Способ получения пептидов, содержащих сульфат тирозина

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(53) УД 1 547.964; .4. 07(088. 8) по делам изобретеиий и открытийИзобретение относится к способу получения пептидов, содержащих 6"20 остатков аминокислоты, а в частностипанкреоциминпептидов, для биологической активности которых остаток тирозина должен быть этерифицирован серной кислотой, и используемых в фармацевтике их солей, Ыелудочно-кишечный гормон холецистокинин/пакреоцимин (Р 2), его С-конечный гепта- и окта-, 10 пептид и церулеин, декапептид подобной последовательности из кожи лягуш" ки Ну 1 е саепт 1 ае обладают способно". стью сокращать желчный пузырь, расслаблять желчный проток, стимулиро вать выбрасывание энзимов экзокринной поджелудочной железы и ускорять прохождение по кишечнику. Они могут быть использованы, например, в кацествес вспомогательного средства при рентге- Зт новских исследованиях и имеют также перспективу использования в терапии.Они имеют следующие Формулы: Р 2октапептид 8 ьг 0)-Ие - И "Тг-Ме 1- цгРйеИН щ Церулеин РСА-С 1 п-Аяр-Туг(ЯО )-ТЬг-С 1 у-Тгр-МейЬКроме того, гумангастрин 11, гормон, стимулирующий кислотную секрецию в желудке, а также аналог С-конечного церулеин-гептапептида,подавляющий эту кислотную секрецию, содержат остаток сульфата тирозина.Известны получение и биологическая активность церулеина и производ" ного, в котором имеется ацетилирована гидроксильная группа,треонина.Введение остатка серной кислоты в последовательность декапептида осуществляют .с помощью комплекса пиридин-БО. Превращение на этой стадии, очевидно, не количественное: Затем удаляют ацетильную группу ттутем щелочного омыления. После необходимой очистки выход продукта составляет 40 е.Известно получение С-конечного октапептида панкреоцимина и его фарма" цевтическое использование и, связцва5 920 состоять из 2-6 остагков аминокислоты и содержать остаток тирозина, этерифицируется посредством воздействия избытка комплекса пиридин-ЯО или смесь из пиридина, хлорсерной кислоты Б в диметилформамид/хлороформе и серной кислоты. При сульфатировании Вос-Тут-Мег-С 1 у-ОАг 30-кратным избытком С 1-БОН в смеси достигается 100 превращения. Расщепление связи эфир серная кислота из-за кратковременной кислой реакции при обработке реакционной смеси предотвращается помещением в щелочную буферную систему, например ХН/М 1 С 1. Продукт реакции 15 может быть легко извлечен из буферной смеси смесью высших спиртов, например д-бутанолом или эфиром уксусной кислоты с выходом 703.Преимущество способа заключается 20 в том, что могут быть использованы также и загрязненные продуктами 0- ацилтирозина производные защищенного тирозина, например ХО-М-Вос-Тут, очистка которых обходится очень до рого. При обработке выделением полученный 0-ацилтирозиновый пептид коли. чественно удаляется из тирозинсульфатного пептида. Вос-Тут(ЯО ) -Ме 1- -С 1 У-ОЛ 1 посредством щелочйого омы- зо пения переводится известным образом в трипептидную кислоту и выделяется посредством н-бутанол/уксусного эфира (выход 753)И-защищенная пептидная кислота, содержащая сульфат тирозина, может быть обычным методом сконденсирована в пептид со свободной . -аминогруппой. Для связывания Вос-Тут(ЯОь) -Ме 1- С 1 у с Ттр-Ме 1-Ляр-Рйе%1 используется щ преимущественно синтез смешанных ангидридов (883 выхода)Получение Вос-защищенного -конечного панкреоцимингептапептида Вос-Тут(Ю) -Ме 1- 61 у-Тгр-Мей-Акр-РЬе%1 и рои сходит таким способом с более высоким общим выходом и более высокой частотой, чем известными способами синтеза, в которых сульфатирование предпринимается как последняя стадия реакции,За счет предложенного способа обеспечивается полное расщепление азотно-, защитной группы при одновременном минимальном кислотном гидролизе связи эфир-серная кислота, т.е. при минимальном отщеплении остатка ЯО от гидрокислотной группы тирозина, а также при одновременном минимальном 053 6 образовании побочных продуктов посредством циклического защемления уостатка триптофана.В качестве благоприятного условиядля отщепления бутилоксикарбонильнойзащитной группы установлено использование 75 85-ной трифторуксусной кислоты в присутствии избытка меркаптоэтанола и метоксибензола, При этомполностью исключаются побочные реакции на триптофане, Гидролиз эфира серной кислоты остается ниже 204. Оценьвыгодным является использование бутилоксикарбонильной защитной группы посравнению с известными защитными груп"пами, которые могут отщепляться вслабокислой, нейтральной или щелочной средах,Получаемый идентичный в последовательности пептид со свободной гидроксильной группой на тиразоле оченьлегко отделяется последующим азотнымацилированием, если это необходимодля предусмотренной цели использования.Ацилирование полученного такимспособом 6-конечного панкреоцимингептапептида Туг (ОЮ) -Ме 1-С 1 у-ТтР-Ме 1-Ляу-РйеМ 1 осуществляют реакцией с активированными эфирами соответствующих карбоновых кислот, например с эФиром 2,ч,5-трихлорфенил-и-гидроксифенил-уксусной и этиловым эфиром янтарной кислот или с ангидридом янтарной кислоты, Для этогогепапептид освобождают от трифторацетата слабым органическим основанием, преимущественно Ы-этилморфолином (ИФЦ . Ацилирование проводятпри добавлении ХХЧ, Ион М при переработке остается на сульфированныхгептапептидах, Из полученных такимобразом ацил-РЕ-гептапептидовсукци.нил-РЕ-гептапептид, обозначаемый ещекак дезамино-РЕ-октапептид,(Х =НООС-СН,СНз-СО) показывает высокуюактивность при воздействии на желчный пузырь, которая почти равносильна активности церулеина. Производныеи-гидроксифенилацетила и этоксисукцинила достигают только 13 активности церулеина,Отделение "десульфатированных" побочных продуктов, может. осуществ. ляться противоточным разделениемпосредством хромотографии на декстрановом геле. Так как молекулярные ве" са обоих соединений различаются нез"7 9200начительно, эффект разделения поразителен,П р и и е р 1, Йммонийная сольХ-третбутилоксикарбянол-о-сульфаттирозил,-метионил-глицин-этилового 5эфира,28 г (0,036 моль) пиридина вб10 мл хлороформа охлаждают дс -10 С.При перемешивании 30-40 мин в этотраствор добавляют по каплям 2,4 мл(0,037 моль) хлорсерной кислоты, причем следует поддерживать температуру+1 О С. По окончании добавления реакционную массу перемешивают еще 30 минпри 0-10 С, и добавлением затемо10 мл дилатилформамида смесь комлекса пиридин-ЯО и пиридингидрохлоридапереводят в раствор. 0,600 г(1,21 моль) Вос-Тут-Ией-С 1 у-ОЛьрастворяют в 10 мл диметилформамида 20и 10 мл пиридина и при перемешиваниидобазляют к раствору комплекса пиридинз, Затем 5 ч смесь перемешиовают, грея на водяной бане при +35 С,растворитель удаляют в вакууме с 25помощью масляного насоса при +45 С,и маслянистый остаток при (-5) -0 Спри сильном перемешивании очень быстро смешивают с 200 мл О, 1 1 Я-ЫИС 1//О, 1 К-М буферного раствора (рН 10,5)зоЗатем значение рН этим буферным раствором быстро устанавливают на 7,0.Выпавшее в осадок из водной фазытвердое вещество переводят в раствордобавлением 70 мл смеси н-бутанол//уксусный эфир (2;1), Водную фазуотделяют, насыщают Ка 01 и трехкратно экстрагируют 70 мл указаннойсмеси, Органические экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором ЫаС 1 до тех пор, пока не исчезнут ионы ЯО и органическую фазусушат над ХйЮ. Раствор упариваютна половину, Раствор, содержащийи-бутанол для отделения Вос-Туг(Вос) - 5-ИеС-С 1 у-ОЛ медленно при перемешивании вливают е 2,5-кратное количество холодного эфира, Выпавшийе осадок продукт отсасывают, гщательно промывают эфиром и петролейнымэфи ром и суша т е еа кууме над Р О .Выход,0,50 г (703). Т.пл. 139-141 СГА 1 =-(-9,8) ,=-1,0 в диметилформамиде) Аминокислотный анализпосле щелочного гидролиза: 1 угЫОч0,87; Туг 0,05; МеС 0,89; Яу 1,О.Чистоту продукта проверяют тонкослойной хроматографией на силуфоловыкпластинках фирмы (авалер" ЧССР в 53 8системе (А) -Вц% (ледяная уксуснаякислота/вода (4; 1: 1) и (В) пиридин/(5 мл смеси вода - этанол в соотношении 1:1 и при комнатной температуре, 45 мин перемешивают с 3 мл1 н. ИаОН. Раствор упаривают в роотационном испарителе при +40 С дополовины его объема и затем разбавляот " 5 мл воды, Устанавливаютн. НГ 1 при +5 С рН раствора 3,0.Водную фазу экстрагируют 50 млсмеси н-бутанол/уксусный эфир (2:1),затем насыщают Ха 01 и тщательновзбалтывают с двумя порциями указанной смеси растворителя до 50 мл каждая. Органические фазы объединяют,промывают насыщенным раствором МаС 1и сушат над ХаКОРастворитель удаляют в вакууме при +40 С, остаток сушат многократным выпариванием при добавлении хлороформа. Стекловидный остаток растирают со смесью эфир - петролейный эфир, твердое вещество тщательно промывают эфиром и петралейным эфиром и высушивают в вакууме над Р О О, Выход: 0,360 г (753); Т.пл. 196-198 С.ь. = 6,8 (С,5 в диметилформамиде)= О,б 4; Р = 0,57.П р и м е р 3. Натриевая соль Ж-третбутилоксикарбонил-О-сульфат- -Е-тирозил-ь-метионил-глицин-Ь-триптофил,-метионил.-аспартил,-фенилаланинамида.0,360 г (0,631 моль) Вос-Тут(50Ка) -Ией.-Иу-ОН растворяют в 20 мл диметилформамида, добавляют 0,079 мл (0,631,моль) Х-этилфорфолина и реакционный раствор охлаждают до -25 С, Добавляют к нему 0,086 л (0,631 моль) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты и затем выдерживают для активирования 10 мин при -25 С, 0,400 г (0,631 моль) Ттр-Ией-ЛБреЯ 1 растворяют отдельноЕв 20 мл диметилформамида, смешивают с 0,079 мл (0,631 моль) М-этилморфолина и реакционный раствор охлажда15 50 9 9200ют до -25 фС. Полученную смесь добавляют к раствору смешанного ангидридаВос-Туг(ЮзХа)-Ме 2-С 1 у-ОН. Затемсмесь перемешивают 30 мин при -25 Си ч ц при комнатной температуре. Выпавший в осадок амингидрохлоридотсасывают, растворитель удаляют ввакууме с помощью масляного насосаи вязкотекуций остаток растирают нахолоде со смесью н-бутанол - эфир 10(1:1) . Твердое вещество отсасывают, тщательно промывают хлороформоми высушивают в вакууме над РОВыход: 0,650 г (883)." Т,пл, 184186 С,Г 33 = -7 1)(С=О 25 в диметилформамиде)Щ О = 3,7 (С=0,25 в 110)Аминокислотный анализ после щелочно- .го гидролиза: ТутЮО, 88; Тут 0,03; 2 вР 1 те 0,9; Льр 1,0, Р = 0,64;й = 0,67.П р и м е р 1. О-сульфат-Ь-тирозил-Ь-метионил-глицин-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспартил,-фенилаланин-амид-трифторацетат,0,650 г (561 ;моль) Вос-Тут(ЯСМа) -Мет.-С 1 у-Ттр-Мет.-ЛБР-РАМН смешивают с 0,5 мл метоксибензола и 0,1 мл1-меркаптоэтанола и затем 20 минЗоперемешивают с 125 мл 713-ной трифтороуксусной кислоты при 18-20 С. Реакционный раствор добавляют в двукратное количество смеси эфир - петролейный эфир (1;1) и отсасывают от рых 35лого осадка, Тщательно промывают осадок петролейным эфиром и высушиваютв вакууме над Р 0,0/КОН. Выход;0,550 г(85 о) Е = Г 52 и О 62 (около203); Й = 0,57 и 0,77 (около 20 Р;).Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза; Тут (И 11) 0,68;Тут 0,23; Лзр 0,74; С 1 у 1,0; Ме 11,6; РЬе 0,9; Тгр 1,1. П р и м е р 5. И-сукциноил-О- -сульфат,-тирозил-Ь-метионил-глицин-Ь-триптофил-метионил-Ь-аспартил,-фенилаланинамид.0,550 г (0,000 ч 8 моль) продукта. полученного в примере 4, растворяют в 1 О мл диметилформамида, при перемешивании смешивают с 181 мл (0,001 М моль) М-этилморфолина (никакое другое основание не применять) и охлаждают реакционный раствор .до 0 С. Затем в тецение 10 мин добавляют при перемешивании 0,062 г (0,00062 Й моль) янтарного 53 10 ангидрида и одновременно добавляютпо каплям 0,079 мл Х-этилморфолина,Реакционный раствор перемешиваютеще в течение 3 ц и оставляют наноць при +1 С.Растворитель удаляют в вакуумена масляном насосе при +ч 0 С, и вязкий остаток растирают с холоднойсмесью н-бутанол - эфир, твердоевещество отсасывают, тщательно промывают тетрахлорметаном, эфиром ипетролейным эфиром и высушивают ввакууме над Р О Выход: 0,588 г(910). Т.пл, 172- 175 С, Аминокислотный анализ после щелочного гидролиза: ТутЮ 0,72, Тут 0,18; Аяр1,0; С 1 у 1,1; Ме 1 1,6; РЬе 0,93;Ттр 0,75; й, = 0,53 и 0,70 (л 20 о);0,64; и 0,68. ( 200).Очистка гель-фильтрацией на сефадексе С,Набухший в течение несколькихчасов сефадекс Св О, 1 н.раствореацетата аммония .(прибавлением аммиакак 1 н, уксусной кислоте до рН 6,5)вводят в колонку длиной 120 см идиаметром ч см. Загружают раствор200 мг неочищенного дезаминоктапептида в 8 мл 0,1 н. раствора ацетатааммония и 2 мл диметилформамида иэлюируют 0,1 н, раствором ацетатааммония. При скорости прохождения15 мл/ч определяют концентрацию пептида измерением экстинкции при 280 нм(Ичсотс 1), элюат собирают фракциями по 8 мл. Фрации 9-31 содержатдезамино-РЕ-октапептид, фракции 32"3 ч - десульфатированный побочныйпродукт. Выход 0,116 г (603) и0,055 г (1163) десульфатированногогептапептидад.= 3,Й + 0,5 С = 0,25 в водеГ 4.в = 9,ф + 1 С = 0,25 в диметилформамидеАминокислотный анализ после щелоцного гидролиза,Тут(ОЮ ) Тут Азр С 1 у Ме 1 Рйе ТтрОэ 80 Оэ 08 1 эО 1 эО 1)64 0790 1 э 8 П р и м е р 6, К-этоксисукцинил- "О-сульфат-Ь-тирозил-Ь-метионил-глицин-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспар",тил-Ь-фенилаланин-амид.0,190 г (0,167 ",моль) Тут(060)- -Ме 1-С 1 у-Ттр-Ме 1-Азр-РЬе ИН(при- мер ч) растворяют в 10 мл диметил- . формамида и добавляют 0,0182 мл (О, 1 ч 6 моль) И-этилморфолина. Реакционную смесь охлаждают до 0 С иСоставитель В. ВолковаТехред Т,Маточка Корректор Л, Бокшан Редактор И. Митровка Заказ 2262/23 Тираж 448 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 . Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 13 92 щепляют омылением, защищенный сульфированный трипептид конденсируют с Тгр-Мей-Аяр-Р 11 еМв и реимуще ст венно методом смешанных ангидридов, и полученный после отщепления защитнойгруппы гептапептид ацилируют при добавлении слабой органической щелочи, преимущественно И-этилморфолина.3, Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при перера. ботке продукта после сульфирования используют воднощелочной буферный раствор, преимущественно ИН/МНС 1. 4. Способпоп 2, отличаю-щ и й с я тем, что для выделения за.щитного сульфированного,трипептидаиспользуют смеси высших спиртов с 0053 14уксуснокислым эфиром, преимущественнон-бутанолэтилацетат.5, Способ по и2, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, в качестве защитной группы используют третичнйи- бутилоксикарбонил и ее отщеплениеот сульфированного гептапептида осу-ществляют 75-853-ной трифторуксуснойкислотой при добавлении и избытке 1 о метоксибензолмеркаптоэтанола при комнатной температуре.6. Способ по пп.1, 2 и 5, о т .л йч а ю щ и й с я тем, что получаемые,при кислотной. обработке Фракции де-, 15 сульфатированного пептида такой жеаминокислотной последовательности.отделяют после ацилирования аминогруппы.