Бромгидраты 6-аргиниламинонафталин-1-сульфамидов в качестве полупродукта для получения пептидных флуорогенных субстратов

П р и м е р 1. б-Фталимидонафталин- пропилсульфамид,Смешивают 9,0 мл (0,11 моль) пропила- мина, 14 мл (0,1 моль) триэтиламина и 500 мл ацетона. В смесь добавляют в течение 10 мин, 37,2 г (0,1 моль) 6-фталимидонафталин-сульфохлорида и перемешивают 4 ч при 20 С. Ацетон отгоняют при пониженном давлении, остаток залива 1 от 1 л воды и через 2 ч отсасывают продукт, промывают водой, сушат, перекристаллизовывают из метанола. Получают 35,9 г (выход 91 ) Т пл. 173- 179 С.Найдено,: С 63,82, Н 4,75, М 7,28, Я 8,09.Сг 1 Н 1 вг 1 г Я 04.Вычислено,о ; С 63,95, Н 4,60, И 7,10, Я 8,13,Аналогично получают остальные 6-фталимидонафталин-сульфамиды. Данные приведены в табл, 1,П р и м е р 2, 6-Аминонафталин-пропилсульфамид.К раствору 39,4 г (0,1 моль) 6-фталимидонафталин-пропилсульфамида в 500 мл метанола прибавляют по каплям 5 мл (0,1 моль) гидразингидрата и кипятят 4,5 ч. Метанол отгоняют, остаток экстрагируют 2 х 200 мл кипящего хлороформа, экстракт упаривают и остаток перекристаллизовывают из метанола. Получают 14,8 г (выход 56%) аналитически и хроматографически чистого продукта в виде масла, В = 0,61 (хлороформэтилацетат 1:1), ПМР спектр (в ДМСО), д, м.д.: 0,67 (СНз), 1,23 (СНг), 2,68 (СНг).Найдено,о : С 59,26, Н 6,27, й 10,73, Я 11,70.С 1 ЗН 16 йгЯОг.Вычислено.%: С 59.07, Н 6,10, К 10, 60, 3 12,13.Аналогично получают остальные 6-аминонафталин-сульфамиды, Данные приведены в табл. 2.П р и м е р 3, Бромгидрат 6-(й -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин- пропилсульфамида.Растворяют 3,89 г (0,01 моль) бромгйдрата М -бензилоксикарбониларгинина и 2.,64 г (0,01 моль) 6-аминонафталин-пропилсульфамида в 15 мл сухого пиридина, добавляют 30 мл сухого толуола и последний упаривают при пониженном давлении, Реакционную смесь охлаждают до -15 С, добавляют 2,02 г (0,01 моль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в б мл сухого пиридина и выдерживают при -15 С 0,5 ч, при 4 С - 1 ч и при 20 С - 18 ч. Отфильтровывают выпавшую дициклогексилмочевину, фильтрат упаривают досуха. а оставшиеся масло растворяют в 40 мл смеси хлороформ-пропанол(3:1), Этот раствор промывают 15 мл воды,15 мл насыщенного водного раствора МаС,содержащего 1 мл конц. Н С 1, 15 мл 2-ного5 водного МНз, 15 мл воды и сушат над безводным иаг 304. Растворители упаривают,оставшиеся маслообразное вещество растирают с сухим эфиром. Сырой продукт отсасывают, промывают эфиром. сушат и10 перекристаллизовывают из пропанола, Получают 5,72 г (выход 94 ) продукт с Т,пл,118-124 С, Вт = 0,71 (бутанол - уксусная кислота - вода 4:1;2).Найдено,о : С 51,21, Н 5,61, й 13,02, Я15 4,29, В г 11,72.Сг 7 НЗ 505 И 58 гЯ.Вычислено,о : С 51,02, Н 5,55, К 13,22,3 5,04, Вг 12,57.ПМР спектр(ДМСО), д, м,д,: 0,67(СНз),20 1,23 (СНг), 2,70 (СНг),Аналогично получают остальные бромгидраты 6-(К -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-сульфамидов, Данныеи ри веден ы в табл. 3,25 П р и м е р 4. Бромгидрат б-аргиниламинонафталин-пропилсульфамида.Растворяют 6,36 г (0,01 моль) бромгидрата (б-(М -бензилоксикарбонил)аргиниламинонафталин-пропилсульфамида в 10 мл30 Зй Н Вг в ледя ной уксусной кислоте и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого реакционную смесьвыливают в 100 мл сухого эфира. Выпавшийосадок отсасывают, промывают эбиром, вы 35 сушивают и растворяют в 10 мл воды. Раствор переносят в делительную воронку,добавляют 50 мл бутанола и при встряхивании добавляют 5 о -ный водный растворМаНСОЗ (порциями по 10 мл) до рН = 7,540 водного слоя, Органический слой промывают 15 мл воды и упаривают, Остаток растирают с эфиром, отсасывают, промываютэфиром, сушат, Получают 4,66 г (95 о ) продукта с Т.пл. 131-1328 С, Вт = 0,41 (бутанол -45 уксусная кислота - вода 4:1:2, БУВ 412), аБо=-2,1(с 1, ДМСО). ПМР спектр(ДМСО), д,м.д.; 0,70 (СНз), 1,22 (СНг), 2,68 (СНг).Найдено,о : С 45,83, Н 5,96, М 16,84, 56,11, Вг 16,35,С 19 Нг 9 М 6 В гЯОз.Вычислено, : С 45,51, Н 5,83, М 16,76,3 6,39, Вг 15,94.Аналогично получают остальные бромгидраты 6-агиниламинонафталин-сульфамидов, Данные приведены в табл. 4. Применение бромгидратов б-аргиниламинонафталин-сульфамидов в качестве полупродуктов для синтеза субстратов ис 1836340пользуемых при определении протеолитических ферментов, иллюстрируется примером 5.П р и м е р 5. 6-(Вос-Рго:РЬе+Агд)- . аминонафталин-пропилсульфамид, 50,91 г (2,5 ммоль) Вос-Рго-РЬе-ОН, 0,35 г (2,5 ммоль) гидроксибензотриазола и 0,51 г (2,5 ммоль) ДЦК растворяют в 18 мл диметилформамида (ДМФА)охлажденного до С, Раствор выдерживают при этой 10 температуре в течение 0,5 ч, при -4 С - 1 ч и добавляют охлажденный до -20 С раствор 1,25 г (2,5 ммоль) бромгидрата 6-аргиниламинонафталин-пропилсульфамида в.10 мл сухого ДМФА. Реакционную смесь отогре вают до 20 С и при этой температуре перемешивают в течение 19 ч, Образовавшуюся дициклогексилмочевину отделяют, фильтрат выливают в 125 мл воды, экстрагируют 4 х 25 мл смеси бутанол - этилацетат 1:1. 20 Органический слой промывают Зх 12 мл последовательно: 5 о -ного водного ЦаНСОз, 10%-ного водного КНЯО 4 и водой. Растворители упаривают при пониженном давлении, остаток растирают с сухим эфиром, 25 продукт отсасывают и промывают эфиром. Получают 1,84 г целевого продукта (выход 96) с Т пл. 179-186 С, В = 0,72 (БУВ 412), аЬ =-12,8(с 1, ДМСО), ПМР спектр(ДМСО), д, м,д.: 0,68(СНз), 1,20(СН 2),2,68(СН 2), 1 27 30 (Вос). УФ спектр (С 2 НьОН): Лбах254 нм ( = 39,4 10 ); ниах 286 нм (8 6,45 10 З).Аналогично получают пептидильные производные других 6-аминонафталин- сульфамидов, Данные приведены в табл. 5.Для доказательства преимущества новых субстратов определены относительные интенсивности флуоресценции детектируемых групп.П ри ме р 6. Определениеотносительной . интенсивности флуоресценции 6- аминонафталин-пентилсульфамида (детектируемая груйпа соединения 8 формулы 1)Спектр снимают на спектрофлуоримет ре "НтасЫ МРГ" (Япония) в относительном режиме регистрации при чувствительности 3 в кювете с толщиной слоя 1 см, Длина волны возбуждения ЯаО 3 б. = 357 нм, ширина щели возбуждения - 10 нм, эмиссии - 4 нм. Относительную интенсивность флуоресценции рассчитывают по формуле:1 а = -- А 55с 10где- высота полосы эмиссии вмм, Ь - концентрация в мольл, А - соотношение максимальной и использованной чувствительности прибора, Для 6-аминонафталив- : 1-пентилсульфамида (соединение 8 в табл.2) получают:86 100- 8203,473 10 10 3Измерение флуоресценции б-аминонафталин-пентилсул ьфамида.0,004875 г 6-аминонафталин-пентилсульфамида растворяют в 10 мл 95%-ного этилового спирта, 0,2 мл этого раствора разбавляют 10 мл фосфатного буфера с рН - 7,0 (0,067 М) и снимают спектр. Концентрация измеренного раствора с = 3,473 10 моль/л, оптическая плотность при длине волны возбуждения Озбт = 0,080, Полоса эмиссии имеет максимум Х фл. = 473 нм и высоту= 86 мм,Аналогичноизмерены спектры флуоресценции остальных 6-аминозамещенных и известных 5-аминозамещенных нафталинсульфамидов и сопоставлены в табл. 6.Из табл. 6 видно, что относительные интенсивности флуоресценции детектируемых групп новых субстратов составляют (410-860), в то же время у аналогов они колеблятся в интервале (9-26).Использование навых пептидильных субстратов для флуоресцентного анализа пептидаз.М е т о д и к а. Гидролиз 6-(Вос-Рго-РйеАгд) аминонафталин-прдпилсульфамида тромбином,В кювету флуориметра помещают 1,8 мл 1 мкМ раствора 6-(Воя;,Рго-РЬе-Агд) аминонафталин-пропилсульфамида в 0,02 М трис-НС 1 буфере с 0,15 М ИаС 1, рН 7,4, добавляют 0,2 мл 1 мкМ раствора тромбина в том же буфере и измеряют рост интенсивности флуоресценции при Л= 470 нм, фиксируя время, необходимое для 10%-ного гидролиза. В реакции с тромбином время 107 О-ного гидролиэа составляет 15 мин.Аналогично проводят анализ других пептидаз с использованием других субстратов. Для анализа исйальзуют следующие пептидазы; тромбин, плаэмин, фактор Ха, АПС (активированный протеин С), укоринаэа, ТАП (тканевой активатор плазминагена). Время гидролиэа, в течение которого в растворе образуется 0,1 мкМ концентрация соот-, ветствующего 6-аминонафталин-сульфамида (т.е. время 10 о -ного гидролиза различных аргинил ных производных различными пептидазами) приведено в табл. 7.Из табл. 7 видно, что субстраты, синтезированные на основе предложенных соединений и содержащие детектируемые1836340 8ЖНАГ НВ ВОИ де В = С 4 Н 9,зН 7- Сзн 7 С 5 Н 11Г 7, или качест птидн ол ени ратов Табл Фтил-сульФамид0 6-Фталими эико"химические д О 80 РВА нные элементного анализарутто.Формула ыход Найдено/Вычислено,29 6-аминонафталин-сульфамидные группы, могут быть использованы для анализа пептидаз, так как они обладают различной скоростью гидролиза.Таким образом, предложенные бром гидраты 6-аргиниламинонафталин-сульфамидов в качестве полупродуктов для синтеза пептидных субстратов обеспечивают повышение информативности флуоресцентного метода анализа пептидаз, так как 1 детектируемые группы новых субстратов обладают в 40 раз более высокой интенсивностью флуоресценции, чем аналогов (ср, 410-860 и 9-26).формула изобретения 1 Бромгидраты 6-аргиниламинонафталин-сульфамидов общей формулы Н, В 2 = СНз, С 2 Н 5, С С 4 Н 9, т - С 4 Н 9или В 1= В 2= СНз, С- , - Ж ве полупродуктов д ых флуорогенных суб-9,9 0,69 2-0-1,еч,-Гто-).-Ате А 4 р -ВОС,Н -2)-т:Суа-с.-ате 32-16 1 о,"19, а 5 150-166 Ва 1-С-е-С 1-С-А 75 156-1 3 Е,О 1" САИ Тот-Су" Ь-Рте.-Ате бонарин(,Тоа-л-толуолттлъасни еа - нетилсуларснилс В инечаиие. ВОС " трет-бутилоксикарбончл В - бенаилакснкарбон а ННХаракт линблица б и ) диинонаФт =7,2 (01 067 И) Т а еристики спектров Флуоресценции 6 сульфамидов в Фосфатнои буФере, р4 13 47 19 47 640 13 56 568 9 48 410 деЕ" вы ота полосы эииссии, а ии, сние максимальной и использо-);1)1)(ой1836340 Таблица Времена 1 Оа-ного гирролиэа (мин) субстратое лротеолитиескнми фермен тами аэличними3. 0,03120 2 2 08 2 МПримечание, концентра ферментов 1 ОО н 11 10 нй 1 н 1 едактор Г,Бельская аказ 3003Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытия 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ГКНТ ССС оизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101 ео-Ь-Рго-Ь-Агу800 К-О-Ч-Ьуэ-Ь-Ая,11 е.01 у"Ь-Агфу"Ь"Рта-Ь-Лгфу"01 у"Ь-Агв-Ь-АгВ 18: 4801 . 2