Способ получения октапептида

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ СТВУ УСВ АВТ ИЯ ОКТАПЕПТИия октапеп тальной ь-Рго,р(б.с 3-Ъеб ц)обцконденсации, о тя тем, что, с цеода и оптическойоединения, пристве исходных фрагмо б ва) Пептид ч.1,и -1.1 з(Ьос).ТВг(бц)0 Ьм блик. 197 7 г Ь и ) -Тйг -РгО ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРпО делАм изОБРетений и ОтнР 1 тий(71) Институт эксперимдокринологии и химии гАМН СССР(57) Способ получформулы7-Жу-РЬе-РМ Тч г(Ьй)путем фрагментнойл и ч а ю щ и й слью увеличения выхчистоты целевогоконденсации в качментов испольэуют2.-С С -Рйе. -РНеОНВос Е - ОН Н 92% СОН Н ,В 100% в Ос УПа 52% , ц сОВц УШсВц ОМе 2 У 1 Е 887 /, Вос Вц Ш С Н Во с ц сител Изобретение относится к усовершенствованному способу получения октапептида формулы 1 Х-И .РИа-Ровс-Т(ЬЧ) -4 Ьс -Р 80-ЬР(ЬОС)-ТИП(Ьч)-ОЬи являющегося по своей аминокислотной последовательности фрагментом 23- 30 В-цепи инсулина человека и применяемого в качестве:нромежуточного соединения при пол 8 учении инсулина человека, В пептидной химии широко используют при построении пептидной цепи конденсацию фрагментов с защищенными функциональными группа" ми, не принимающими участия в конденсации.Известен способ получения октапептида формулы 1, заключающийся в синтезе двух пептидных фрагментовЕу-РЬе РЬе-Тут(Вц )-ТРОН и НРго,уз(Вос)-ТЬг (Вцф)ОВц1 2 3 4 Вос - 0-П Вос - ОН Н - О-Пр и м е ч а н и е. П - полимернь и последующей их конденсации в молекулу октапептида., т.е. по схеме(1-3)+(4-5)/+(6-8) в в ) 1-8 (см. схему 1).Недостатки известного способа -низкий выход целевого продукта(24 %), его невысокая оптическаячистота (13 - 37,7 ), последнееделает получаемый известным способом 10 октапептид малопригодным для. превращения в инсулин человека.Целью изобретения является повышение выхода октапептида и увеличение .его оптической чистоты, 15 Поставленная цель достигается описываемым способом получения октапептида формулы 1, заключающимся в конденсации двух исходных фрагментовЕ-И 1- РМ - Риса Н и2 О Ч-т (Ь )-ТЬ-Р 8 О.1 1(Ьос)-ТЬГЬ )-ОЬСхема 1 (известный способ) 5 6 7 8ТЬг Рго 1 уз Т 1 т бос 8с 2- ОН НОВцЬч82ОВц уП Вос Вц100% / 2 - ОН Н ОВцВос Вц/ l / / 0 бонилП). и амирбо-.или 1 7. ль) Отличительным признаком описываемого способа является использование в качестве промежуточных соединений фрагментов (1-3) и(4-8), т.е. прове.дение синтеза по схеме (1 -3)+/(4-5)+ (6-8)/.Описываемый способ позволяет увеличить выход на стадии конденсации2 3 4Оиру РЬе РЬе Туг 1, Получение И-бензилоксика глицилфенилаланилфенилаланина1.1. Присоединение С-концев нокислоты к полимеру-носителю.Перемешивают в течение 44 ч мягком кипячении смесь 10,6 г (40,0 ммоль) И-трет-бутилоксик нилфенилаланина, 20,0 г хлорме рованного сополимера стирола с дивинилбензола (содержание хло 40,0 ммоль) и 5,04 мл (36,0 мм 4фрагментов с 53 до 84 7 с увеличением выхода целевого продукта до 46 Х (почти вдвое). 5 При этом повышается оптическая чистота целевого соединения:3 -520Синтез осуществлен по схеме 2.Схема 2 (описываемый способ)6 7 8Рго Ув П триэтиламина в 80 мл этилацетата.Далее реакционную смесь охлаждают 0 до 20 С, полимер отфильтровывают, пофследовательно промывают этилацетатом, этанолом, водой, этанолом, .диоксаном, обрабатывают 4 н. раствором хлористого водорода в хлорис том метилене, промывают. диоксаноми эфиром и сушат в вакууме. Для определения количества аминокислотына полимере-носителе 20 мг полу20 30 40 над БаБО . Этиацетатный растворупаривают, маслообразный остатокхроматографируют на колонке о силикагелем ".Вельм 1 (ФРГ), используядля элюирования бензол и затемсмесь бензола с этилацетатом 1:2.Фракции, содержащие основное вещество (контроль с помощью ТСХ), упаривают, остаток сушат в вакууме., Выход 3,20 г (72,77.), белое кри Осталлическое соединение, т.пл, 9495 С, /ю/ - 8,5 (с 1, МеОН),ВГ 0,7 (2-бутанол 3 %-ный аммиак 3:1), ВГ 0,32 (этилацетат-петролейный эфир 3:1) (ТСХ),15Найдено,7.: С 64,05; Н 7,19;Б 5,69.,Са 6 Нз М От.Вычислено,7: С 64,17; Н 7,04;Б 5,75.П.2. Я-Бензилоксикарбонил-третбутилтирозил-треонин (1 уа).К 0,56 г (1,15 ммоль) метиловогоэфира И-бензилоксикарбоннл-третбутилтирозил-треонина (см. п. П.1)в 5 мл метанола добавляют 1,18 мл(1,18 ммоль) 1 н, МаОН и перемешиваоют 3 ч при 20 С. Реакционную смесьохлаждают до 0 С, подкисляют 1 н. соляной кислотой до рН 6-7 и упаривают., Остаток растворяют в 50 мл0,05 н. ИаОН, экстрагируют этилацетатом, водную фазу отделяют, охлаждают до 0 С и подкисляют 1 н. солянойкислотой до рН 3. Маслянистый осадокэкстрагируют этилацетататом, промывают водой, сушат над Ба 80 и упаривают. Образовавшийся твердый остатоксушат в вакууме,Выход 0,51 г (947), белое аморфное вещество. /с /, - 2,7 (с 1,й 5 оМеОН). ВГ 0,25 (2-бутанол%-ный аммиак 3:1). В 1 0,32 (ацетон-хлороформ 1;1), ВГ 0,40 (хлороформ-метанол 18:2,5) (ТСХ).Найдено,7.: С 63,31; Н 6,76;45Б 5,99.Вычислено,7: С 63,32; Н 6,83;Б 5,92.П.З. трет-Бутиловый эфир И -бензилоксикарбонил-И -трет-бутилоксикарбониллизил-трет-бутилтреонина(у)К раствору 0,94 г (4,0 ммоль)трет-бутилового эфира О-трет-бутилтреонина в 5 мл ТГФ добавляют ,54 г(4,0 ммоль) И -бензилоксикарбонил-Итрет-бутилоксикарбониллизина в 5 мл ТГФ и 0,54 г (4,0 ммоль) 1-окО сибензотриазола, охлаждают до 0 С и вносят 0,84 г (4,0 ммоль) ДЦГК в 2 мл ТГФ, Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 0 С при 20 С,осадок удаляют фильтрованием, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, 2 7-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором бикарбоната натрия и водой и сушат над Ба 80 . Этилацетат упаривают, остаток (масло) хроматографируют на сипикагеле Вельм, используя в качестве элюента смесь этилацетата и петролейного эфира 3:1. Фракции, содержащие основное .вещество (ТСХ), упаривают, остаток сушат в вакууме.Выход 1,97 г (82 %), бесцветное масло. /с/р+6,6 (с 1, СНС 1). ВГ О,65 (ацетон - хлороформ 1:2), ВГ 0,45 (этилацетат-петролейный эфир 3:1)(ТСХ).Найдено,%: С 62,39; Н 8,59;7 ф 31.СЗ 1 НБ О.Вычислено,%: С 62,70; Н 8,66; И 7,08.П.4. трет-Бутиловый эфир Б -третбутилоксикарбониллизнл-трет-бутилтреонина (Уа).В раствор 1,42 г (2,40 ммоль) трет-бутилового эфира-бензилоксикарбонил-Б -трет-бутилоксикарбониллизил-третбутилтреонина (см, и. П.З) в 25 мл метанола вносят 50 мг палладиевой черни и смесь перемешивают в атмосфере водорода .в течение 5 ч. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме, остаток сушат в вакууме.Выход 1, г (100 %), масло. В 0,35 (хлороформ-метанол 9:1), ВГ 0,80 (2-бутанол%-ный аммиак 3:1) (ТСХ).П.5. трет-Бутиловый эфир Б-бензилоксикарбонилпролил, -трет-бутилоксикарбониллизил-трет-бутилтреонина (У 1).К 1,1 г (2,4 ммоль) трет-бутиЕлового эфира И -трет-бутилоксикарбониллизил-трет-бутилтреонина (см. п. П.4) в 5 мл ТГФ добавляют раствор 0,56 г (2,4 моль) И-бензилоксикарбониппролина в 5 мл ТГФ и 0,34 г (2,4 ммоль) 1-оксибензотриазолаеи охлаждают до 0 С. Далее прибавляют 0,52 г (2,4 ммоль) ДЦГК в 2 мп ТГФ и реакционную смесь переме 9 11шивают 1 ч при 0 С и 5 ч при 20 С.Осадок отфильтровывают, Фильтрат упаривают, остаток растворяют в этилацетате и промывают водой,2 7.-нойлимонной кислотой, 5 7.-ным бикарбонатом натрия и водой. Этилацетатныйраствор сушат над На,800, унаривают, остаток кристаллизуют из смесиэтипацетата и петролейного эфира исушат.Выход 1,42 г (85 7.), белое кристаллическое соединение, т.пл. 109110 С. /с / - 46,0 (с 1, МеОН),ВГ 0,80 (2-бутанол7.-ный аммиак3:), ВГ 0,63 (ацетон-хлороформ 1:1),ВГ 0,36 (ацетон-хлороформ 1:3) (ТСХ).Найдено,7: С 62,69; Н 8,46;Н 8,09.СмНН 0, .Вычислено, 7.: С 62,58; Н 8,46;Н 8,11.Аминокислотный анализ: Рго 1,00;Ьуз 1,04; Тйг 0,95,П.б. трет-Бутиловый эфир пролилН -трет-бутилоксикарбониллизилтрет-бутилтреонина (У 1 а).В раствор 0,621 г (0,90 ммоль)трет-бутнлового эфира Н-бензилоксикарбонилпролил-Н -трет-бутилокси-..(см. п. П,5) в 10 мл метанола вносят100 мг палладиевой черни и смесь перемешивают в атмосфере водорода втечение 6 ч. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают ввакууме, остаток также сушат в вакууме.Выход 0,53 г (100 7),.масло.Ы 0,51 (1-бутанол-уксусная кислотавода 4:1:1), В 1 0,40 (2-бутанол 3 7-ный аммиак 3:1) (ТСХ).П.7. трет-Бутиловый эфир Н-бензилоксикарбонил-трет-бутилтирознлтреонил-пролил-Н -трет-бутилоксикарбоннллизил-трет-бутилтреонина (УП),К раствору 0,53 г (0,90 ммоль)трет-бутилового эфира пролил-Н -третЕбутилоксикарбониллиэил-трет-бутилтреонина (см. п. П.б) в 2 мл ДМФАприбавляют 0,42 г (0,90 ммоль) Н-бензилоксикарбонил"0-трет-бутилтирозилтреонина (см. п. П.2) в 2 мл ДИФАи 0,122 г (0,90 ммоль) 1-оксибенэотриазола, после чего при 0 С вносят0,196 г (0,90 ммоль) ДЦГК вмлДИФА. Реакционную смесь перемешиавают 1 ч при 0"С при 20 С,. осадокотфипьтровывают, к фильтрату добавляют 40 мл охлажденной воды (5 С) и47010 1 О образовавшееся масло .экстрагируютэтилацетатом (3 раза по 30 мл).Экстракт промывают насыщенным раствором хлорида натрия, 5 7-ным раствором лимонной кислоты (3 раза по30 мл), 5 7-ным раствором бикарбоната натрия (3 раза по 30 мл) и водой, .сушат над На 80 и упариваютОстаток хроматографируют на силикагеле Вельм , последовательно используя для элюирования бензол и смесибензола с этилацетатом 1:1 и 1:2,Фракции, содержащие по данным ТСХ основное вещество, упаривают в вакууме, твердый остаток сушат в вакууме,Выход 0,65 г (60 7.), белое кристаллическое соединение, т.пл. 8790 С / в/1 - 48,1 (с 1; МеОН),ВГ 0,53 (ацетон-хлороформ 1:1),ВГ 0,62 (хлороформ-метанол 18:2,5),ВГ 0,86 (н-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:1) (ТСХ).Найдено,7: С 62,97; Н 8,23;Н 8,28.С Нег Нь ОзВычислено, : С 62,94; Н 8,9;И 8,30.Амннокислотный анализ: Туг 0,91;Тйг 2,01; Рго 1,00; Ьуз 1,10.П.8, трет-Бутнловый эфир 0-третбутилтирозил-треоннлпролил-Н -третЕбутипоксикарбониллизил-третбутил-треонина (Ш).0,65 г (0,64 ммоль) трет-бутнлового эфира Н-бензилоксикарбонилтрет-бутилтнрозил-треонил-пролил"И -трет-бутилоксикарбониллизнл- трет-бутилтреонина (см. п, П.7) растворяют в 10 мл метанола, добавля 40 ют 100 мг палладиевой черни и перемешивают в атмосфере водорода в течение 6 ч. Катализатор отфильтровывают, Фильтрат упаривают, остатоксушат в вакууме.45Выход 0,53 г (97 7), белоеаморфное соединение. ВГ 0,40 (2-бутанол7-ный аммиак.З:1), ВГ 0,24Составитель В.ВолковаРедактор П.Горькова Техред Ж.Кастелевич Корректор Г.Решетник Заказ 8129/2 Тираж 353 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 11 11 тирозилтреонил-пролил-Б -трет-бутилоксикарбониллизил-трет-бутилтреонина (1).0,53 г (0,60 ммоль) трет-бутилового эфира 0-трет-бутилтирозил-треоЕнил-пролил-И -трет-бутилоксикарбониллиэил-трет-бутилтреонина (см. п. П,8) растворяют в 3 мл ДИФА, добавляют раствор 0,31 г (0,60 ммоль) Б-бензилоксикарбонилглицил-фенилаланил-фенилаланина (см. п. 1.3) в 2 мл ДИФА, 0,081 г (0,60 ммоль) 1-оксибензотриазола, после чего охлаждают до 0 С и прибавляют 0,125 г (0,60 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при 0 С и 6 ч при 20 С, осадок отфильтровывают, фильтрат смешивают с 30 мл охлажденнойводы (5 С) и образовавшееся маслоэкстрагируют этилацетатом (3 раза по 25 мл). Экстракт промывают насыщенным раствором хлорида натрия, 5 Х-ным раствором лимонной кислоты (3 раза по .20 мл), 5 7-ным раствором бикарбоната натрия .(3 раза по 20 мл) и водой, сушат над Ба 80 и упаривают. Остаток хроматографируют на колонке с окисью алюминия ( 11 степень активности по Брокману),миспользуя для элюирования этилацетат и затем смесь хлороформа и метанола 18:2. Фракции с основным веществом (ТСХ) упаривают в вакууме, остаток кристаллизуют иэ этилацетата и петролейного эфира, осадок отфильтровывают и сушат. в вакууме. 47010 12Выход 0,0 г (84 7.), белое крис",таллическое соединение, т.пл, 18120 С / / - 52,0 (с 1, МеОН).Н 1 0,26 (ацетон-хлороформ 1:1), 5ВГ 0 80 (2-бутанол7.-ный амми 1ак 3:1), ВГ 0,86 (1-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:1) (ТСК).Найдено,7: С 64,25; Н 7,88;Б 9,38.10 Сгз Нлоз Нд ОмВычислено,Ж: С 64,34; Н 7,62;И 9,25.Аминокислотный анализ: 01 у 1,00;РЬе 2,00; Туг 0,95; ТЬг 1,93,Рго 0,90; Ьуз 1,04.15Описываемый способ позволяет по. лучать промежуточные и конечное соединение - октапептид 1 с достаточно высоким выходом (вьмод на заключительной стадии 84; суммарный выход 46 7) без применения каких- либо специальных методов выделения и очистки. В известном способе суммарный выход октапептидасоставил 24 7. Одновременно октапептид, полученный описываемым способом, обладает значительно большей стереохимической чистотой (.удельное вращеоние - 52 ), чем тот же октапептид, синтезированный известным способом 30(удельное вращение - 37,7 ), Исепользование описываемой схемы синтеза позволит существенно снизить себестоимость конечного продукта за счет снижения расхода промежуточ ных соединений на конечной стадии,