Способ получения карбоксипептидазы а и карбоксипептидазы в из поджелудочной железы свиньи

в 0,005 М трис-НС 1 буФере выделяютКП А, а рН буферного раствора навсех стадиях 7,5-7,6.Пример).1. Приготовление ацетонового порошка.0,7 кг свежезамороженных поджелудочных желез разрезают на кусочкитолщиной 4-6 мм и проводят автолизпри комнатной температуре 20-24 ч,Полученную массу обрабатывают прикомнатной температуре четырьмя объемами ацетона, интенсивно перемешиваяв течение 1 мин, Аналогично проводятобработку желез еще 3 раза ацетоном,смесью ацетона и эфира (1;1) и эфиром, Обработанные железы сушат прикомнатной температуре,11. Экстракция,Ацетоновый порошок иэ автолизированной поджелудочной железы свиньиперед экстракцией размельчают вэлектрической лабораторной мельнице.К 140 г ацетонового порошка добавляют 1400 мл 0,005 М трис-НС 1 буфера(рН 7,5) и перемешивают 45 мин намагнитной мешалке при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием. Получают 1300 мл центрифугата желтоватого цвета, рН экстракта доводят до 7,5 с помощью 1 Мраствора НаОН.111. Осаждение Ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония. К экстракту по порциям, перемешивая на магнитной мешалке, добавляют сульфат аммония до 0,64 насыщения (422,3 г/л), поддерживая рН 7,5 1 М раствором НаОН.Продолжают перемешивать еще 30 мин, Центрифугируют 40 мин при 6000 об./мин при 3 С, Белковый осадок, содержащий КП А и КП В, суспендирую в 350 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера (рН 7,5), помещают в целлофановые мешочки и диализируют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 24 ч против охлажденного 0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,5). Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, Центрифугат в количестве 400 мл используют для дальнейшей очистки,17, 1 хроматография ча колонке 6 х 25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером (рН 7,5).35 40 45 50 55 5 1 О 15 20 25 30 На колонку наносится 400 мл раствора белка, полученного на стадии111. Колонку промывают 5 л 0,005 Мтрис-НС 1 буферного раствора (рН 7,5)для освобождения от неадсорбированного белка. Белковую Фракцию КП Вэлюируют линейным градиентом концентрации ИаС 1: в первом сосуде -л0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,5), аво втором - 1 л этого же буфера с0,25 М НаС 1.Объединяют Фракции судельной активностью КП В не менее50 ед/мг белка (600 мл).Белковую фракцию КП А элюируют1 л 0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,5)с 0,25 М КаС 1, Объединяют фракциис удельной активностью КП А не менее 12 ед/мг белка (520 мл).К полученным с колонки хроматографическич фракциям КП А и КП Вдобавляют сульфат аммония до 0,65насыщения, .Осадок отделяют центрифугированием в течение 1 ч при6000 об/мин и 3 С и растворяютв 50 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера(50 мл) используют для дальнейшейочистки,Ч. Очистка КП В хроматографиейна ДЭАЭ-целлюлозе,Диализат от стадии 1 Ч, содержащийКП В активность, наносят на колонкус ДЭАЭ-целлюлозой (2,9 25 см), уравновешанной 0,005 М трис-НС 1 буфером(рН 7,5) со скоростью течения 3040 мл/ч, отмывают от неадсорбированных белков 800 мл этого же буфера.Элюирование КП В проводят линейнымградиентом МаС 1: в первом сосуде500 мл 0,005 М трис-НС 1 буфера(рН 7,5), а во втором - 500 мл этогоже буфера с 0,25 М НаС 1. Объединяются фракции с удельной активностьюКП В не менее 100 ед/мг белка, Кэлюату добавляют сульфат аммония до0,65 насыщения, осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 20 мл0,05 М трис-НС 1 буфера (рН 7,5),Диализуют в течение 24 ч против0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,5),Осадок отделяют центрифугированиеми отбрасывают.55742 45 мл раствора КП А от стадии 1 Чнаносят на колонку с ДЭЛЭ-целлюлозойуравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером (рН 7,5) со скоростью течения30-40 мл/ч, отмывают от неадсорбиро -ванных белковл этого же буфера,Потом ставится градиент: в первомсосудел 0,005 М трис-НС 1 буфера(рН 7,5), а во втором - 1 л этого жебуфера с 0,3 М ЮаС 1, Объединяютсяфракции с удельной активностью КП Ане менее 6 ед/мг белка (200-300 мл).К элюату медленно по порциям, перемешивая на магнитной мешалке, добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения. Осадок отделяют центрифугированием в течение 50 мин при6000 об/мин при 3 С и растворяют в20 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера (рН 7,5)Диализуют против 0,005 М трис-НС 1буфера (рН 7,5) в течение 24 ч, Осадок отделяют центрифугированием иотбрасывают,Ч 11. Кристаллизация КП А, Центрифугат помещают в целлофановые мешочки и диализуют против дистиллированной воды в течение 36 ч. Осадок КП А отделяют центрифугированием в течениеч при 5000 об/мин при 3 С и суспендируют в 40 мл дистиллированной воды, медленно перемешивая на магнитной мешалке 30 мин для отмывки от растворимых в воде примесей. Осадок отделяют центрифугированием и вновь суспеиднруют в 20 мл воды. К суспензии медленно по каплям, провеняя рН, прибавляют О, М ИаОН до рН 6,8. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, Центрифугат помещают в целлофановые мешочки и диализуют в течение 36 ч против дистиллированной воды, К образовавшейся суспензии кристаллов КП А добавляютмл толуола (52 от объема суспензии).Выход 20 мл суспензии фермента, содержащей 4000 Е КП А с удельной активностью КП А 29,7 ед/мг белка, выход по активности 327 (по международным единицам определения активности ферментов). 5Выход 20 мл раствора фермента судельной активностью КП В 49 ед/мгбелка, выход по активности 35,77.,Ч 1. Очистка КП А хроматографиейна ДЭАЭ-целлюлозе. Приме р 2.1. Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру .511 Экстракция.Ацетоновый порошок перед экстракцией размельчают. К 40 г ацетоновогопорошка добавляют 400 мл 0,005 Мтрис-НС 1 буфера (рН 7,55) и перемеши - О вают 45 мин при комнатной температуре. Центрифугируют, рН полученногоэкстракта доводят до 7,55 1 М раствором ИаОН.111. Осаждение ферментного комплек 5 са РЛ А и КП В сульфатом аммония.К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,65 насьпцения (430,4 г/л),поддерживая рН 7,55М растворомаОН.Осадок отделяют центрифугированием и суспендируют в 350 мл 0,05 Мтрис-НС 1 буфера (рН 7,55), диализуютв течение 24 ч против 0,005 М трисНС 1 буфера (рН 7,55). Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают.25 1 Ч. 1 хроматография на колонке сДЭАЭ-целлюлозой,Ра колонку 625 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трисНС 1 буфером (рН 7,55), наноситсяЗп 400 мл раствора белка от стадии 111.Для освобождения от неадсорбированного белка колонку промывают 5 л0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,55),КП В элюируют линейным градиентомконцентрации ИаС 1: в первом сосудел 0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,55),а во втором - 1 л этого же буфера с0,255 М МаС 1, Объединяют фракции судельной активностью КП В не менее4 О 50 ед/мг белка (600 мл).КП А элюируютл 0,005 М трис-НС 1буФера (рН 7,55) с 0,255 М МаС 1.Объединяют фракции с удельной активностью КП А не менее 2 ед/мг белка,45 Фракции КП А и КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщенияОсадок отделяют центрифугированиеми растворяют в 50 мл 0,05 М трис-НС 1буфера (рН 7,55) и диализуют против0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,55),Ч, Очистка КП В хроматографией наДЭАЭ-целлюлозе.Диализат от стадии 1 Ч с КП В активностью наносят на колонку с ДЭАЭ 55 целлюлозой, уравновешенной 0,005 Ртрис-НС 1 буфером (рН 7,55). Отмываютот неадсорбированных белков 800 млэтого же буфера. Потом ставится градиент: в первом сосуде - 500 мл0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,55),а но втором - 500 мл этого же буфера с 0,25 Р МаС 1, Объединяются фрак-ции с удельной активностью КП В не5менее 100 ед/мг белка, осаждаютсясульфатом аммония до 0,65 насыщения,Осадок после центрифугирования суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС 1буфера (рН 7,55). Диализуют против0,005 М трис-НС 1 буера (рН 7,55),Центрифугируют.Выход 20,5 мл раствора Ферментас удельной активностью КП В 151,5 ед/мгбелка, выход по активности 33,777 Т. Очистка КП Л хроматографиейна ДЭАЭ-целлюлозе.Диализат от стадии ТЧ с КП А активностью наносят на колонку с ДЭАЭцеллюлозой, уравновешенной 0,005 Мтрис-НС 1 буфером (рН 7,55), отмывают от неадсорбированных белков1 л этого же буфера. Потом ставитсяградиент: в первом сосуде - 1 л0,005 Р трис-НС 1 буфера (рН 7,55), 25а во втором - 1 л этого же буфера с0,3 М МаС 1. Объединяют фракции с КПА активностью и осаждают сульфатомаммония до 0,65 насыщения, Осадокотделяют центрифугированием и растворяют в 20 мл 0,05 М трис-НС 1 буФера (рН 7,55). Диализуют против0,005 М трис-НС 1 буфеа (рН 7,55),7 ТТ. Кристаллизацию КП А проводятаналогично примеру 1.35Выход 19,5 мл с спензии ферментас удельной активностью КП Л32,5 ед/мг белка, выход по актиннос -ти 31,57,40ПримерЗ.Т. Приготовление ацетонового-порошка проводят аналогично примеру 111. Экстракция,К 140 г ацетонового порошка добавляют 1400 мл 0,005 М трис-НС 1 буфера рН 7,6. Перемешивают ч 5 мин, центрифугируют, рН экстракта доводят довеличины 7,6 1 М раствором ИаОН.ТТТ. Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммо 50ния.К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,66 насыщения (438,8 г/л),поддерживая рН 7,6 1 М растворомХаОН. Центрифугируют, осадок суспен 55дируют н 350 мл 0,05 М трис-НС 1 буФера рН 7,6, диализуют против 0,005 Мтрис-НС 1 буфера рН 7,6. ТЧ. Т хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.Диализат от стадии ТТТ наносятна колонку с ДЭЛЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером(рН 7,6), промывают 5 л этого жебуфера. Для элюирования КП В ставится градиент: н первом сосуде - 1 л0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,6), аво втором -л этого же буфера с0,26 М ЯаС 1. КП А элн.ируют 1 л0,005 М трис-НС 1 буфера рН 7,6 с0,26 М БаС 1,Объединенные фракции КП В и КП Аосаждают сульфатом аммония до 0,65насыщЕния отделенный центрифугированием осадок суспендируют н 0,05 Мтрис-НС буфере (рН 7,6) и диализуют против 0,005 М трис-НС 1 буфера(рН 7,6),Ч. Очистка КП В хроматографиейна ДЭАЭ-целлюлозе.Диализат с КП В активностью наносят на к.лонку с ДЭЛЭ-целлюлозой,уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером (рН ,6), элюируют линейнымградиентом концентрации БаС 1: н первом сосуде - 1 л 0,005 М трис-НС 1буфера (рН 7,6), а но втором - 1 лэтого же буфера с 0,25 М НаС 1. Объединенные фракции КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения осадок после центридугиронания растворяют н 0,05 М трис-НС 1 буфере (рН 7,6).Диализ проводится против 0,005 Мтрис-НС 1 буфера (рН 7,6),Выход 21 мл раствора фермента судельной активностью КП В 155 ед/мгбелка, ныхоц по активности 38,37,оЧТ. Очистка КП А хроматографиейна ДЭЛЭ-целлюлозе.Диализат от стадии ТЧ с КП А активностью наносят на колонку с ДЭАЭцеллюлозой, уравновешенной 0,005 Мтрис-НС 1 буфером (рН 7,6), пропускают 1 л этого же бункера. Ставитсяградиент: в первом сосуде -л0,005 М трис-НС 1 буфер (рН 7,6), ано втором - 1 л этого же буфера с0,3 М БаС 1. Объединяют Фракции сКП Л активностью, осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения и осадок после центрифугиронания растворяют н 20 мл 0,05 М трис-НС 1 буфереВыход 20 мл суспензии Фермента судельной активностью КП А 30,2 ед/мгбелка, выход по активности 3,8/Приме р 4,51. Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру .11. Дкстракция.Дкстракцию проводят 0,005 М трисНС 1 буфером (рН 7,4), рН экстрактапосле центрифугирования доводят довеличины 7,4М раствором ИаОН.111. Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония,К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,63 насыщения (44,2 г/л),поддерживая рН 7,4М растворомМаОН. Осадок после центрифугирования суспендируют в 350 мл 0,05трис-НС 1 буфера (рН 7,4), диализуютпротив 0,005 М трис-НС 1 буфера(рН 7,4), пропускают 5 л этого жебуфера, Для элюирования КП В ставится градиент: в первом сосуде -л 300,005 М трис-НС 1 буфера рН 7,4, аво втором -л этого же буфера с0,24 М ИаС 1. КП А элюируютл0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,4) с0,24 М МаС 1.Объединенные фракции КП В и КП Аосаждают сульфатом аммония до 0,65насыщения, осадок после центрифугирования суспендируют в 0,05 М трисНС 1 буфере (рН 7,4) и диализуют против 0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,4),Ч. Очистка КП В хроматографиейна ДЭАЭ-целлюлозе,Фракцию КП В от предыдущей стадии наносят на колонку с ДДАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трисНС 1 буфером (рН 7,4), элюируют линейным градиентом концентрации НаС 1: впервом сосуде -л 0,005 М трис-НС 1буфера (рН 7,4), а во втором -лэтого же бункера с 0,25 У ХаС 1. Объединенные Фракции КП В осаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения,осадок растворяют в 0,05 М трис-НС 1буфера (рН 7,4), Диализуют против0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,4),Выход 17,5 мл раствора Фермента судельной активностью КП В 107,4 ед/мгбелка, выход по активности 247 Ч 1, Очистка КП А хроматографиейна ДДАД-целлюлозе.. Фракция КП А от стадии 1 Ч наносится на колонку с ДДАЭ-целлюлозой,уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером (рН 7,4), промывают колонкул этого же буфера. Потом ставитсяградиент: в первом сосуде -л0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,4), аво втором -л этого же буфера с0,3 М БаС 1. Объединенные фракции КП Аосаждают сульфатом аммония до 0,65 насыщения, Осадок растворяют в 0,05 Мтрис-НС 1 буфере (рН 7,4), Диалиэуютпротив 0,005 М трис-НС 1 буфера(рН 7,4),Ч 11. Кристаллизацию КП А проводятаналогично примеру .Выход 8 мл суспенэии фермента судельной активностью КП А 22,6 ед/мгбелка, выход по активности 287П р и м е р 5.Е, Приготовление ацетонового порошка проводят аналогично примеру .11. Дкстракция.Дкстракцию проводят 0,005 М трисНС 1 буфером (рН 7,7), рН экстрактапосле центрифугирования доводят до величины 7,7М раствором НаОН.111, Осаждение ферментного комплекса КП А и КП В сульфатом аммония.К экстракту добавляют сульфат аммония до 0,67 насыщения (447,2 г/л),поддерживая рН 7,7М растворомНаОН, Осадок после центрифугированиясуспендируют в 350 мл 0,05 М трис-НС 1буфера (рН 7, 7), диализуют против0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,7).1 Ч. 1 хроматография на ДДАЭ-целлюлозе.Диализат от стадии 111 наноситсяна колонку с ДДАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером(рН 7,7), пропускают через колонку,5 л этого же буфера, Для элюированияКП В ставится градиент: в первомсосуде -л 0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,7), а во втором -л этогоже буфера с 0,27 М НаС 1. КП А элюируютл 0,005 М трис-НС 1 буфера (рН7,7) с 0,27 М НаС 1. Объединенные фракции КП В и КП А осаждают сульфатомаммония до 0,65 насьпцения, осадоксуспендируют в 0,05 М трис-НС 1 буфере (рН 7,7) и диализуют против0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,7).Ч. Очистка КП В хроматографией наДДАЭ-целлюлозе.12 1551742 Выход 17 мл суспензии ферментас удельной активностью КП А 20 ед/мгбелка, выход по активности 273,формула изобретения 10 20 30 Составитель А.Семенов Редактор Н.Рогулич Техред М.Дидык Корректор Т,МалецПодписное Тираж 482 Заказ 309 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат Патент". г,ужгород, ул. Гагарина,101 Хроматографию проводят на колонкес ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной0,005 М трис-НС 1 буфером (рН 7,7),КП В элюируют линейным градиентомконцентрации НаС 1: в первом сосуде1 л 0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,7),а во втором - 1 л этого же буфера с0,25 М ИаС 1. Объединенные фракцииКП В осаждают сульфатом аммония до0,65 насьпцения, осадок растворяютв 0,05 М трис-НС 1 буфере (рН 7,7),Диализуют против 0,005 М трис-НС 1буфера (рН 7,7),Выход 18 мл раствора фермента судельной активносФью КП В 115 ед/мгбелка, выход по активности 25,4 Х.Ч 1, Очистка КП А хроматографиейна ДЭАЭ целлюлозе.Фракция КП А от стадии 1 Ч наносится на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой,уравновешенной 0,005 М трис-НС 1 буфером (рН 7,7), пропускают 1 л этогоже буфера. Потом ставится градиент,в первом сосуде - 1 л 0,005 М трисНС 1 буфера (рН 7,7), а во втором -1 лэтого же буфера с 0,3 М МаС 1.Объединенные фракции КП А осаждаютсульфатом аммония до 0,65 насыщения,осадок растворяют в 0,05 М трис-НС 1буфере (рН 7,7), Диализуют против0,005 М трис-НС 1 буфера (рН 7,7),Ч 11. Кристаллизацию КП А проводятаналогично примеру 1. Способ получения карбоксипептидазы А и карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи, включающий экстракцию сырья, обработку экстракта сульфатом аммония, получение осадка, выделение и очистку целевого продукта двукратной ионообменной хроматографией, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, экстракцию проводят 0,005 М буфером трис-НС 1 с рН 7,5-7,6, полученный экстракт обрабатывают сульфатом аммония при степени насыщения 0,64-0,66 и при рН 7,5-7,6, а ионообменную хроматографию осадка проводят на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,005 М буФере трис-НС 1 с рН 7,5-7,6 в градиенте концентрации хлорида натрия от 0 до 0,25-0,26 М для выделения карбоксипептидазы В в изокритическом режиме, при концентрации хлорида натрия 0,25-0,26 М для выделения карбоксипептидазы А с последующей повторной ионообменной хроматографией выделенных ферментов в тех же условиях.