Способ получения антибиотика

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(32) Приоритет Государствеииыи комитет Совета Министров СССР Опубликовано 05.02,75, Бюллетень5 Дата опубликования описания 11.04.752) Авторы изобретени Иностранцы ильви Пинер и Жан Предо) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИК препарат разделяют на два активных составляющих компонента. Один из активных компонентов (13.057. К.Р,) представляет собой красный аморфный порошок, т. пл. 155 - 170 С, с характерным спектром (см. фиг. 2), растворим в спиртах и хлороформе, очень мало растворим в воде и кстонах, практически не растворим в бензоле и простом эфире, Другой активный компонент (13,213.Й,Р.) красно- оранжевый аморфный порошок, с характер. ным спектром (фиг. 3), мало растворим в спиртах, практически не растворим в воде, бензоле и простом эфире,Г 1 р и м е р 1, В 170-литровый бродильный чан загружают:Отвар кукурузной муки(Согп з 1 еер) 2,400 кгСахарозы 3,600 кг Карбоната кальция 0,900 кг Сульфата аммония 0,240 кг Воды до получения 100 л,Величина рН этой среды культуры составляет 6,15, Ее стерилизуют текучим паром при 122 С в течение 40 мин. После охлаждения объем бульона составляет 120 л, а величина рН 7,20. Среду затем засевают 200 смз штамма Ягер 1 огпусез 31.723, находящегося в конической колбе, которую при этом взбалтывают, Культуру выдерживают при 26 - 27 С в те 5 Изобретение относится к области медицины.Способ получения предложенного антибиотика в патентной литературе не известен,Целью изобретения является получение нового антибиотика, обладающего активностью в отношении ряда гр ам-положительных и грам-отрицательных микроорганизмов, а также противоопухолевой активностью.Эта цель достигается тем, что культуру Ыгер 1 огпусез соегц 1 еогцЬ 1 с 1 цз 8899 или 31723 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, в течение 2 - 5 дней при температуре 23 - 35 С и начальном рН среды 6,0 - 7,8 с последующим выделением, очисткой и разделением целевого продукта известными приемами.Новый антибиотик растворим в хлорированных растворителях, таких как хлороформ и дихлорэтан, относительно растворим в подкисленной воде с величиной рН от 3 до 4, очень слабо растворим в спиртах и практически не растворим в воде, бензоле и простом эфире. Он характеризуется следующими физическими свойствами: красно-оранжевый аморфный порошок с характерным спектром (см, фиг. 1),Путем хром ф р бентах или ем51 О 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 60 65 чение 27 час, при переиешивании и аэрациистерильныз воздухом. госле этого она пр 4 гоана для засева производящей культуры.Производящую культуру вырабатывают в800-литровом бродильном чане, куда помещают следующие и;и рсдиеиты:Соевая мука 20 кгБарда 2,500 кгКрахмал 10 кгСоевое масло 2,500 лХлористый натрий 5 кгВода до получения 465 л.Величину рН полученной таким образомсреды доводят до 7,20 с помощью 400 смконцентрированного едкого патра, Среду затем стерилизуют текучим паром при 122 С втечение 40 мин. После охлаждения объембульона составляет 500 л, а величина рН6,75. Затеи среду засевают 50 л указаннойкультуры в 170-литровом бродильном чане.Культуру выдерживают при 28 С в течение67 час при взбалтывании и аэрации стерильным воздухом. Величина рН этои среды 7,я7 40объем сусла 520 л, Количество присутствующего в среде антибиотика составляет29 ед//см.П р и м е р 2. Засевают питательную среду в170-литровом бродильном чане в тех же условиях, что и в примере 1, но с помощью200 см культуры штамма Ягер 1 отпусез8899, находящейся в конической колбе, которую при этом взбалтывают.Производящую культуру затем вырабатывают в 800-ли 1 ровом бродильном чане, загруженном таким же образом, как это указано впримере 1.Величину рН среды доводят до 8 - 10 с помощью концентрированного едкого натра. Затем среду стерилизуют текучим паром при122 С в течение 40 мин, После охлажденияобъем бульона составляет 500 л, а величинаР Н 6,80. Затем среду засевают с помощью75 л указанной культуры в 170-литровом бродильном чане. Культуру выдерживают при26 - 27 С в течение 67 час при взбалтывании иаэ ации стерильным воздухом. Величина рНэтой среды равна 7,40, а объем сусла 5;5рКоличество присутствующего в среде антибиотика составляет 9,1 ед/см,П р и м е р 3, Сусло, полученное как описанов примере 1 (520 л при титре 29 ед/сма), помещают в чан, снабженный мешалкой,Величину рН доводят до 1,8 с помощью концентрированного раствора щавелевой кислоты.Взбалтывают в течение часа, а затем добавляют 20 кг вспомогательного материала дляфильтрации. Смесь отфильтровывают нафильтр-прессе, а осадок после фильтрованияпромывают 100 л воды, подкисленнои до р Н2 с помощью щавелевой кислоты. В фильтрат,объем которого составляет 612 л, добавляютконцентрированный раствор едкого натра дотех пор, пока величина рН не достигнет 4,5.После этого фильтрат направляют на колонку,содержащую 20 л Лмберлита 1 КС 50 в кислотОи цикле (диа:Отр ко;с:ки 1 О,2 си, выСота колонки 200 сх 1, высота слОИ смолы В колонке 110 см). Фильтрат прогускаот через слой Амберлита снизу вверх при расходе 40 л/час, Затем колонку промывают 100 л воды, из расчета 50 л/час, циркулирующей снизу вверх, осле того се промывают 75 л метанола, со.держащего 10% воды. Метанол циркулирует сверху вниз при расходе 50 л/час в течение полуторачасов, Удаляют промывочные воды и колонку вновь элюируют раствором следующего состава:Хлористый натрий 10 г Вода 100 см Метанол до получения 1000 см,Объем элюата, который содержит большую часть антибиотика, составляет 100 л. Его концентрируют под пониженным давлением и при температуре 35 С до получения объема 10 л.Концентрат постепенно экстрагируют при рН 7,5 двумя порциями хлороформа по 5 л. Величину рН хлороформного экстракта доводят до 4 с помощью раствора уксусной кислоты в хлороформе (10: 100 по объему), затем экстракт концентрируют при 30 С под пониженным давлением до получения объема 100 см, Антибиотик осаждают добавлением 1 л гексана, цептрифугируют, промывают и высушивают. Получают 9 г красного аморфного порошка с титром 1400 ед/мг,П р и м е р 4 17,1 г сырого продукта, полученного таким образом, как это описано в примере 3 (титред/мг) растворяют при взбалтывании в смеси, составленной из 1,5 л хлористого метилена, 0,3 л четыреххлористого углерода и 1,8 л воды. Величину рН доводят до 3 добавлением 8 см 1 н. соляной кислоты. После декантации водную фазу обрабатывают 7 л хлористого метилена и 200 смэ 0,1 н. едкого натра, чтобы довести величину рН до 7,5. Снова декантируют и экстрагируют водную фазу при рН 7,5 с помощью 3,5 л хлористого метилена. Экстракты хлористого метилена соединяют и концентрируют до 100 см. После добавления в концентрат 1 л гексана получают продукт осаждения, который отфильтровывают, промывают и просушивают при 30 С под пониженным давлением. Получают 9,15 г антибиотика в виде красно-оранжевого аморфного порошка с титром 2180 ед/мг.П р и м е р 5. Готовят смесь, состоящую из хлористого метилена, четыреххлористого углерода и буферного раствора Мак Ильвэна с рН 5,8 буферного раствора (20 см этого буферного раствора приготавливают добавлением 12,09 см 0,2 м раствора двузамещенного фосфата натрия Иа,НР 04 к 7,91 см 0,1 м лимонной кислоты (в соотношении 2: 1; 3, по объему). Когда смесь приходит в равновесие, разделяют обе фазы. Растворяют 10 г продук. та с титром 1750 ед/мг (полученного способом, описанным в примере 4) в смеси, состоящей из 1 л каждой фазы. Эту систему подвергаютпротивоточному распределению в 6 переходов в 5-литровых колбах, используя при этом тяжелую фазу( растворитель) в качестве подвижной фазы, а легкую фазу (водную) - в качестве стационарной фазы. Каждый раз используют 1 л каждой фазы. Производят раздельный сооо с.,леси низких (смесь Л) и высших (смесь В) фаз четырех первых колб и смесь низших (смесь С) и высших (смесь Д) фаз трех последних колбВеличину рН смеси В доводят до 7,5 добавлением 300 см 1 н, едкого патра, а затем производят постепенное экстрагирование смест четьтрьтя, двумя и одни литром хлороформа. Хлопоформовые экстракты и смесь Л сосдиняют и конттецтриоуют под пт.ижентлым давлением до объе.:а 700 смз. Ко:щентрат промьтватот двумя порциями воды по 350 см до рН 7,5, а проьтвочпые ттято и.те пастворы1ЭКСтРЯГИРУЮт ДВУМЯ ПОРТ ИЯ.тИ ХЛОРОтРМа ПО 100 см. Ьонце.рят и;.О тьтпяют, а хлороф 01 тмовые экстракты соединяют и концентрируют под понихтеппым, ав.теппем до голу:ения объема 70 стл, Зяте добавляютОО см гексана, и получепньпл осадок фильтруют, промывают и вьтс шивяют под поцижеттпым давлением1 ппи -е лпепяг пе 30 С. Пол;тают 5.,1 г шпакции Р в основном содержятцей первый активный тло. тпоттеттт.Смесь Д постепенно экстрагирутот добавлением 3 л, я зате.,т 1,5 л хлористого метилена. Экстракты хлористого метилепа и смесь С соединяют и коппентпируют пол пониженным давлентлем до 800 см. Концентрат промттватот 400 см воды, а затем сиона концентрируют до получения объема 700 см. После этого добавлятот 1 л гсксана, и полученный осадок фильтруют, промывают и высушивятот под пониженным давлением пои температур. 30 С. Получают 3,7 г фракции Г, в основном содержащей второй активный компонент.П р и м е р 6 10 г пгодукта, подобного Фракции Р после растворения в 200 см системы этилацетат - метанол - 0.,067 мол/М/15 (буферный раствор фосфата с рН 5,5 (в соотношении 8:3: 5, по объему) подвергают противоточному распределению в 110 переносов в аппарат Крейга с 50 ячейками (50 переносов в аппарате с 60 переходов согласно методу единичного извлечения зтпд 1 е Мйс 1 гача 1), причем операцию начинают в первых двух ячейках, Собирают смесь высших фаз из ячеек с 0 по 37 (3,8 л) и концентрируют ее до получения 300 см. Этот концентрат и смесь низших фаз ячеек с 0 по 37 /3,8 л) соединяют и концентрипуют до 800 см. Величину рН доводят до 8 добавлением 180 сттто 1 н. едкого натра, Полученный раствор постепенно экстра. гируют добавлением 800, а затем 400 см хлороформа. Хлороформовые экстракты концентрируют до 400 см и ппомывают 400 см подщелоченной воды с рН 8; промывочные маточные растворы экстрагируют 200 см хло роформа. Промытый концентрат и хлороформовые экстракты соединяют, концентрируют бдо 400 см, промывают 400 см поищелоченной воды с рН 8, концентрируют до 100 см, к ним добавляют 200 см бутанола и снова концентрируют5 до 100 см. Величину рН полученного бутанолового раствора доводят до 3,5 добавлением 30 см бутанола, насыщенного 1 н. соляной кислотой, и раствор выдерживают в течение 12 час при 4 С. Образуются кристаллы, кото рые фильтруют, промывают и высушивают.Получатот первые 4,55 г хлоргидрата сырого продукта первого активного компонента. Путем концентрации кристаллизационных маточных растворов до 100 см, добавления 1 л гек саго, а затем фильтрации, промывки и просушивания осадка получают вторую порцию 2,5 г хлоргидратя сырого продукта первого активного компонента.П р и м е р 7 3,75 г хлоргидрата сырого про дукта первого активного компо;тента, полученного способом, описанным в примере б, растворяют в 40 см диоксяна, содержащего 20% воды. Полутентльтй раствор Фильтруют, а затем и нему добавляют сначала в течение двух 25 носов 15 с., безводттого диоксяпя, а затем втечение 30 мип 235 см безводного диоксана.Получают продукт в виде кристаллов, который центрифугпруют, промывают тт просушиватот, Полу аот 2,75 г хлоргидрата продукта 30 первого огтивного компонетлта - красно-оранжевых кристаллов в виде игл, которые плавятся, ттоспадаясь при 225 - 230 С. Читр 151 ед/мг.0,208 г этого соедтптепттч растворяют в смеси сос ояптей из 200 см воды и50 см бута 35 пола. Затем добявлятот 3,4 с.л 0,1 н. едкогот 1 атра, декантируют и э,страгпруют водную Фазу с помощью 50 см бутанола. Бутаноловьте экстпякттч соединяют, промывают двумя порциями по 100 с.Р поттщелоченной воды с 40 рН 8 и концентрируют ло обьема 10 см. Позлученньтй концентрат обрабатывают 50 см гексяна. Осадок Фттльтрутот, ттоомывают и высушивают. Получают 0,0945 г антибиотика первого активтюго компонента в виде красного 45 амопфпого порошка с титром 160 едЬтг.П р им ер 8. 5 г продукта, подобного фракили Р, полученной по способу примера 5, после раствопепия в 200 см системы этиляцетат-метанол,067 мол тМ 15) буферный 50,раствор фосфата с рН 5,5 (в соотнотпении 8::3: 5, по объему) подвергают противоточному распределению, аналогично описанному в примере 6. Собирают смесь высших фаз из ячеек с 36 до 89 (5,3 л) и концентоируют ее до по лучения 800 см. Концентрат постепенно экстрагируют двумя псрцчями хлористого мети- лена по 800 см, а зяте.т 800 см хлороформа.Полученные экстракты собирают. концентрирмют до 400 смз. промьтватот двумя порциями 60 по 400 см воды с рН 7,5 и, наконец, концен.трируют до 10 см, Добавлением 100 см гексопа образуется продукт осаждетттля, который фильтруют, промьтвают и высушивают под пониженным давленис: Получают 1,1 г антибиотика второго активного компонента в5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 виде красно-оранжевого а морф, о порошка с титром 2650 ед/мг.П р и м е р 9 500 л сусла культуры,:полученного как указано в примере 2, обрабатывают способом, описанным в примере 3. Получают 8,5 г сырого продукта с титром 395 ед/мг,17 г сырого продукта, подобно этому, подвергают очистке способом, описанным в примере 4, но хлористый метилен заменяют этилацетатом. Получают 3 г антибиотика с титром 1300 ед/мг.П р и м е р 10 12,4 г продукта, полученного способом, описанным в примере 9, подвергают противоточному распределению в 50 переходов в системе бутанол- М/3 буферный раствор фосфата с рН 7,35.Путем экстрагирования бутанолом низших фаз ячеек с 12 по 35, концентрации бутаноловых экстрактов, промывки и добавления гексана получают первую порцию 1 г хлоргидрата продукта первого активного компонента, а после концентрации маточных растворов - вторую порцию 1,1 г хлоргидрата продукта первого активного компонента. После рекристаллизации в водном диоксане две эти порции представляют собой красно-оранжевые иголки, плавящиеся, распадаясь при 225 - 230 С. Титр 67 ед/мг.В результате обработки ячеек с 36 по 49 получают 1,1 г сырого продукта второго активного компонента с титром 1800 ед/мг, После противоточного распределения в 50 переходов в системе бутанол - этилацетат - буферный раствор Мак Ильвэна с рН 4 (в соотношении 3: 7: 10, по объему) получают 0,5 г продукта второго активного компонента в виде красно- оранжевого аморфного порошка с титром 2000 ед/мг.П р и м е р 11 625 л сусла, приготовленного способом, описанным в примере 2, помещают в чан с мешалкой, Величину рН доводят до 9 добавлением концентрированного раствора едкого натра, Взбалтывают в течение 30 мин, затем добавляют 32 г вспомогательного материала для фильтрации.Смесь фильтруют на фильтр-прессе и промывают 275 л воды. В фильтрат, объем которого составляет 780 л, добавляют 156 кг хлористого натрия, а затем с помощью 12 н. соляной кислоты величину рН доводят до 3, Потом фильтрат экстрагируют 260 л бутанола, Бутаноловый экстракт концентрируют под пониженным давлением при температуре 35 С до .получения 4 л. Сырой антибиотик осаждают из раствора, осветленного 32 л петролейного эфира, центрифугируют, промывают и высушивают в сушильном шкафу при 30 С под вакуумом. Получают 227 г сырого продукта в виде коричнево-красного порошка с титром 45 ед/мг.50 г предыдущего сырого продукта растворяют в 200 см бутанола, насыщенного водой, и полученный раствор хроматографируют при рН 4 через колонку, содержащую 500 см окиси алюминия. После фиксации антибиотика начинают проявление и элюирование добавлением 4 л бутанола, насыщенного водой. Таким образом собирают 3 окрашенных фракции с соответствующими объемами 450, 1500 и 1500 см. Первую фракцию концентрируют под пониженным давлением до 50 см, а затем обрабатывают 500 см гексана; получают 8,3 г продукта с титром 68,5 ед/мг. Две последние фракции соответственно концентрируют под пониженным давлением до 100 см, затем обрабатывают 1 л гексана; получают соответственно 4,4 г продукта с титром 216 ед/мг и 1,35 г продукта с титром 800 ед/мг.П р и м е р 12 425 л сусла, приготовленного способом, описанным в примере 1 (титр 40 ед/см), подкисляют до рН 1,8 щавелевой кислотой и фильтруют. Осадок после фильтрования промывают 100 л воды, подкисленной до рН 2 щавелевой кислоты; получают 500 л фильтрата. Этот фильтрат последовательно 2 раза экстрагируют до рН 8 добавлением 150, затем 100 л хлороформа. Экстракты соединяют и экстрагируют водой до рН 4; получают соответственно 80 и 50 л. Полученный водный экстракт подщелачивают до рН 8 1 н. раствором едкого натра и экстрагируют сначала 40, а затем 20 л хлороформа. Полученные таким образом хлороформовые экстракты подкисляют до рН 4 раствором уксусной кислоты в хлороформе (10: 100, по объему). Подкисленный экстракт концентрируют при 30 С под пониженным давлением до 50 см. Затем сырой антибиотик осаждают 500 см гексана, центрифугируют, промывают и высушивают в сушильном шкафу под вакуумом при 30 С. Получают 680 мг продукта в виде красного порошка с титром 1080 ед/мг.П р и м е р 13 500 мг антибиотика, полученного способом, описанным в примере 4, растворяют в 100 см 1 н. серной кислоты и полученный раствор в течение 20 мин нагревают на водяной бане. После охлаждения экстрагируют тремя порциями этилацетата по 200 см, экстрагированный органический раствор затем просушивают на безводном сульфате натрия, фильтруют и концентрируют до небольшого объема. После фильтрования, промывки и сушки получают 218,5 мг кристаллов.150 мг полученных кристаллов растворяютв 3 см хлороформа и 1,5 см бензола. Раствор хроматографируют на бумаге (20 листов бумаги для хроматографии марки Аршь310, пропитанной ацетоновым раствором, содержащим 20% формамида). Затем проявляют в течение 90 мин с помощью смеси хлороформ-бензол (2: 1), насыщенной формамидом, Основную зону К 1=0,86 вырезают на всех 20 листах бумаги, и полученные 20 зон измельчают в смесителе в присутствии метанола. Смесь фильтруют, концентрируют и в нее добавляют 10 объемов воды. Полученный осадок фильтруют, промывают и высушивают под пониженным давлением; получают 120 мг кристаллов, 170 мг кристаллов, идентичных полученным, раство459895 ряют в 15 см диоксана с 20% воды. Затем по капле добавляют воду, подкисленную до рН 4 0,1 н. соляной кислотой, Образовавшиеся кристаллы фильтруют, промывают и высушивают; получают 130 мг агликона продукта в виде красно-оранжевых иголок, плавящихся при температуре 160 С, а затем при 225 в 2 С.П р и м е р 14 500 мг антибиотика первого активного компонента, полученного способом, описанным в примере 7, обрабатывают серной кислотой, как это описано в примере 13, и получают 300 мг кристаллов, которые после очистки способом, описанным в том же примере 13, дают 202 мг ггликона продукта первого активного компонента в виде красно-оран 500 400 300 )200 00 ООО У 50 ОО В 50 ВОО 750 700 650 2000 У О 2 3 4 5 500 /400 /500 200 ООО ООО 050 УОО 850 800 750 700 650 00 00 80 70 б 0 50 60 30 20 ОЯ 3 4 5 0 ОЮц.г,2 00 УО ВО 70 бО 50 О ЗО 20 О 0 10жевых иголок, плавящихся при 160 С, а затем при 225 - 230 С, Этот агликон идентичен агликону продукта 9865 К. Р. 5 Предмет изобретени я Способ получения антибиотика, о т л и ч а ющий ся тем, что культуру 51 гер 1 огпусез соегц 1 еогцЬЫцз 8899 или 31723 выращивают в аэ робных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и микроэлементы, в течение 2 - 5 дней при температуре 23 - 35 С и начальном рН среды 6,0 - 7,8 с последующим выделением, очист кой и разделением целевого продукта извест"; ными приемами.459895боа НОО 800 (200 1100 000 950 900 850 800 750 700 650200000908070о 050Со3020Юо7 8Ю О /2 /ЮФиг,8Составитель Т. ГоловинаРедактор Т. Караиова Техред Т. Миронова Корректор А. ДзесовзЗаказ 849/11 Изд.382 Тираж 529 Подписи".". ЦНИИПИ Государственного комитета Сонета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж.З 5, Раугнская наб., д. 45 Типография, пр. Сапунова, 2