Способ получения антибиотика -15003 -3

СОЮЗ СОЮТСНИХддддддди идеи.РЕСПУБЛИН СИ) С 12 Р НИЕ ИЗ НИ РЕТ И АТЕНТ оде до- оты ано ю -бавасИБИО-щ И йГОСУДЧфСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(72) Еидзи Хигасиде, Казунории Иицуко Асай (Япония).(71) Такеда Кемикал Индастриз(54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯТИКА С 15003 Р 3 д о 1 л и ч а 8010362 с я тем, что штамм Юосага 1 а зр.С(АТСС, ГО 13726выращивают в питательной среде, сжащей источники азота, углерода,бавки валина или изомасляной кислили их производных, с последующимвыделением целевого продукта.2, Способ по п,1, о тл и ч ащ и й с я тем, что в качестве доки используют смесь. валина и изомляной кислоты.Изобретение относится к микробиологии и касается прл, ения антибиотиков.Предложенный антибиотик новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.Целью изобретения является получение антибиотика общей формулы 1 О 11 О Н,О 5 Н ОСН,-со-он 2СН 2 СН-СН Указанная цель достигается тем что штамм Носагйа эр. М С(АТСС, 1 РО 13726) выращиваю в питательной среде, содержащей источники азота, углеоода, добавк валина или изомасляной кислоты ил их производных, с последующим выделением целевого продукта.Кроме того, в качестве добавки используют смесь валина и изомасл н т яой кисло ы.Штамм Босагйда вр, У Спродуцент антибиотика - выделен 35 из почвы и депонирован в исследовательском институте ферментации А 8 егсуоГ 1 пйцз 1 гфа 1 Яс 1 епсе апй ,Тесйпооду (РЕВИ) под номером 3 в институте ферементации, Осака (1 ГО) под порядковым номером 13 и в американской коллекции рази ностей культур (АТСС), Мэриленд СЮА под номером АТСС.Морфологические признаки. 45Вегетативный мицелий хорошо растет как на агаре, так и в жидкой. среде. Гифы достигают от 0,8 до1,2 мкм в диаметре, в некоторых случаях их.можно разделить на фрагмен ты, напоминающие палочки бактерий или короткие разветвленные гифы.Штамм ,хорошо растет на различных средах, образуя тела, похожие на монолиты(50200 х 200 х 1000 мкм) на которых про Удолжается дальнейший рост воздушного мицелия. Воздушный мицелий представ-ляет собой. волнообразные прямые или петлеобразные спирали, В неко торых случаяхобразуются конйдии.Клеточные суспензии, полученные Ж с поверхности культур, содержат много удлиненных эллипсоидальных (0,08- 1;2 х 4,8-6,8 мкм) и эллипсоидальнйх (0,81,2 х 1,0-2,0 мкм) телец, похожих на артроспоры. 65 992,40726овидО Штамм хорбшо растет на различныхсредах, причем вегетативный мицелийбывает от бесцветного до бледножелтого в начальных фазах и от светлого желтовато-рыжевато-коричневогодо желтовато-рыжевато-коричневогона поздних фазах. Штамм продуцируетрастворимые пигменты в различныхсредах,Воздушный мицелий имеет порошкообразный вид и обладает уменьшеннымростом, цвет его варьируется от белого до желтого или от светлого желтовато-рыжевато-коричневого.Сахарово-нитратный агар, Ростумеренный, вегетативный мицелий(ярко желтый цвет дыни до янтарногорыжевато-коричневого) образует тела,похожие на монолит. Воздушный мицелий скудный, белыйРастворимыйпигмент отсутствует или бледныйжелтовато-рыжевато-коричневый.Глицерино-нитратный агар. Ростумеренный. Вегетативный мицелий .светлый, цвета слоновой кости, образует тела, похожие на монолит. Воздушный мицелий умеренный, белый.Растворимый пигмент отсутствует,Глюкозо-аспарагиновый агар. Ростумеренный, вегетативный мицелий отяркого цвета календулы до ярко-желтого. Воздушный мицелий скудный,белый. Растворимый пигмент яркожелтый.Глицериново-аспарагиновый агар.Рост умеренный. Вегетативный мицелий цвета светлой слоновой кости,образует тела, похожие на монолит,Воздушный мицелий скудный, белыйРастворимый пигмент отсутствует.Агар на крахмале. Рост умеренный.От светлой слоновой кости до светлопшеничного, образует тела, похожиена монолит. Воздушный мицелий обильный, цвета светлой слоновой кости.Растворимый пигмент отсутствует.Агар на овсяной муке. Рост умеренный, от светлой слоновой костидо колониального желтого, образуеттела, похожие на монолит. Воздушныймицелий скудный, от белого до светло-желтого, Растворимый пигмент отсутствует.Тирозиновый агар. Рост умеренный,от светлой слоновой кости до цветасветло-желтой дыня,образует тела,похожие на монолит. Воздушный мицелий умеренный, от белого до светлойслоновой кости. Растворимый пигмент.цвета верблюда.физиологические признакиТемпературный интервал роста12 -38 С, Температурный интервал, вкотором наблюдается хороший роствовдушного мицелия, 20-35 фС.Желатину разжижает, крахмал гид/ройиэует, нитраты восстанавливает,молоко пептониэируете но не коагули-,рует, казеин разлагает,1036251 3На агаре с пептоном и .дрожжевым экстрактоьГмеланоидные пигменты не продуцирует, на тирознновом агаре образует.Тирозин разлагает, ксантин и гипо;ксантин не разлагает, толерантность . 5 к лизоциму положительная, толерантность к хлористому натрию 2, очень хорошо усваивает. Фруктозу, маннозу,Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, маннитоле, на растворимом крахмале. Усваивает ксилозу, арабинозу; трегалозу, мелибиозу, рамнозу, галактозу. Слабо усваивает раффииозу, мальтозу; не усваивает 1-инозитол, Э-сорбитол, лактозу, глицерин. 15 Микроорганизм рода Носа гдова может, как; вообще все миКроорганизмы, подвергаться вариациям,и мутациям, которые происходят либо самопроизвольно, . . либо вызываются искусственным путем. Так, например, многочисленные варианты штамма, которые можно получить при облучении рентгеновскими лучамй, г гамма-лучами ультрафиолетовым излучением и т.д., путем выделения отдель 5125 ной клетки, путем выращивания культуры на средах, содержащих различные . химические вещества, или .в результате любой другой мутагенной обработки так же, как и мутанты, спонтанно образую щиеся из штамма, не следует рассматривать как представителей какого-либо иного вида. Любые из таких вариантов или мутантов, способные вырабатывать СР) Ри/или Р, можно использовать для целей предлагаемого изобретения.,:.Так, например, штамм , 9 Сможно подвергать различным мутагенным обработкам и получать мутанты, которые практически не обла. дают. способностью продуцировать растворимые пигменты: мутанты с бесцветным. субстратными мицелиями, с желтовато-зеленым, красновато-рыжевато- коричневым или оранжево-.красным мицелием; мутанты,гифы которых готовы 45 к Фрагментации в бациллярные элеМенты или в Фрагменты коротких разветвленных гифов) и, мутанты с обильным белым воздушным мицелием или практически без воздушного мицелия. 50 В качестве допоцнительных веществ могут использоваться валин и/или изомасляная кислота в виде производных. Примерами производных являются сложные эфиры, такие как С-Салкиловые ;сложные эфиры (например, метиловый эфир,.этиловый эфир) указанных соединений, амиды, такие как амид или ,С-Салкиламид (например,В-метиламид н-этиламид) указанных соединений, их е 0 кетокислоты (например, ф -кетоизовалериановая кислота), соли упомянутых соединений, такие как гидрохлорид, ратриевая соль, калиевая нли кальцие-. ,вая соль, Валин может бытьиспользо- :65 ван в виде. э-формы, Ь-формы илиВЬ-Формы.Упомянутые адднтивные веществамогут представлять собой смеси валина, изомасляной кислоты и/или ихпроизводных.Указанные вещества обычно добавляют к среде в количестве от 0,01 до1,0 вес./объем), и предпочтительноот около. 0,1 до около О,5%(вес./объем) в любое время культивированияпо мере . осуществления культивирования вида Носагйха В С,предпочтительно на начальной стадиикультивирования.Среда для культивирования можетбыть как жидкой,. так и твердой иможет содержать источники углеродаи азота, которые штамм усваиваети переваривает, неорганические вещества, слепы питательных веществ, Вкачестве источников углерода используют глюкозу, лактозу, сахарову,мальтозу, декстрин, крахмал, глицерин, маннитол, сорбитол, жиры и масла (например, масло из соевых бобов,свиное,сало , куриныйжир):, В ка-.честве источйиков азота используютмясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи,. соевую муку,жидкость от замачивания зерна, пептон,муку из хлопковых семян, мбласбу,мочевину,аммониевые сопи (.например,сульфат аммония, хлористый аммонийнитрат аммония), соли азотной кислоты (нитрат натрия, нитрат калия).Кроме того, среда может содержатьсоли натрия, калия, кальция, магния, железа, марганца, цинка, кобельта, никеля, соли фосфорной и борнойкислотСреда может также содержать в качестве добавок различные витаминьв(например, пурин, пиримидин и ихпроизводные). Для установления рН.в среду дббавляют неорганические ки"слоты и/или щелочной металл илиаммиак, соответствующие основанияв качестве регулируюцх рН агентов, .а также масла, жиры, поверхностно.активные вещества и противовспенивающие агенты.Культивирование проводят в любых,стационарных условиях.для выращивания культур со встряхиванием,аэроб,ным погружением и других. Предпочтительным является аэробное погружение,Инкубирование осуществляют при20-35 С при начальном значении рН,.5,5-8,5. Предпочтительным являетсяинтервал от 23 до 30 фС при РН6,5-7,5.Время культирования 48-240 ч.Штамм Синокулируют в культурапьную среду 1, в которую входят;: раствориьый крахмал 3; хлористый аммоний 0,2; сульфат магния 0,05; монокалийфосфат 1,09; дикалийфосфат 2,09; сульФат железа 0,001 и дополнительные вещества) или в культуРальяую среду, в которую входят,двкстрин 5; жидкость от замачивания зерна 3; пептон 0,1;кар бонат кальция 0,5 и дополнительные вещества. Затем инокулированную середу культивируют 200 об/мин при 28 С 10 в течение 144 ч на ротаторном вибраторе или фермеятере.Результаты, полученные для средГи П, приведены в табл, 1.Активность антибиотика определяют при помощи бумажного диска для количественного определения на Та 1 агошусез-аче 11 апецз 1 РО 7721 в качестве опытного организмаТак как антибиотик, полученный в 20 Ферментационном бульоне, является липофильным нейтральным веществом,. его выделяют из бульона. Антибиотик Рэкстрагируют из питательного Фильтрата несмешивающимися с водой оргаяи ческими растворителями, такими как сложные эфиры жирных кисЛот (например, этилацетат и амилацетат), спирты (например, бутанол), галоидированные угЛеводороды (например, дихлорметан, хлороформ), и кетоны,(например, метилизобутилкетоя), Экстрагирование антибиотика Риз Фильтрата проводят при РН близком к нейтральному, и пргдпочтительно экстрагируют этилацетатом при РН 7. Экстракт промывают водой и концентрируют пРи пониженном давлении. Затем к концентрату добавляют неполярный растворитель, как петролейный эфир или гексан, и выделяют сырой продукт, содержащий 40 активное соединение в виде осадка. Сырой продукт при желании подвергают последовательно различным способам очисткиМОжет быть использована адсорб ционная хроматография, в качестве адсорбента используют силикагель, окись алюминия, макропористые неионные смолы. Риэ сырого продукта выделяют на силикагельном хроматогра О Фе с помощью петролейного эфира и гексана и элюируют, добавляя полярный растворитель (такой, как этилацетат, ацетон, этаяоп или метанол), или влоидированный углеводород такой,как дихлорметан или хлороформ содержащий полярный растворитель, как спирт например, метанол или этанол,), кетон (например, ацетон или метилэтилкетон ), Если в качестве средства очистки антибиотика нсполь зувт макроезрвстув:; смолу - адсорбезт, то ЭЛвирование антибиотика Рпроводат смесью воды с низшим спиртом, ,низшим кетоном или сложным эфиром. Э качестве низшего спирта используют 65 метанол, этанол, пропанол или бутанол, а в качестве низшего кетона используют, ацетон или метилэтилкетон.Сырой продукт растворяют в 60-яойсмеси метанол - вода и адсорбируютна колонке с Диапоном НР. Колонку промывают 70-ной смесью метанол -вода и затем проводят элюирование90-,ной смесью метанол - вода,Фракции, содержащие антибиотикР-З, собирают и концентрируют припониженном давленииК сухому продукту добавляют 5-8 объемов этилацетата и полученную смесь оставляютвыстаиваться, после чего выделяюткристаллы антибиотика Р-З, выход составляет 90.Физико-химические свойства Р.приведены ниже,Антибиотик СР-З,С 3 уН 4 СХМуО 9 = 635,169. Точка плавле-ния 90-192 ОС Удельное вращение(5750); 288 (5700).ИнФракрасный спектр поглощения,сь-", КВг; 1740 р 1730; 1670 1580;1445 р .1385; 1340; 1255; 1180; 11501100 т 1080 т 1038Спектр ЯМР 100 МгГц в СВС 1 ч./млн;1,27/д/ ( ЗН); 1,28/д/ ( ЗН) .Масс-спектр, щ/е: 573; 485; 470;450.Нерастворим в петролейном эфире,гексане и воде; Частично растворимв бензоле и эфире. Растворим в хлороформе, этилацетате, ацетоне, этаноле, метаноле, пиридине, тетрагидрофуране и диметилсульфоксиде.Цветовая реакция: Драгендорф -положительная; Бельштейн - положительная.Биологическая активность,Антибактериологическая активность.По способу бумажных дисков определяют ингибирующие концентрации штамма, выращенного на триптиказно-соевомагаре (ВВЬ) против микроорганизмов, перечисленных далее. Так, дискифильтровальной бумаги (Тоуо Яе 1 заЕцзьо, тонкого типа, 8 мм в диаметре),пропитанные каждый 0,02 мл раствораконцентрации 300 мкг/мл Р-З, помещают яа пластины, инокулированные соответственно микроорганизмами перечисленными ниже, для определения минимальной ингибирующей концентрации,Рне обладает активностью противследующих микрооргаяизмов: ЕзсйегдсМа со 11, Рго 1 ецз чц 18 аг 1 з, Ргоецз а 1 гаЬ 1 Нз, Рзецйоаопаз аегц 81 аоза, 81 арЬу 1 ососсцз аигецз, Васц 11 цвзцЬС 11 хз, Вас 111 цз сегецз, К 1 еЬя 1 е 11 а рпецвоп 1 ае еггаСа тагсеясепян МусоЬасСегдцв ач 1 цв.С другой стороны, рост .грибковТа 1 аговусез ае 11 апеця ингибируетсяРна агарной пластинке, содержащей3,5 г динатрийфосфата, 0,5 монокалийфосфата, 5 г кислого фосфата,дрожжевого экстракта (ИГсо), 10 гглюкозы, 15 г агара, 1000 мл дистиллированной воды, рН 7,0. Минимальная ингибирующая концентрация3,0 мкг/мл для Р. Далее культивируют в качестве исследуемого организма штамм ТеСгаЬувепа ругГогв 1 я Мна опытной среде, состоящей из 20 гпротеозо-пептона (Мясо), 1 г дрожжевого экстракта, 2 г глюкозы,1000 мл дистиллированной воды н10 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,0,при температуре 28 оС в течение 4448 ч и определяют методом последовательных разбавлений активность ингибирования роста Р.против простейших, Оказалось, что ингибированиероста наблюдается при концентрации1 мкг/мл. Робладает активностьюпротив следующих микроорганизмов:Рця 1 с 1 айцв 1 еч 1 ег 1, Не 1 вхпСЬоярог 1 цв яво 1 йцв аг. 1 ггедц 1 а ге,Ругсц 1 аг 1 а огу.чае, СосЬ 11 оЬогцяв 1 уаЬеапцз,ЯсЬегоСп 1 а зсгегоС 1 огцв,. ЗОРе 11.сц 1 аг 1 а яаза 1 с 11, ТгьсЬорйуСоп,гцЪгцв, ВЬойоСогц 1 а гцЬга и СгурСососсця пеоГогвапя,Противоопухолевая активностьИсследовано терапевтическое дейст вие Р-З, вводимого внутрибрюшинно.в течение 9 дней, против лейкемииР 388 у мышей (1 х 106 клеток) на животное, мышь,. трансплантированных внутрибрюшинно. Полученные результаты 4 Опоказали, что в единицах степенипродления продолжительности жизйи, эти соединения обладают противоопухолевой активностью порядка 200при уровне дозы 0,00625 Мк/кг/день. 45.Токсичность.В проведенных на мышах тестовыхиспытаниях на острую токсичность,которые предусматривали внутрибрюшинные инъекции Р-З, все исследованные антибиотики дали величину 100,625 мг/кг и ЬВ = 0,313 мг/кФ.П р и м е р 1, 40 мл засеяннойкультуральной среды, содержащей, В:глюкоза 1,0; бактотриптон 2,0;бакто-дрожжевой экстракт 1,2, рН7,0, выливают в 200-миллилитровуюколбу Эрленмейера. После стерилизации в среду инокулируют Босагц 1 а БР.Р С(РО 13726 АТСС 31281,Рейм Р 3992), инокулянт инкубируют 60при 28 оС во вращающемся шейкере,(200 об/мин) для получения засеянной;культуры, Засеянную культуру трижды.,прожвают стерилизованной дистиллиро-ванной водой и промытые клетки выде ляют до исходного количества стери,лизованной дистиллированной водой,Одну часть по объему полученного вещества инокулируют в основную в 40 ч. по объему основной питательной среды, содержащей, В: растворимый крахмал 3; хлористый аммоний 0,2; сульфат магния 0,05; монокалийфосфат 1,09; дикалийфосфат 2,9; сульфат железа 0,001 и ь-валин 0,1, и основную питательную среду культивируют .при 28 С в течение 8 дней. во вращаюшемся шейкере (200 об/мин). Общее количество полученного Ссоставляет 16 мкг/мл, 95 (вес/вес.В) из него составил Р-З.П р и м е р 2. Готовят посев культуры аналогично примеру 1,500 мл засеянной культуры инокулируют в 2000-миллилитровую колбу Сакагуши и .культивируют при 28 С .в течение 48 ч во вращающемся шейкере (100 об/мин) до получения инокулянта. Инокулум помещают в 100 х 103 ч по объему среды, содержащей, : глюкоза 2,0; растворимый крахмал 3,0; жидкость от замоченного зерна 1,0; соевая мука 1,0 полипептон 0,5; хлористый натрий 0,3; карбонат кальция 0,5; рН 7,0, в 200 х 10 з ч по объему ферментер из нержавеющей стали.Культивирование проводят при 28 фС .в течение 48 ч при скорости аэрации 100 х 103 ч по объему/мин и размешивании 200 об/мин. Питательный бульон (10 х 10 з об.ч.) переносят 100 х 10 ч по объему основной питательной среды, содержащей,. декстрин 5; жидкость от замачивания зерна З пептон 0,1 у ь-валин 0,5; карбонат кальция 0,5, рН 7,0, - в 200 х 103 ч по объему Ферментер, из нержавеющей стали, и культивируют в течение 4 дней при 28 С при скорости аэрации 100 х 10 З ч по объему/мин и скорости перемешивания 150 об/мин. Полное количество полученного С12 мгк/мл, причем Рв Ссоставляет около 98 (вес,/вес.В).П р и м е р . 3. К 95 л жидкой ,питательной среды, полученной в примере 2, добавляют 50 л ацетона. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, добавляют 2 х 10ч НуГ 1 о-зцрегсе 11, хорошо перемешивают, затем отфильтровывают на фильтре под давлением, в результате получают 135 Л Фильтрата. К полученному Фильтрату добавляют 50 мл вовы и 90 л этилацетата, полученную смесь перемешивают и экстрагируют. Описанную процедуру повторяют дважды. Полученные слои этилацетата объединяют и дважды промывают 80-литровыми порциями води. К слою добавляют 1 х 10 ч. безводного сульФата натрия, высушивают и концентрируют до 200 мл. К полученному ко 3 щааврату добавляют петролейний91036эфир, и образовавшийся осадок выделяют фильтрованием, в результатечего получают 35 г сырого продукта.К сырому продукту добавляют 50 млэтилацетата и полученную смесь перевмешивают, .Нерастворимую часть выделяют фильтрованием, к фильтрату добавляют .10 г силикагеля. Подле перемешивания полученной смеси этилаце.тат отгоняют при пониженном давле.нии. Остаток помещают в верхнюю часть 10колонки с силикагелем 500 мл).Элюи"рование проводят последовательно500 мп н-гексана; 500.мп смеси н-гек"сан-этилацетат (3:1);2000 мл смесин-гексан-этилацетат (1:1) и 2000 млнасыщенного водного раствора этилацетата. При этом элюат собирают в50-миллилитровые фракции.По одному миллилитру от каждойФракции концентрируют досуха и кполученному концентрату добавляют0,1 мл этилацетата до полученийсмеси. Смесь дает пятно на расстоя-,нии 2,5 от нижнего края пластинйсиликагель - стекло и проявляетсяоколо 17 см этилацетатом, насыщенным водой. После проявления проводят ;определейие ультрафиолетом.(2537 А). Активные фракции НГ 0,42собирают и концентрируют при пониженном давлении до 2 мл. К этому кон"0центрату добавляют 20 мл петролейного эфира, в результате чего получают 9,1 ч. сырых кристаллов. Послерастворения сырых кристаллов в 20 мптеплого этилацетата и охлаждения 35выделяют 0,85 ч. кристаллов Р-З.Точка плавлеиия 189-190 С (Р 97 (вес,/вес),П р и м.е р4, В 400 мл 50-.ноЩраствора-метанола растворяют 20 г,4 Осырого продукта, полученного по при-.меру 3. Колонку 2,5 см в диаметренабивают 1000 мпдиаиона НРс3000 мл50-нойсмеси метанол - вода.Приготовленный таким образом раствор,45образца пропускают через колонку ипромывают, используя 1000 мл 60-ного метанола, и осуществляют непре.рывное градиентное элюирование7500 мл 60-ной смесью метанол - во"да и 7500 мп 95-ной смесью метанол -,50. вода, Элюат собирают в 75 миллилитровые фракции и каждую Фракцию исследуют тонкослойной хроматографиейна силикагеле, описанной в.примере 3.фракции 9 145-153 собирают и кон центрируют. Е полученному концентрату добавляют 509 мя воды и 1000 мл,этилацетата. Затем раствор встряхивают в разделительной воронке, и вод 251 . 101ный слой отделяют после двукратногопроьывания 300 мл воды этилацетатныйслой .высушивают .над безводный сульФатом натрия, концентрируют и оставляют отстаиваться. Полученные кристаллы Ротфильтровывают и высушивают, Выход Р880 мг.Точка плавления 188-190 С (Р,"95 (вес/вес)П р и м е р 5. Используя вместоЬ-валина по примеру 1, метиловыйэфир валина; М-метиловый эфир валина;гидрохлорид валина;:Ь-кетоизовалериановую кислоту; метиловый эфир изо"масляной кислоты; М-метиловый эфиризомасляной кислоты или смесь валинаи изомасляной кислоты, получаютантибиотик Р-,З.Антибиотик Робладает высокойингибирующей активностью против грибковых и простейших организмов и может быть использован в качестве фунгицидного агента, а также может найти применение в качестве противоопухолевого лекарства.Как Фунгицид его можно использоватьдля оценки бактериальной экологиив почве, активном иле, жидкости животных организмов и т,д. Так, еслинужно выделить ценные бактерии изобразцов почвы или оценить действиебактерий независимо от грибковыхили простейших организмов при работеи исследовании активных илистых систем, используемых для очистки сточных вод, то можно использовать анти"биотик для получения селективногороста бактериальной флоры, сопровож,дающегося подавлением роста загрязняющих грибковых или простейшихорганизмов. в образце. Обычйо образецдобавляют к жнцкой или твердой средеи на 1 мл средыфдобавляют 0,1 мл,раствора, содержащего 10-100 мкг/мпантибиотйка в 1-ной смеси метанолвода, после чего образец инкубируют.Рможно также использовать вкачестве бактерицидного агента дляборьбы с болезнями растений, вызваннымимикрооргайизмами, упомянутымивыше.Обычно Р.используют в виде1-ного метанольного водного раствора,содержащего 0,5 - 5 мкг/мп антибиотика. Так, напрймер, Рможно использовать для контроля за красновато-коричневой листовой гнилью, бластом,гелЫминтоспориознойпятнистостью лиотьев и листовыми заболеваниями рисовых растений.Предлагаемый способ позволяет получить новый антибиотик.1036251т ттюювююйтЮЮЮЮ Соотнсыение компонентов, (вес./вес.Ъ) Добавляемоевещество Количество добавки, Ф Полная активность, мкг/мл РРРСреда Р"10 65 0 1 95О 1 . 9772 2 95 0 2 95 Иэобутиратнатрия 0 1 91Среда И 0,01 25 18 5 15 3 15 213 3,: 13,5 Иэобутилатнатрия 0,3 0 5 92 В графе "Время добавления" аддитивное вещество добавлено в среду в качестве одного из ингредиентов. Составитель С. МалютинаРедактор М. Петрова ТехредМ.Йадь Корректор С. ШекмарЮ Ю Ю ЮЮ Ю 4 В Заказ 5867/63 Тирам 523 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, )к, Рауюская наб., д. 4/5 филиал ППП фПатентф, г. Уагород, ул. Проектная, 4 Без добавки ь-валин Ь-валин Ь-валин ь-валин Без добавки ь-валин Ь-валин Ь-валин Р-валин 0,1 0,3 0,1 0,1 0,1 0,3 0,5 0,3 Время добавления,ч . ю 15 0 . 5 О 2 48 3 60 90 94 96 94 25 4 2 3 3 10 16 26 10 16