Циклический аналог брадикинина, обладающий пролонгированным гипотензивным действием

СОЮЗ СОВЕТСНИХсеммипиезе кРЕСПУБЛИК е и О 7 С 303/52 А 61 К 37/а 2 ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИИ АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтезаАН Лат.ССР о(56) 1. Дзизинский А,А. , Гомаэков О.А. фКинины в Физиологии ипатологии сердечно-сосудистой системыф. Новосибирск, 1976, с. 89.2. Р.А. МсСагЮу, О.Е. Ро 11 ег,Е.О. Я 1 со 1 аЫез. Ап 1 п чиччо ез 11 щаМоп ой 1 Ье рогепс 1 ез апй па 1 й 11 чевой арпад)е 11 с Ьгайу 11 п 1 п апд Ка 111 б 1 п"Ю. РЬагв Ехр. Телег1965, 148,117.3. Пасхина Т.С. Биохимическиеосновы патологии сердечно-сосудистойсистемы (механизмы образования, обмен и роль при сосудистых патологиях кининов плазмы крови - В кн.Молекулярные основы патологии 1под редакцией В,Н. Ореховича, ММедицина, 1966, с. 123.4; Авторское свидетельство СССРпо заявке М 2555261/23-04,кл. С 07 С 10,3/52, 1977.5. Шредер Э. Любке К, Пептиды,ч, 1, М., Мир, 1967, с. 112,116,ю Рле- Иег - Рго - Рье-Лгу ЯЧ - ВВ-Рею-б 3 отеи- . ий прол ействие нгированньи бладивным ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ(54) (57) ЦИКЛИЧЕСКИЙ АНАЛОГ ВРАДИКИНИНА ФОРМУЛЫИзобретение относится к синтезу нового соединения - циклическому аналогу брадикинина, обладающему пролонгированным гипотензивным действием, которое может найти применение в биологии и медицине.Брадикинин и другие пептиды, имеющие аминокислотную последовательность брадикинина, широко распросранены в живой природе и выполняют . важные функции регулирования биохи мических и физиологических процессов в организмах животных и человека. С нарушением динамики образования и расщепления брадикинина и родственных ему пептидов связаны раз личные заболевания и патологйческие состояния человеческого организма 1),Однако несмотря на высокую биологическую активность брадикинин не нашел применения в медицине для лечения этих нарушеннй вследствие кратковременности его действия (период полураспада брадикинина в организме 30 с) 2, а также из-за некоторых нежелательных побочных янлений Г 1, 3) .Известен циклический аналог брадикинина 4, обладающий пролонгированным гипотензивным дейстнием (продолжительность эффекта 2 ч). Однако при его применении кровяное давление начинает частично восстанавливаться уже через 5-10 мин после его введенияЦель изобретения - расширение арсенала средств воздействия на живой 35 организм.Поставленная цель достигается описываемым,циклическим аналогом брадикинина формулы40 обладающим пролонгированным гипотен зивньв 4 действием.Способ получения описываемого соединения основан на известных методах пептидной химии, например методе активированных эфиров, с нсполь зованием блокирования функциональных групп и последующего деблокирования . известными приемами 4,5).В приведенных примерах для синтеза использованы производные аминокислот, поставляемые фирмой Веапа 1 (Венгрия). Упаривание растворов проводят в вакуумном испарителе при 30 С. Температуры плавления, которые определены в открытых капиллярах, приведены беэ исправления. Индивидуальность полученных соединений проверена с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках 811 цйо 1 или Мегс)с. Принедены хроматографические подвижности 65 й на пластинках Б 11 цйо 1 И/-эЪв следующих системах: А - хлороФорм-этанол-этилацетат-уксусная кислотавода (85;5:8:2:0,25); Б - хлороформэтанол-Ч.бутанол-этилацетат - вода(10:6:4:3:1); В - хлороформ-метанолвода (40:30:5); Г - Н .бутанол-уксусная кислота - вода (4:1:1); Е - этилацетат-пнриднн-уксусная кислотавола (5:5:1:3), а также электрофоретическая подвижность по отношениюк гистидину Е з на бумаге Р)( - 16, в1 И или 5 И уксусной кислоте. Пятнавеществ обнаруживают осмотром хро-матограмм в ультрафиолетовом свете,а также опрыскиванием нннгндридом,выдерживанием в парах иода, реагентом Сакагучн или при помощи хлора иреагента бензндина. Для идентификации соединений использовали спектрыПМ при 60 МГц, снятые на прибореРег)с 1 п-Е 1 вег й 12 А, а также спектры при 90 МГц, полученные на приборе ,Вгц 1 ег ХН. Аминокислотный анализ выполнен на анализатореВ 1 оса 1 ВСпосле гидролизапептидов н запаянной ампуле при110 С н течение 24 ч. Хроматографическая очистка промежуточных продуктов осуществлена на модифицированном приборе оЬ 1 п Угоп СЬго ща 1 озра К 1 с использованием силикагеля Н 60 фирмы Мегс)с.П р и м е р 1. И -Нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбонилфенилаланилбензилсерилцролина (3)К раствору 10,3 г (22,3 ммоль) пентафторфенилоного эфира трет-бутоксикарбонилбензилсерина и 6,7 г (23,4 ммоль) гидрохлорндап -нитробензилового эфира пролина н 200 мл диметилформамида добавляют триэтиламин до рН 8. Смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растворяют н смеси 100 мл эфира н 100 мл .воды. Органический слой отделяют, промывают 100 мл 10- ного раствора бикарбоната калия, затем 100 мл 10-ного раствора бисульфата калия, сушат над безводным сульфатом магния, фильтруют, упаривают. Получают масло, содержащее и -нитробензиловый эфир трет-бутоксикарбоннлбензилсерилпролина (1), ВА) 0,95, йс(В) = О, 77, Н(В) =О, 95, В(Г) =О, 76 и пентафторфенол, Его растворяют в трифторуксусной кислоте, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, затем упаринают, Остаток, содержащий трифторацетат П-нитробензилоного эфира бензилсернлпролина (2), нейтрализуют триэтиламином до рН 8, добавляют 10 г (23,2 ммоль) пентафторфенилового эфира трет-бутоксикарбоннлфенилаланина. Выдерживают 1 ч прн комнатной температуре, затем добавляют 1 мл -диметиламиноэтиламина. Спустя10:мин смесь нейтрализуют уксусноикислотой до рН 6, упаривают, остаток растворяют в смеси 100 мл эфира и 100 мл воды, эфирный слой отделяют, промывают 100 мл 10-ногораствора бикарбоната калия, 100 мл 510-иого бисульфата калия, затем100 мл воды. Добавляют 50 мл бензола, упаривают, полученное темнокоричневое масло очищают хроматограФически (700 г силикагеля,. элюиру Оют сначала смесью гептан-этилацетат(51), затем хроматографической сис, темой (А). После упаривания элюатаполучают светло-коричневое масло.Выход 9,7 г (64,5). Для аналитических целей небольшую часть масла закристаллиэовывают растиранием с гексаном. (Ю) ф -29,1 О(с.1, диметилФормамид). В(А) 0,94, В (Й)=0,77,В(В) = 0,96, В(Г)0,81.П р и м е р 2 ТрифторацетатП-нитробензилового эфира Фенилаланилбензилсерилпролина (4).9,0 г (13,3 маколь) растворяют в50 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают при 20 С, остаоток растирают со 100 мл безводногоэфира. Получают масло, выход 8,9 г(97). Для аналитических целей небольшую часть масла закристаллизовывают растиранием с гексаном.(Ж) = -16,3(с 1,диметилформамид);ИЕ, 0,61 (1 И уксусная кислота).ВА) =0,12, В(Б) =0,66, В(В) =0,88,В( (Г).=0,62, 35П р и м е. р 3. и -Нитробензиловыйэфир трет-бутоксикарбоннлипролилглицилфенилаланилбензилсерилпролнна(7).Из (4) аналогично синтезу соединения (3), используя пентафторфениловый эФир трет-бутоксикарбонилглицина, получают смесь, состоящую,1изп -нитробензилового эфира третбутоксикарбоннлглицилфеннлаланилбензилсерилпролина (.5) В(А) = 0,71, 45В(Б) = 0,76, В(В) = 0,95, Н(Г)0,80, и пентафторфенола, которуюобрабатывают трифторуксусной кислотой в условиях, описанных для соединения (2) с образованием масла, содержащего трифторацетат й -ннтробензилового эфира глицнлфенилаланилбен-зилсерилпролина (6) (Е н; 0,58) 1 Иуксусная кислота, В(А) = 0,02,В(В) = 0,67, В 1(Г) = 0,62. Это масло нейтрализуют и используют для реакцис пентафторфениловым эфиромтретбутоксикарбонилпропилена аналогично получению соединения (3), Полу-ченное масло очищают хроматографически 700 г силикагеля, элюируют 60сначала хлороформом, затем смесью:хроматографическая система,В - изопропанол (4:1) . После упариваниязлюата получают светло-коричневоемасло, которое закристаллизовывают 65 растиранием смесью эфира с гексаиом(1:1). Выход 62. (М) -43 Ов(с 1диметилформамид), ВА)=0,58, В(Б)О, 72, Ву(В) =0,94, В(Г) =0 78.П р и м е р 4 Трифторацетат Пнитробензилового эфира пролилглицилфенилаланилбензилпролина (8),Получают из (7) аналогично синтезу соединения (4), Выход 2,47 г=0,81, В(Г).=0,26.П р и м е р 5. Трет-бутоксикар"бонилнитроаргинилпролин (9) .20 г (53,6 ммоль) трет-бутокси"карбонилнитроаргинина суспендируют в300 мл безводного этилацетата и приохлаждении (О С) добавляют 10,3 г(56 ммоль) дициклогексилкарбодиимида,Перемешивают 10 ч при 0 С, фильтруюти при ОфС фильтрат экстрагируют10-ными растворами бикарбоиата калия и водой (по 100 мл), затем сушат безводным сульфатом магния, отфильтровыва:т и упаривают, Полученное масло, содержащее пентафторфениловый эфир трет-бутоксикарбонилнитроаргинина, растворяют в 300 млднметилформамида, добавляют 9,25 г(80 ммоль) пролина, Н-метилморфолиндо рН 8 н по каплям воду - до раст"ворення пролина. Выдерживают 2 ч прикомнатной. температуре, упаривают,остаток растворяют в 100 мл хлороФорма, полученный раствор промывают 50 мл 10-ного раствора бисульфата калия 50 мл воды, а затем -100 мл насыщенного раствора бикарбоната калия, Бикарбонатный экстракт промывают 50 мл эфира и нейтрализуют избытком бисульфата калиядо рН 2. Полученную смесь экстагируют 100 мл хлороформа, экстрактпромывают 50 мл воды, сушат безводным сульфатом магния. Фильтруют,упаривают, полученное масло закристаллизовывают растиранием со смесьюэтилацетат-гексан (1:1) . Выход 10,3 г(46,1). (с) -- -28,0 (с 1, диметилФормамнд) . В(А) =0,14, В 4(Б) 0,50,В(В =0,78, В(Г) =0,67, Й(Д) =Оу 84.П р и м е р 6. Трифторацетат. иит"роаргинилпролииа (10).10,0 г (24,0 ммоль (9) растворяют в 50 мл трифторуксусной кислоты,выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают при 20 аС, остаток растирают со 100 мл безводногоэфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают эфиром и выдерживают над гидроокисью кааия при1 мм рт.стВыход 99. (о о-24,4ЬП р и м е р 7. Трет-бутоксикар- бонилнитроаргинилнитроаргинилпролин (11).2,0 г (5,67 ммоль) (10) и масло,содержащее 5,8 ммоль центафторфенилового эфира трет-бутоксикарбоиилнитроаргииина (см. синтез соединения (9), растворяют в 50 мл диметилформамида и добавляют й-метилморфолин до рН 8. Выдерживают 1 ч прикомнатной температуре, затем упари вают, остаток растворяют в 50 млхлористого метилена и экстрагируют50 мл 10-ного Водного раствора бисульфата калия. Органический слойотделяют, упаривают и остаток очищают хроматографически (200 г силикагеля, элюент - сначала этилацетат, затем хроматографическая система Б). Фракцию элюата упаривают,остаток растирают с эфиром. Выход0,75 г (21,4).П р и м е р 8 П -Нитробензиловыйэфир трет-бутоксикарбонилнитроарги- нилнитроаргинилпролнлпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина (12)0,7 г (11). (1,13 ммоль) и 0,86 г(1,13 ммоль) фКомплекса Гф встряхивают с 50 мл хлористого метилена до растворения. ЗатеМ добавляют1,1 г (1,30 ммоль) (8) и триэтиламин до рН 9. Выдерживают 42 ч при комнатной температуре. Затем добавляют0,1 мл уксусного ангидрида, выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Упаривают, остаток обрабатываютсмесью 20 мл воды и 20 мл этилацетата. Образовавшийся кристаллический осадок отфильтровывают и на фильтрепромывают 5 мл этилацетата. Выход0 6 г (40,0) . сЦд =-49,0 с (с 1, . диметилформамид) . ВБ) =О, 57, й(В) = 40=0,73, й(Г) =0,42.П р и м е р 9. Трифторацетат И -нитробензилового эфира нитроаргинил- нитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина (13).Получают из (12) аналогично синтез соединения (10). Выход 93.(оС) = -34,2 ф (с 1, диметилформамид),3Ецф 0,45 (1 В уксусная кислота), , йу(Б) =Ор 21, К (В) =0,54, Я (Г) =0,43.50П р и м е р 10. Трет-бутоксикар- бонилфенилаланилнитроаргинилнитроар- гинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролии И -нитробензиловый эФир (14).О 5 г (0,37 ммоль) (13) и 0,4 г (1,дЗ ммоль) п -нитрофенилового эфира трет-бутоксикарбонилфенилаланнна растворяют в смеси 5 мл диметилформамида и 50 мл хлористого метилена, затем добавляют триэтиламин до рН 8. 60 Выдерживают 2 О ч при комнатной температуре, затем упаривают, остаток обрабатывают смесью 20,мл 1-ного водного бисульфата калия и 20 мл эфира. Образовавшуюся смолу расти рают с безводным эфиром, затем перемешивают с 20 мл безводного эфира на магнитной мешалке. Отфильтровывают, осадок высушивают,. затем перемешивают с 20 мл воды, Декантируют,высушивают в эксикаторе над пяти- окисью фосфора. Выход 0,.42 г (77). (Ю) щ -45,8 0 (с 1, диметилформамид), й(Б) =О,35, В (В) =0,60, В(Г) =О, 52,П р и м е. р 11. Трет- бутоксикар- бонилфенилаланилнитроаргинилнитроар- гинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролин (15).0;3 г (0,203 ммоль) (14) растворяют в смеси 10 мл метанола и 2 мл воды, затем добавляют 24 мг гидро- окиси натрия. Выдерживают 7 дней при комнатной температуре, упарнвают, остаток растирают с безводным эфиром, декантируют. Полученный порошок перемешивают с 10 мл воды, к которой добавляют 0,1 мл насыщенного раствора бисульфата калия. Фильтруют, осадок иа фильтре промывают водой, сушат в зксикаторе над пяти- окисью Фосфора. Выход 0,20 г(73,5)(М)т,0 о (с 1, диметилформамид). В(А)=0,06, й(Б)0,30, й(В)0,54, К(Г) 0,47.П р и м е р 12. Пентафторфениловый эфир трет-бутоксикарбонилфенил- аланилнитроаргинилпролилпролилглицилфенилаланилбензилсерилпролина(16). 170 мг (0,127 ммоль) (15) и 150 мг(О, 198) ффкомплекса Ррастворяют в 15 мл безводного хлористого метиле" на. Выдерживают 20 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, Фильтру" ют, осадок на Фильтре промывают эфиром. Выход 176 мг (91), В 1(Б) =0,60.П р и м е р 13. Гидрохлорид пентафторфенилового эфира фенилаланил- нитроаргинилнитроаргинилпролилпро- лилглицилфенилаланилбензилсерилпролина (17).160 мг (0,105 ммоль) (16) растворяют в 2 мл хлористого метилена, затем добавляют,0,5 мл насыщенного раствора хлористого водорода в диоксане, Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром, филь,труют. Выход 141 мг (92), й(Б) =0,30 П р и м е р 14. Цикло-(фенилала- нилнитроаргинилнитроаргинилпролил- пролилглицнлфеннлаланилбенэилсерилпролил) (18)135 мг (0,092 ммоль) (17) растворяют в 2 мл диметилформамида и полученный.раствор добавляют к 500 мл диоксана (кипятят над натрием и перегоняют непосредственно перед употреблением)Затем вводят 0,1 мл диизопропилэтиламина, смесь энергично перемешивают и выдерживают в атмосфере аргона при комнатной температуре. Упаривают, остаток растирают сбезводным эфиром, декантируют, высу"шивают, затем перемешивают с 10 млводы, снова декантируют и высушивают.Полученное вещество очищают на 150 мг 5,ческая система А - изопропанол (4:1),фракцию элюата, содержащую чистыйциклопептид, упаривают, остаток растирают с безводным эфиром н деканти- Оруют, полученный порошок суспендируют в 5 мл воды и снова декантируют. Осадок высушивают в вакуумномэксикаторе над пятиокисью осфора,Выход 24,8 мг (21,1), (Ы) =-618 15(с 1, метанол) . В(Б) =0,48, В (Г)=- 0,45.П р и м е р 15. Цикло-брадикининдиацетат.23 мг (0,019 ммоль) (18) гидрируют при атмосферном давлении вприсутствии палладиевой черни в растворе метанола (3 мл) и уксусной кислоты (0,1 мл) в течение 70 ч, трираза меняя катализатор Отфильтровывают, упаривают, лиофилизируют изводы. Получают пушистый порошок. Выход 15, 5 мг (71) . Е н эфО, 69 (1 Иуксусная кислота) . В (Г) =О, 28,Биологическая активность цикло. брадикинина (ЦБ) изучена в опытах З 01 п ч 1 чо (определено влияние на кро-вяное давление наркотизированныхкрыс) и 1 п ч 11 го (определено влияниена сократительную способность маткикрыс). в качастве стандартного соединения использован синтетическийпрепарат брадикинина производствафирмы фРеанол (БК).Проведены слеДующие исследования:1. Определение влияния на кровяное давление крыс.Эксперименты проведены на крысахобоих полов массой 200-220 г. Животные наркотизированы 25 уретаном 0.,5 мл/100 г. Кровяное давление 45из сонной артерии, регистрировалосьс помощью ртутного манометра на закопченой ленте кимографа. ЦБ и БКвводились в виде инъекциЯ в бедрен"ную вену объемом 0,1 мл/200 г в дозах 0,5-500 мкг/кг.2. Определение миотропного действия,В экспериментах использованы крысы-самки весом 200-220 г. Регистрированы изотонические сокрашенияизолированных маток крысв определенном режиме температуры (320 С).и аэрации. Использован метод кумулятивных сокращений 1( . Проверены коьцентрации ЦБ и БК в диапазоне 1010 моль/л. Регистрация проведенана модиФицированном приборе ВИ 65 МА 2, 3 .Результаты исследования.В опытах 1 п ч 1 чо на наркотизиро"ванных уретаном крысах установлено,что пороговая концентрация БК -0,5 мкг/кг, ЦБ - 250 мкг/кг. В дозе 0,5 мг/кг ЦБ вызывает эффект понижения артериального давления на40 мм рт.ст. продолжительностьюболее 2 ч и при этом тенденция восстановления исходного уровня кровяного. давления не наблюдалась(см.Фиг.1 ), в то время как длительностьэффекта природного брадикининалишь 30 с,В опытах 1 п ч 11 го на изолированной матке крыс установлено, что ЦБ обладает слабой миотропной активностью, не вызывая полной ответной реакции органа даже при высоких концентрациях (ю(= 0,5210,031 рД =7,86+0,12; см. Фиг, 2). Миотропная ответная реакция циклобрадикинина составляет лишь 50 от эффекта Ьрадикинина, что свидетельствует об избирательности биологического дей" ствия. На Фиг, 3 представлена схема синтеза циклобрадикина.Таким образом, ЦБ по сравнению с природным брадикинином обладает чрезвычайно пролонгированным депрес,сорным эффектом, Миотропный эффект ЦБ значительно слабее эффекта брадякинина.Сравнение биологических свойств циклобрадикинина и известного ранее циклического аналога брадикинина 4 показывает, что первый вызывает более выраженное и устойчивое понижение кровяного давления, Так, если после применения известного циклического аналога брадикийина кровяное давление начинает частично восстанавливаться уже через 5-10 мин, то при введении нового аналога циклобрадикинина кровйное давление понижается и держится на одном уровне в течение нескольких часов. Такой эффект нельзя получить увеличением концентрации известного аналога, так как вследствие чрезмерного понижения )ровяного давления животные погибают.8.128 г 1 е Ага Лгу Во Рго Рго НИПИ Заказ 8226/5 Тираж 418 Подписноефилиал ППП "11 атент", г.Ужгород,ул,Проектная,4