вакууме до получения указанного в заглавиисоединения в виде порошка (1,5 г), т.пл, 22410 226 С (с разложением).ЯМР дн(66-ОМСО): 8,5(1 Н, с, ЗН), 8,07(5 мл) при перемешивании в атмосфере азота. Полученную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником в течение 325 ч, охлаждают и выпаривают в вакууме дополучения твердого продукта серого цвета,Этот продукт обрабатывают диоксаном(10 мл), водой (10 мл) и азидом натрия (визбытке) и интенсивно перемешивают в те 30 чение ночи при комнатной температуре,Полученную смесь фильтруют и твердыйпродукт сушат в вакууме до получения укаэанного в заглавии соединения в вире порошка (0,29 г), т.пл, больше 139 С (с35 разложением)ЯМРдн (СОС 3): 8,35(1 Н, с, ЗН), 7,85(1 Н,3 АВ, 8,8 Гц, 8 Н), 6,85 (1 Н, .3 АВ 8,8 Гц, 7 Н),6,70 (2 Н, с, АрН), 5,31 (2 Н, с, СНдАр), 3,90(6 Н, с, ОСНз) и 3,88 (ЗН, с, ОСНэ),40 Г. 2,2,2-трифторэтил-Щ 6-(3,4,5-триметоксибензилокси)имидазо 1,2-Ьпиридазин-илкарбамат.Продукт со стадии 8 (2,3 г, 6 ммоль)2,2,2-трифторэтанол (примерно 3 мл) и толу 45 ол (60 мл) нагревают при перемешивании ватмосфере азота при кипении с обратнымхолодильником до тех пор, пока реакция незавершится (по данным ТСХ) (приблизительноно 2 ч).50 Полученную смесь охлаждают в течениеночи и фильтруют до получения твердогопродукта, который промывают эфиром исушат до получения указанноо в заглавиисоединения в виде порошка (0,43 г), т.плав 55 ления 205-210 С (с разложением).ЯМР дн (66-ОМСО): 10,81 (1 Н, шир. с,МН), 7,38 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 8 Н), 7,85 (1 Н, с,ЗН). 6,90 (1 Н, 3 АВ 8 Гц, 7 Н), 6,85 (2 Н, с, Ар Н),5,52 (2 Н, с, СН 2 Ар), 4.83 (2 Н, кв, Л 9 Гц, 1836372добавляют порциями к перемешиваемой сус пе н зии метил-й-(3,4,5-триметоксибензилокси)имидазо 1,2-Ьпиридаэин-ил 45 карбамата (9,51 г, 24,5 ммоль) в ДМЕИ (100 мл) в атмосфере азота при окружающей температуре, Полученную смесь обрабатывают йодометаном (4,9 г, 2,15 мл, 35 ммоль) и молярным эквивалентом гидрида натрия и 50 йодомвтана, Спустя 2 ч смесь выливают в воду (100 мл) и фильтруют до получения белого твердого продукта, который обрабатывают хроматографически на 3102, элюируя смесью 2 метанола/хлороформ. Продукт 55 перекристаллизовывают из ДМФ и воды до получения указанного в заглавии соединения в виде белого порошка (8,29 г), т.пл.177-178 С. СН 2 СРз), 3,76 (6 Н, с, ОСНз) и 3,65 (ЗН, с, ОСНз).П р и м е р 2. 2-Гидрооксиэтил-Щ 6- (3,4,5-триметоксибенэилокси)имидаэо 1,2- Ьпиридазин-илкарбамат.Способом, аналогичным способу примера 1 Г за исключением того, что неочищенный продукт хроматографируют на В 02, элюируя смесью 5 метанола/хлороформ с последующей перекристаллизацией из смеси ДМФ/вода получают указанное в заглавии соединения в виде порошка, т.пл.193-195 С.ЯМР дн (бб-ОМСО): 10,35 (1 Н, шир, с, МН), 7,85 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 8 Н). 7,83 (1 Н, с, ЗН), 6,86 (1 Н) АВ 8,8 Гц, ЗН), 6,84 (2 Н, с, АрН), 5,25(2 Н, с, СН 2 Ар), 4,82 (1 Н, т, 3 4 Гц, ОН),4,15(2 Н, м), 3,80(6 Н, с,ОСНз) и 3,66(5 Н, м, ОСН 2 и ОСНз).П р и м е р 3. 2-(1-Морфолино)этил-й- (3,4,5-триметоксибензилокси)имидазо 1,2- Ьпи рида зин-илкарбамат.Способом, аналогичным описанному в примере 1 Г за исключением того, что неочищенный продукт хроматографируют на 902, элюируя смесью 5 метанола/хлороформ, кипятят с небольшим избытком этанола до получения указанного в заглавии соединения в виде порошка, т.пл. 161- 162 С.ЯМР д, (бо-РМСО): 10,30 (1 Н, шир, с, 3 ЧН), 7,88 (1 Н, с, ЗН), 7,85 (1 Н, Э АВ 8,8 Гц, 8 Н), 6,78 (1 Н, Э АВ 8,8 Гц. 7 Н), 6,85 (2 Н, с, АрН), 5,26 (2 Н, с, СН 2 Ар), 4,22 (2 Н, тЗ 5 Гц., СООСН 2), 3,80 (6 Н, с, ОСНз), 3,68 (ЗН, с, ОСНз), 3,58 (4 Н, м, СН 20 СН 2), 2,59 (2 Н, т, 3 5 Гц, СО-ОСН 2 СН 2 И) и 2,45 (м, СН 2 МСН 2).П р и м е р 4. Метил-Щй-метил-б-(3,4,5- триметоксибензилокси)имидазо 1,2-Ь пиридазин-илкарбамат. Гидрид натрия (1,26 г, 60 О, 31,5 ммоль) 5 10 15 20 25 30 35 40 ЯМР дн(б 6-ОМСО): 8,04 (1 Н, с, ЗН), 7,96 (1 Н.,3 АВ 8,8 Гц, 8 Н), 6,92 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 7 Н), 6,86(2 Н, с, АРН), 5,25(2 Н, с, СН 2). 3,79 (9 Н, с, ОСНз), 3,68 (ЗН. с, СООСНз) и 3,42 (ЗН. с, МСНз),П р и м е р 5, Метил-й-й-этил-(3,4,5- триметоксибензилокси)имидазо 1,2-Ь пиридазин-илкарбамат,По способу, описанному в примере 4, получают указанное в заглавии соединение в виде белого твердого продукта, т.пл, 153- 155 ОС.ЯМР дн (б 6-ОМСО): 8,04(1 Н, с, ЗН), 7,96 (1 Н, Ю,АВ 8,8 Гц, 8 Н), 6,92 (1 Н, Э АВ 8,8 Гц, 7 Н),6,86(2 Н, с, АрН),5,25(2 Н, с, АрСН 2), 3,90 (2 Н, кв, СН 2 СНз), 3,78 (9 Н, с, АрОСНз), 3,66 (ЗН, с, йСНз) и 1, 9 (ЗН, т, СНгСНз).П р и м е р 6. Метил-Щ 6-(3,4,5-триметоксибензилокси)имидаэо 1,2-Ьпиридаэин- -2-илкарбамат,6-(3,4,5-Триметоксибенэилокси)имидаэо 1,2-Ьпиридазин-карбоновой кислоты азид (пример 1) (1,0 г, 2,6 ммоль) нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 24 ч в смеси толуола (20 мл и метанола (примерно 1,5 мл). Полученную смесь охлаждают и выпаривают в вакууме до получения желтого твердого вещества. которое перекристаллизовывают из ДМФ и воды, получают указанное в заглавии соединение (1,05 г), т.пл, 213-215 С, а спектр ЯМ Р идентичен спектру продукта из примера 1,П р и м е р 7. 2,3-Дигидроксипропил-й-(3,4,5-триоксибензилокси)имидазо 1,2-Ь пиридин-илкарбамат.Продукт примера 1 В подвергают взаимодействию с Солкеталем, полученным по способу примера 1 Г, эа исключением того, что после завершения реакции между ацилазидом и солкеталем неочищенную смесь выпаривают в вакууме, а затем нагревают при 60-70 С в течение получаса с разбавленной соляной кислотой и этанолом. Реакционную смесь нейтрализуют раствором бикарбоната натрия, выпаривают в вакууме и хроматографируют на ЯЮ 2, элюируя смесью 7 метанола/хлороформ до получения укаэанного в заглавии соединения в виде белого твердого продукта, т.пл.175-176 С. ЯМР дн (бб-ОМСО): 10,28 (1 Н, шир, с, МН), 7,88 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 8 Н), 7,86 (1 Н, с, ЗН), 6,87 (1 Н. 3 АВ 8,8 Гц, 7 Н), 6,85 (2 Н. с, АрН), 5,28(2 Н, с, АрСН 2),4,90(1 Н, д, 3 4 Н, 2-ОН); 4,65(1 Н, т 3 4 Гц, 1-ОН), 4,20-4,0 (2 Н, м, СООСН 2), 3,80 (6 Н, с, ОСНз), 3,80-3,70 (1 Н, м, НО-СН), 3,69 (ЗН. с, ОСНз) и 3,40 (2 Н, т, 3 4 Гц, НОСН 2).П р и м е р 8. 2-Диметиламиноэтил-й(3,4,5-триметоксибензилокси)имидазо(1,2 Ь) пиридазин-ил 1 карбамат,Продукт примера 1 8 подвергают взаимодействию с (2.-диметиламино)этаноломпо способу примера 1 Г, за исключением того, что неочищенный продукт обрабатываютх роматографически на %02, эл юи руясмесью 5 метанола/хлороформ до получения твердого продукта, который промываютэтанолом и сушат до получения указанногов заглавии соединения в виде белого порошка, т,пл, 185-186 С,ЯМР дн (б 6-ОМСО): 10,32 (1 Н, шир, с,й Н), 7,88 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 8 Н), 7,85 (1 Н, с,ЗН), 6,89 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 7 Н), 6,85 (2 Н, с,АрН), 5,77 (2 Н, с, АрСН 2), 4,60 (2 Н, т, 3 4 ГцСООСН 2), 3,80 (6 Н, с, ОСНз), 3,69 (ЗН, с,ОСНз),2,50(2 Н,т, СН 2 й)и 2,21(6 Н,с, ИМе 2),П р и м е р 9. Фенил-й-(6-(3,4,5-триметоксибензилокси)имидазо(1,2-Ьпиридазин-ил)карбамат.Продукт примера 18 обрабатывают фенолом по способу примера 1 Г, за исключением того, что неочищенный продуктобрабатывают хроматографически на ЯЮ 2,элюируя смесью 5 метанола/хлороформдо получения твердого продукта, которыйпромывают ацетонитрилом и сушат до получения указанного в заглавии соединения ввиде белого порошка, т.пл. 210-213 С.ЯМР дн (СОСз): 10,12 (1 Н, шир, с, ИН),8,05 (1 Н, с, ЗН), 7,80 (1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 8 Н),7,55-7,15 (5 Н, м, Ф), 6,69 (2 Н, с, АрН), 6,67(1 Н, 3 АВ 8,8 Гц, 7 Н), 5,28 (2 Н, с, АрСН 2) и3,90 (9 Н, с, ОСНз),Результаты биологических тестов.А. Анализ на полимеризацию тубулина,1. Получение тубулина,э) свежеполученный мозг лошади,в) буферы:ВВО. 10 мм МЕЯ, 2 мМ ЕОТА, 1 мММ 9(304), 4 М глицерина, 2 мМ дитеэритритола (рН 6,9 при 23 С), ВВ 1 йаОН;ВВЕЛО как ВВО, но без 8 М глицерина, и1 мМ ОТР.МЕЯ(М-морфолино)этаносульфоновэя кислота,ЕОТА - этиленгликоль-бис-Р-аминоэтиловый эфир Й,Й,Й,Й-тетрауксуснэя кислота,ОТР - гуанозинтрифосфат.Все манипуляции осуществляют при4 С, если нет других указаний. Лошадиныймозг промывают в ледяном ВВО буфере иудаляют кровеносные сосуды и мозговыеоболочки. После взвешивания кору мозгаизмельчают гомогениэируют в 75 мл ВВО буфера на 100 г мозга, центрифугируют при65009 в течение 15 мин и после удалениянадосадочной жидкости снова центрифугируют при 100000 о 75 мин, Измеряют объем5 надосадочной жидкости (, мл) и добавляют10 мл (10 мМ) ОТР (литиевая соль) в Н 20.Полученную смесь инкубируют в запаянных ампулах для центрифуги (30 мин при34 С) во встряхиваемой водяной бане для10 полимеризации тубулина, После полимеризации ампулы балансируют и центрифугируют при 1000009 (1 ч при 27 ОС) ипредварительно нагретом роторе. Центрифугированной с высокой скоростью осадок15 снова суспендируют в ч/4 мл ВВ буфера,препарат перемешивают на льду в течение30 мин и центрифугируют при 1000009 (1 чпри 4 С) для удаления стабилизированныхна холоде микротубул. Равный объем ВВЕЛО20 буфера добавляют к надосадочной жидкости, которую быстро замораживают в пластиковых чашках, плавающих на суспензиитвердый С 02/этанол, и хранят в течение ночи при -80 С, Примерно через 18 ч заморо 25 женные образцы тубулина оттаивают,добавляют 10 мМ ОТР в воде до полученияконечной концентрации 1 мМ и измеряютновый объем (а мл),Цикл полимериэации (деполимериза 30 цию) повторяют точно в соответствии с приведенным ранее описанием, но заменяя надо получения дважды обработанного тубулина.2. Турбидиметрический анализ полиме 35 ризации тубулина.Аппаратура: записывающий спектрофотометр с шестью положениями, термостатированное кюветное отделение, полноеотклонение шкалы 0,2 ед, поглощения.40 В кювете спектрофотометра объемом 1мл перемешивают 100 мкл 10 мМ ОТР(литиевая соль) буферированного ВВ буфером, 10мкл воды или ДМСО в зависимости от выбранного растворителя лекарства, ВВ бу 45 фер и препарат тубулина так, чтобыокончательное повышение Аз 5 о нм составило,0,15 ед после 16 мин (приблизительное100 мкл препарата турбулина или 2,5 мкпротеина) в конечном объеме 1 мл при 37 С.50 Все реэгенты хранят на льду. Полимериэацию иницйируют, повышая температуру до37 С, и регистрируют возрастание Аз 5 о нмтрех образцов по сравнению с контрольнойкюветой, Контрольный образец содержит55 аналогичным образом инкубировэннуюсмесь либо без тубулина, либо с добавлением 1 мМ Са 2 . Рассчитывают возрастание посравнению начальным Аз 5 О нм через 10 минпосле завершения 1 эц фазы (контрольнаяполимеризация ээ это время составляет800 ь) и выражают как процент от контрольного значения для ряда концентраций препарата, Определяют концентрацию препарата, необходимую для 50 ф изменения (ИК 0) в контрольном значении,Для соединения примера 6 полная полимеризация тубулина ИКАО 0,42 мкм,В. Анализ на образование колоний Р 388 Д 1.В этом анализе клетки из адаптированной и чего линии лимфовидных неоплазм мыши Р 388 вначале экспонируют сериями разбавлений концентраций тестового соединения в течение 24 ч в культуре. После этого определяют способность обработанных таким образом клеток образовывать дискретные колонии за 14 дней после повторного суспендирования в полутвердой не содержащей препарата среде.В начале клетки во 9 роста помещают в отдельные 25 см складки для культурызтканей, каждый из которых содержит конечный объем 5 мл, Через буферированного ВРМ 1640 культурэльной средой с добавлением 10сыворотки плода теленка, антибиотиков и тестового соединения. Все соединения подготавливают вначале е соответствующих концентрациях в ДМСО, 25 мкл которого добавляют затем в каждую склянку. Все соединения оценивают при концентрациях, изменяющихся последовательно с коэффициентом 4, начиная с верхней концентрации в 4 раза большей, нежели та, о которой уже известно, что она ингибирует пролиферацию этих клеток на 80- 90 в предварительном пролиферативном анализе,Через 24 ч экспонирования по тестовому соединению клетки считают и известное количество живых клеток переносят в 15 миллилитровую ампулу для центрифуги, в которую затем добавляют 4 мл 0,25-ного агарозного раствора, желирующегося при низкой температуре в полной ВРМ тканевой культуральной среде. Через 13 дней инкубирования при 37 С в верхнюю часть, каждой ампулы добавляют 1 мл 1;Д-ного йодонитротетразолилвиолета и дают возможность проникнуть через агарозу в течение 24-28 ч, Этот краситель разлагается живыми клетками, давая нерастворимый красный кристаллический продукт, который облегчает счет колоний.Образцы отбирают из каждой ампулы и считают количество колоний, содержащих минимум 50 клеток. Определяют концентрацию соединения, необходимую для ингибирования образования колонии нэ 50 относительно контрольных клеток, инкуби 5 10 20 25 30 35 40 45 50 55 роеанных в тех же условиях, но без тестового соединения.Результаты анализа на образованиеР 388 Д 1, колоний: уля соединения примера6 ИКао (М) 1,32 х 10,С. Тест на лимфоцитную лейкемиюР 388/О,Мышей СД 2-Е 1 одного пола весом 3 20г использовали в этом опыте. Контрольными тестовым животным вводили енутрибрюшинно суспензию 10 живых Р 388/О опухоблевых клеток в день О. В каждом тестеисследовали несколько уровней доз, которые давалиОго для соединения, каждыйуровень доз вводили группе из шести животных, Тестовое соединение приготавливалилибо а физиологическом растворе, содержащем 0,050 ь таина 80, либо в дистиллированной воде, содержащей 5 декстрозы, ивводили внутрибрюшинно в дни 1,5 и 9 после имплантации опухолевых клеток. Дозырассчитывали в соответствии с индивидуальным весом животных, Фиксировали деньгибели для каждого животного и для каждойгруппы определяли среднее значение. Разницу между средним значением временивыживания для контрольной и обработанной групп выражали как процент возрастания продолжительности жизни ( ЕЯ),Данные приведены а табл,1,Д, Тест мышей.Тестовые соединения подготавливали,как описано для теста на лимфоцитную лейкемию Р 388/О (С), и вводили внутрибрюшинно в различных уровнях доз группам изшести ОД 2-Е 1 мышей одного пола весом20 .ф. 3 г в дни 1,5 и 9. Мышей наблюдаливплоть до 14 дней (считая со дня 1) и определяли количество смертей е каждой группеи Ю 20, Результаты приведены в табл,2,Е. Активность (и ччо) против устойчивых к лекарствам опухолей.Используя аналогичную методику с процедурой теста на лимфоцитную леккемиюР 388/О, соединение примера 6 оценивалипротив Р 388/О опухолей, которые были сделаны устойчивыми к следующим стандартным клинически используемымантиопухолевым агентам; бис-хлоронитрозомочевина (ВСЙО), циклофосфамид (О РА),адриамицин (АОИ), актиномицин О (Аст 0),метотрексат (МТХ), 5-фтороурацил (5 РО),цис-платина (Са/Рт), винкристин (ЧСВ), Амсэкрин (АМЗА).Результаты приведены в табл,3,Е, и аго активность против линий опухолевых клеток человека,Линии опухолевых клеток человека020-1. НСТ,щ ВОг и А 549 экспонировали концентрациями последоедтельныхразбавлений тестовых соединений после 96 ч культуры. Определяли способность таких клеток к пролиферации за тестовый период,Клетки в 1.оц роста помещали в чашки с множеством углублений для тканевой куль- турц (96 лунок) на 100 мкл/лунку ЯРМ 1640 культуральной среды с дополнением 10 сыворотки плода теленка, антибиотиков и тестового соединения. Все соединения приготовили вначале в соответствующих концентрациях в ДМСО, причем окончательная концентрация в этом растворителе была в 20 раз выше, чем нужно для пластин. Затем проводили 1 в 10 разбавление в полной среде перед добавлением 100 мл в каждую лунку пластины, Все соединения оценивали в концентрациях в интервале последовательных четырехкратных уменьшений с верхней концентрации, которая была в 4 раза больше, чем уже известная концентрация, ингибирующая пролиферацию клеток лимфоидной неоплаэмы мыши Р 38801 на 80-90 в предварительном пролиферационном анализе,Через 96 ч пролиферацию клеток, экспонированных тестовому соединению, сравнивали с контрольными, необработанными клетками одним из двух способов.1. Культуральную надосадочную жидкость отсасывают и клетки фиксируют и подкрашивают, добавляя раствор метиленового синего 5 г/л 50 6 этанола: вода, 100 мкл/лунку), Спустя 30 мин при комнатной температуре несвязанный краситель отмывают, погружая пластины в воду. Окрашенные клетки солюбилиэируют в течение ночи, используя 10 Саркосил (Сигма) в фосфатнобуферированном солевом растворе (100 млк/лунку). Определяют поглощение на Е 23 А пластинах спектрофотометра на длине волны 620 нм. ИК 50 определяют как концентрацию препарата, которая снижает поглощение до 500 от контрольного значения для культур без препаратов. Этот способ испольэовали для клеточной линии ОЮ.2. 20 мкл МТТ(5 мг/мл в РВ 9 добавляют в каждую лунку, После инкубирования в течение 4 ч среду из каждой из лунок отсасывают и заменяют 200 мкл ДМСО для растворения Образовавшихся кристаллов формаэана, Записывают поглощение на Е ЗА пластинах спектрофотометра на длине волны 540 нм. ИК 5 О определяют как концентрацию препарата. которая снижает поглощение до 50 От контрольного значения для культур без препарата. Этот способ использовали для ЮОг, Н СТи А 549 клеточных линий. Данные приведены в табл,4)6. 1 и чиччо активности соединения из 5 примера 1 против опухолей у мышейИспользуя процедуру, аналогичную спроцедурой лимфоцитной лейкемии Р 388/О, тестовое соединение примера 6 оценивали по отношению к мышиным опу холям В 16, 1210 и М 5076. Суспензию 10опухолевых клеток имплантировали внутрибрюшинно контрольным и тестовым животным в день О. В 16 опухолевые клетки вводили внутрибрюшинно в виде 1:10 Вге 15 клеток в день О, Тестовое соединение вводили внутрибрюшинно в день 1,5 и 9. Для В 16 и М 5076 мышей в каждой группе было по 10, а для . 210 по 6 мышей в группе. Записывали день гибели каждого из животных и рассчи тывали процент повышения длительностижизни(ЫБ). Полученные результаты приведены в табл.5.Формула изобретения Способ получения имидазопиридази нов общей формулы30 где Я 1 - фенильная,группа, необязательнозамещенная 1-3-мя С 1-С 4-алкоксигруппами;Я 2 - С 1-С 4-алкильная группа, необязательно замещенная С 1-С 4-галоидалкилом,гидроксильной групПой, алкоксильиой груп 35 пой или азотом, входящим в морфолиновыйцикл, или мОнО-, или ди-С 1 С 4-алкиламиногруппой, или фенил;Яз ВОДОрод или С 1 С 4 алкил;Х - кислород;40 У - СН 2,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что соединениеобщей формулыгде Я 1, У и Х имеют указанные значения,подвергают взаимодействию с соответству 50 ющим спиртом общем формулыЯ 2 ОН,где Я 2 имеет указанные значения,споследующим при необходимости алкилированием соединения, в котором Йэ -55 водород, для получения соединения, в котором Яз - С 1-С 4-алкил..Составитель С. Жукова Техред М,Моргентал Корректор М. Максимишинец Редактор Г. Бельская Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 3005 Тираж Подписное В НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5