Способ стереоспецифического анализа триацилглицеролов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 19) (11) 1) 4 С 0 1 И 33 / НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ В 38олитехнический кий В.Г.ЛобаШк)гля СтереоспециПищевая17-24. дре в,2,(54) СПОСОБ СТЕАНАЛИЗА ТРИАЦИЛ(57) Изобретенжировой промышлспособам стере ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Юнусова С,Г,фический анализ житехнология, 1985,РЕОСПЕЦИФИЧЕСКОГОГЛИЦЕРОЛОВе относится к маслоенности, а именно кспецифического анали за триацилглицеролов, и обеспечивает повышение точности анализа путемувеличения глубины фосфорилирования и повышения чистоты разделения продуктов фосфолиполиза, Способ предусматривает проведение фосфорилирования в атмосфере азота под давлением О, 10-, 0,15 ИПа при температуре (-10) - (-12) С с последующим нагреваниемодо температуры 5-8 С и разделение продуктов фосфолиполиза препаративной тонкослойной хроматографией вдвух системах растворителей - гексан:диэтиловый эфир и хлороформ:метанол:207.-ная гидроокись аммония в соотношении 60:40 и 80:20:2 (по объему) соответственно. 5 табл.20 Изобретение относится к масложировой промышленности и касается способа стереоспецифического анализатриацнлглицеролов.Целью изобретения является павы"шение точности анализа путем повышения глубины фосфорилирования и повышения чистоты разделения продуктовфосфолиполиза, 1 ОСпособ осуществляется следующимобразом,В коническую колбу на 50 мл помещают навеску триацилглицеролов 1 ги добавляют 4 мл 17-ного раствора 15поливинилового спирта, 1 мл 227.-ногораствора хлористого кальция,7 мл аммиачного буФера (1 Я ИН 4 С 1 + 1 М ИНдОН;рН = 8). Смесь выдерживают в термостате 10 мин при 40 С, перемешиваясодержимое мешалкой, и затем вносятв колбу 0,25 г предварительно обезжиренной ацетоном панкреатическойлипазы, Реакцию ведут 20-30 мин прио40 С, постоянно перемешивая и добавляя через каждые 10 мин 1 каплю 4 Мгидроокиси аммония, Для контроляглубины гидролиза через каждые 10 мини последующие 5 мин реакции отбираютпробу и анализируют ее тонкослойной 30хроматографией в системе растворителей петролейный эфир (40-60 С): диэтиловый эфир 7:3 (по объему). Послеподъема фронта растворителей и высу,шивания пластинки на воздухе проявляют пятна продуктов гидролиза впарах иода, обращая внимание на интенсивность пятна Яп,2-(2,3)-диацилглицеролов, подвижность которогохарактеризуется коэффициентом КГ=О,З. 40При высокой активности липазы время гидролиза уменьшают до 5-10 мин,чтобы не допустить расщепления ди,ацилглицеролов до свободных жирныхкислот и глицерина. 45По достижении желаемой глубиныгидролиза реакцию прерывают и добавляют к реакционной смеси 1-1,5 мл 4 Исоляной кислоты и продукты выделяюттрехкратной экстракцией (по 10 мл)диэтиловым эфиром. Эфирные вытяжкиобъединяют, промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции,. сушат безводным сульфатом натрия,Растворитель удаляют на Роторном испарителе.Продукты гидролиза разделяют препаративной тонкослойной хроматографией на пластинках (20 х 20 см) с силикагелем, содержащим 5% гипса (8 г сорбента на 1 пластинку), в системеопетролейный эфир (40-60 С): диэтиловый эфир 60:40 (по объему).К остатку гидролизата после удаления диэтилового эфира добавляют 10 мл хлороформа и по 1 мл этого раствора наносят на 1 О пластинок. В системе растворителей гидролизат разделяется на следующие компоненты: нерасщепившиеся триацилглицеролы (И = 0,6), свободные жирные кислоты, отщепившиеся от Яп- и Яп-положений (КГ = 0,6), сумму Бп,2(2,3)- -диацилглицеролов (Кй = 0,3) и 2-моноацилглицеролы (М = 0,07) . Проявляют вещества, опрыскивая край пластинки 50%-ной серной кислотой и нагревая его или в парах йода.Зоны силикагеля с веществом счищают с пластинок, переносят на воронку Шотта с фильтром 9 4 и с помощью водоструйного насоса смывают липиды с силикагеля несколькими порциями диэтилового эфира. Часть каждой фракции отбирают, жирные кислоты анализируют ГЖХ.Равенство кислотных составов нерасщепившихся и исходных триацилглицеролов служит доказательством того, что липазный гидролнз не сопровождается изомеризацией. Совпадение состава вьщеленных для Яп,2 (2,3)-диацилглицеролов с рассчитанным теоретически доказывает их репрезентативность, т.е, отражает распределение кислот в исходных триацилглицеролах.Теоретический расчет состава Бп--1,2(2,3)-диацилглицеролов 7. Х в Яп,2(2,3)-диацилглицеролах равно 3/4 7 Х в ТАГ + 1/4 7. Х в Бп-моноацилглицеролах, где Х - жирная кислота. Жирнокислотный состав Яп-моноацилглицеролов характеризует набор кислот Яп-положения,Для .Фосфорилирования Бп,2(2,3)- -диацилглицеролов используют свежеперегнанный фенилдихлорфосфат, Навеску 0,07-0,12 г Бп,2(2,3)-диацилглицеролов растворяют в 0,5-1,0 мл безводного диэтилового эфира и охлаждают в льдосолевой смеси до (-10)- о(-15) С. Охлажденный раствор вещества по каплям шприцем приливают к предварительно охлажденной до (-10) д /ч (- )г-15) ( смеси 2 л.; безвоппагс пцрц,пццл и 0,25-0,5 Г) м свох.егере"НанцаГа фЕНИЛДЦХГОРООСф/Л и атМОСфЕРЕ ЛЗОТЛ лтц цЗ,;. ТОЧП;"; ЛГЕг:П О, 11- О, 15 1111 Я. 1 еактивцу;о с/есь после Встряхивания О. ТВ 31 яот В этих услаггвиях на 8-10 ч прц .-8 СЗатем в 1 лакцапл)го смесь 1, - и 1фаСфат;. 1/1 ЕГГЛ З 1 рц ах.ЯжДЕНИИ да ба Г/ яОТ 7г гц 1//1 л Н 1 3 М:1 ПИЭТИ" лс 1 вага фцрл и 5-7 капалпцстцлг:нрав ванно 1 воды, переасят о г;е.цлтель-.5 о ВарацнуЗЛПО./НЕННуЮ 30 М. МРТЛНОЛаг 25 м;, гс Гц,.г.иранаН й Зады, ЗО мл :.: 1 райа 1 гл г 1"Тргл г,л ,ггл СаДРгЖ.Г/Р. 1000 ПКЦ;Г,1 = 0,1, лцзайаафалипцды - КГ = 0,05,фссйллцпалцз заканчивают послепр ек/Я негив р Оста выхапя сВОбОдныхжцрцьх кислот и пцзафосфалцпидов. ,г, РЕЛКИОНН 5 О,СМЕСЬ уларИВЛат На ра:гр,"м пслалит, ге прц температуре цеО С, Даблв.11 я ебаль.це партии,лой (2.-3) ;Х 01;:рбап,лгл НЯ- ,РИЯ, ВНОСЯТ ХЛОРОООРМ;Ый РгСогОР фОС- йатидцлйеналов, Калану про; лваот ХЛаР ОфаРМакг, ОТДЕЛЯЯ НЕ 1 ГРОРЕЛ ГИГО ОВаВ - шце Вг. - 1, 2 (2, 3) -дилдилглцдер ольг, затем сист май растворителей хлороформ. метанол 9;1 (по абъе/у) вымывают сумму Е- и Р ЬОСФятцдил;ецГ:гав, Чистоту продуктов контролируют тацкаслай - цай храматаграйцей в сис г.-.е хлоро- фарМ:МЕтаггаЛ; 25;г.- НЛ;.г ГггглОаакцСЬ Лл- мания 80:20.2 (па 0 бьеу, В этой системе сумма 1, - и 1)-Ослтидцпфе 10- лав имеет К 1 = 0,6.ПрОЛВляют фас 1/ятид 1 пфецаль реакти/вам В 1 ськаВс 110 Г а, ".т слу 7 пт Одна Временно качественна( регкгпей на фосйор.ФО с 1 олиг 1 олц 3 1. - и ) "о Ос/3)Яткдилф е иолов проводят добавляя к 50-100 мг фОСШатггПИ 11 фг 1 ОЛО/ В1 лл ПЭ 1/НОВО го эфира 0,2 мл 0,1 11 раствора хлористого кальция ц раствор 20 мг яда гюрзы (фосйапцплза А) в 1 мл,/трис-буфера с рП 8 О. Полноту гидролиза контролируют -анкослайнай хроматаград:г уд:и:./Ягп в гиде. Язеогро;авлага ко:честна воды. ЗятРм;О 0.тл так 1 р Г Д 5 кт ОВ фасфалиполиза пас3. дале,Яэ т илана 0 эфира и ВОдырлстваряот В смеси, состоящей из;/гца. Хт г 5 ЛТСГРАЦЕ НОГ ПРДОВЛ ТЕЛЬНО(К: л О. б . 2) хлороформ:ме,л;120(-пля гцдраакись аммония вСОСтцат/Егвт 1 80;20:2 (Па ОбЪЕМу), Вэтой системе выделяют полярные фракцгц: лзсфасфалцгцды (КГ = 0,2) ипер лсщепивпгцеся 1)-Осфлтилилфенопы(К. = 0,6),Зоны сорбента, содержащие свободые жирные кислоты, счищают и десорбцруют нРсколькцми цордиями Диэтила,Ного эфира. Элюат осупают, метцлирую.- : аиапцзир 5 ют глзожидкастной хромлтограоп,ец.Паласы сйлцклгеля с 1)-фосфлтидилОпаолп и с лцзофосфолипидамц счи;:.Яот г атггельные колбы и добавляюткажцуо па 3 мп 0,5 М метанольногораствора гидроокиси калия, Спустя15 мин к мылам добавляют по 1 мл 1соляной кцслаты и полученные частично метипировлнные жирные кислоты вью(депяют экстракцией петралейным эфира (гГ)60 С) (3 раза па 5 ул).Смесь фгльтруют через йильтр Р 4воронки Шаттл, из приемной колбы пипеткой отбирают в другую колбу слойБб.петролейцогс эфира, содержащего жирные кислсты, рлстворцтель упаривают,кислоты дометилируют дилзаметлномц анализируют Г)КХ,1430888 Состав свободных жирных кислот,полученных при расщеплении лизофосфатидилфенолов, не должен отличаться от состава кислот Бп-моноацилглицеролов, полученных при липолитическом гидролизе, Совпадение составовподтверждает отсутствие изомеризацийв процессе выделения Бп,2(2,3)-диацилглицеролов и, следовательно, ихрепрезентативность,Из двух продуктов фосфолиполизасостав кислот лизофосфатидилфеноловнепосредственно отражает набор жирныхкислот 1 положения триацилглицеролов,Набор кислот в Бп-положении получают расчетным путем двумя способами: 1) Бп-3 (исходные триацилглицеролы) - (лизофосфатиды) - (2-моноацилглицерины), 2) Бп-2 (Р-фосфатидилфенолы)-(2-моноацилглицеролы).При выбранных режимах обеспечивается увеличение глубины фосфорилирования, снижение деструкции субстратафосфорилирования и образование побочных продуктов реакции, уменьшениепродолжительности анализа, повышениечистоты выделяемых продуктов фосфо-,липолиза. Избыточное давление кейтрального газа над реакционной средой, с 3одной стороны, предотвращает окислительные процессы в продолжительнойреакции фосфорилирования, а с другой,препятствует конденсации влаги в реакционную смесь из газового составаколбы, что улучшает полноту фосфорилирования. Двухстадийный температурный режим фосфорилирования обеспечивает отсутствие побочных продуктовреакции на первой стадии и повьппениеглубины на второй стадии, При выходе .за пределы параметров способа точность анализа остается не уровне прототипа. 5 10 15 20 25 Из данных, приведенных в табл, 2,35 видно, что при названных условиях 40 липолиза. 45 50 55 Пример 1. 0,1 г 1,2 (2,3)-диацилглицеролов, полученных путемгидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировалифенилдихлорфосфатом в токе азота прио,давлении 0,10 МПа, температуре - 10 С,выдерживали до завершения реакцииопри +5 С в течение 8 ч, Полученныефосфолипйды после фосфолиполиза разделяли тонкослойной хроматографиейпоследовательно в двух системах растворителей гексан:диэтиловый эфирПараллельно проводили экспериментпо режимам, указанным в прототипе(табл, 1),Из результатов, приведенных втабл. 1, видно, что при избыточномдавлении в атмосфере азота при снижении температуры в начальный периодофосфорилирования до -10 С и разделении продуктов фосфолиполиза последовательно в двух системах глубина фосфорилирования увеличивается на 253,содержание продуктов деструкции .уменьшается на 207, длительностьпроцесса сокращается на 8 ч и обеспечивается полное разделение продуктовфосфолиполиза,П р и м е р 2. 0,1 г 1,2(2,3)-диацилглицеролов, полученных путемгидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота приодавлении 0,13 МПа, температуре - 11 Совыдержали смесь при +7 С в течение9 ч до завершения реакции. Продуктыфосфолиполиза последовательно разделяли в системах растворителей гексан:диэтиловый эфир (60:40), хлороформ:метанол:203-ная гидроокись аммония (80:20:2),Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. .") . глубина фосфорилирования увеличивается на 252, содержание продуктов деструкции снижается на 10 Ж, длительность процесса фосфорилирования сокращается на 9 ч, обеспечивается абсолютное разделение продуктов фосфо-. П р и м е р 3. 0,1 г 1,2(2,3)-диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фе-нилдихлорфосфатом в токе азота приодавлении 0,15 МПа, температуре - 12 С,овыдерживали при +8 С в течение 10 чдо завершения реакции, продукты фос-.фолиполиза последовательно разделялив системах растворителей; гексан:диэтиловый эфир (60:40), хлороформ;метанол:20%-ная гидроокись аммония10 15 20 25 30 35 40 45 50 Из результатов, приведенных втабл, 3 видно, что в данном случаеглубина фосфорилирования увеличивается на 257, содержание продуктов деструкции снижается на 207, длительностьпроцесса снижается на 8 ч, обеспечивается абсолютное разделение продуктов фосфолиполиза.Пример 4, О, 1 г 1,2(2 3)-диацилглицеролов, полученных путемгидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота приодавлении .0,09 ИПа, температуре -13 С,овыдерживали при 10 С до завершенияреакции в течение 7 ч, продукты фосфолипализа последовательно разделяли в системах гексан:диэтиловый эфир(табл. 4),Из результатов, приведенных втабл. 4, видно, что при осуществлении метода по режимам, выходящим за .оптимальные значения, из поставленныхцелей достигается только одна - снижение содержания продуктов деструкции, в то время как глубина фосфорилирования, чистота разделения продукта остается на уровне прототипа.П р и м е р 5. 0,1 г 1,2(2,3)-диацилглицеролов, полученных путемгидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота приодавлении 0,20 ИПа, температуре -8 С,выдерживали реакционную смесь прио+5 С в течение 14 ч, продукты фосфолиполиза последовательно разделялив системах гексан-диэтиловый эфир(табл. 5),Из результатов,.приведенных втабл. 5, видно,что при осуществленииметода по режимам, выходящим за границы оптимальных режимом, не достигаются чистота разделения продуктов фосфолиполиза и глубина фосфорилирования.Формула изобретенияСпособ стереоспецифического анализа триацилглицеролов, включающий гидролиз пробы панкреатической липазой, выделение из продуктов гидролиза 2-моноацилглицеролов и смеси 1,2 (2,3)-диацилглицеролов препаративной тонкослойной хроматографией, определение жирно-кислотного состава 2-моноацилглицеролов в 2-положении газожидкостной хроматографией, фосфорилирование смеси 1,2 (2,3)-диацилглицеролов фенилдихлорфосйатом при отрицательных температурах с последующим нагревом до положительныхтемператур и выдержкой в течение нескольких часов, выделение из продуктов реакции смеси Ь- и Р-фосфатидилфенолов колоночной хроматографией, их гидролиз фосфолипазой А , .выделение из продуктов фосфолиполиза Ь-лизофосфатидилфенолов препаративной тонкослойной хроматографией в системе растворителей хлороформ:метанол, определение их жирно-кислотного состава в 1-положении гаэожидкостной хроматографией и определение жирно-кислотного состава в 3-положенин расчетным путем, о т л и ч а - .ю щ и й с я тем, что, с целью повы-щения точности анализа путем увеличения Глубины фосфорипирования и поовышения чистоты разделения продуктовфосфолиполиза, фосфорилирование ведут в атмосфере азота под давлением 0,10-0,15 Мпа при температуре (-10)- (-12) С и нагрев ведут до температу- ры 5-8 С, при выделении продуктов фосфолиполиза в систему растворителей хлороформ:метанол дополнительно вводят 207-ную гидроокись аммония, а в качестве второй системы растворителей используют гексан и диэтиловый эфир при соотношении растворителей 80:20:2 и 60:40 по объему соответственно,1430888 10 Показатели Способ б 5 90 10 70-80 100 Способ Показатели Прототип 5 18 100 70 Глубина фосфорилирования, Еот суммы диацилглицеролов Содержание продуктов деструкции / Длительность процесса фосфорилирования, ч Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, 7 Глубина фосфорилирования, Еот суммы диацилглицеролов Содержание продуктов деструкции, 7. Длительность процесса фосфорилирования, ч Чистота разделения продуктовфосфолиполиза, Е Таблица 1 Прототип Предлагаемый приР=О,1 МПа,- -10 С г.=-+5 С Таблица 2 Предлагаемый приР = 0,13 МПа,о-- 11 С1430888 Способ Показатели Прототип 90 18 10 100 70 Способ Показатели рототип 65 18 25 18 70 70 Глубина фосфорилирования, 7.от суммы диацилглицеролов Содержание пр одуктовдеструкции, 7 Длительность процесса фосфорилирования, ч Чистота разделения продуктовфосфолиполиза, 7. Глубина фосфорнлирования,7 от суммы диацилглицеролов Содержание продуктовдеструкции, 7. Длительность процесса фосфорилирования, ч Чистота разделения продуктовфосфолиполиза, 7 12Таблица 3 Предлагаемый приР = О, 15 ИПа1430888 13 Показатели Способ Прототип Глубина фосфорилирования,% от суммы диацилглицеролов 65 65 Содержание продуктовдеструкции, % Чистота разделения продуктовфосфолиполиза, % 70 70 Составитель В.ГордеевТехред Л.Сердюкова КорректоР М,Васильева Редактор М.Циткина Тираж 84 Заказ 5338/4 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 а Длительность процессовфосфорилирования, ч 14Таблица 5 Предлагаемый приР = 0,2 МПас =-8 С