Способ выделения формиатдегидрогеназы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1)5 С 12 И 9/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР О ИЕ ИЭОБРЕТЕНИ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ Т.ДРОха, роим еи Наие с мент единеА.Г.Гадуветкявич ин Р Пе 8. 8)Ач 11 оча Т.Ч Р 1- Ч.О., Код 1 опоч Уи.Ч. -Оерепдепг Гогщаге т шегпу 1 оггорЫс- Ецг. 1. В 1 осЬещ. р. 569-576.етельство СССР 12 И 9/04, 1987. Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделен и очистки РАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1,2,1,2), которая используется для определения микро количеств муравьиной кислоты в сло ных смесях, в процессах тонкого ор ганического синтеза получения прос и меченых физиологически активных разрушение траэвуково ретиранием суспе деэин клето л граторе или пеянными шариками соединении (стероиды, кислоты, ами нокислоты и т,д.), с использование системы регенерации НАДН на основе формиатдегидрогеназы.Цель изобретения - увеличение выхода фермента по активности,Способ осуществляют следующим об разом,(21) 4429785/31 -(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОРИАТДЕГРГЕНАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выделенияи очистки ИАД-зависимой формиатдегидрогенаэы (КФ 1.2.1,2), Цель изобретения - увеличение выхода ферментапо активности. Бесклеточный экстракт получают разрешением суспенэии клеток. Часть примесных белковосаждают в 40 Х от насыщения сульфате аммония, а супернатант подвергаютдальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе,содержащем в качестве модифицирующейфенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирующего буфера. Удельная активностьфермента 11-12 мкмоль/мин на 1 мгбелка, Выход по активности 82-867.,есклеточныи экстракт получают или раврушением замороженных клетокна Х-прессе, или другим соответствующим способом. Часть примесных белковосаждают. в сульфате аммония (403 отнасьзцения), а супернатант подвергаютдальнейшей очистке с помощью гидрофобной хроматографии на носителе,содержащем в качестве модифицирующейфенильную группу, в условиях нисходящего градиента ионной силы элюирунщего буфера. Удельная активность фермента составляет 11-12 мкмоль/мин/мгбелка, Выход по активности 82-867П р и и е р 1. 50 г сырых клеток бактерий Рзецйогпопаз вр, 101 ВКМ ВР суспендируют в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8. Разрупение проводят на дезинтеграторе УЗУН в положении максимального резонанса (частота 22 кГц, мощность 0,3 Вт) в течение 20 мин при охлаждении (ванна со льдом и солью). Клеточную суспензию центрифугируют 60 мин при охлаждении при 15000 д, Общая активность формиатдегидрогеназы в супернатанте составляет 6100 мкмоль/мин, удельная активность 1,1 мкмоль/мин/мг белка. К полученному бесклеточному экстракту добавляют или мелко измельченный твердый сульфат аммония, или насьпценный раствор сульфата аммония до конечной концентрации сульфата (407. насыщения). . Через 2-12 ч раствор центрифугируют30 мин при охлаждении при 15000 8Осадок отбрасывают. Суммарная активность фермента в супернатанте составляет 6050 мкмоль/минудельная активность 1,67 мкмоль/мин/мг белка,Супернатант наносят на колонку с 40 г (90 мл) фенилсилохрома Ссконцентрацией фенильных групп1.17 мкмоль/г носителя. Носитель отмывают от части примесных белков 15%от насыщения раствором сульфата аммония. Формиатдегидрогеназу элюируют линейным нисходящим градиентом: 5-07.от насыщения раство.-чм сульфата аммония, общий объем градиента 400 мл.Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,5 мкмоль/мин/мг белка,Выход по активности 83%.П р и м е р 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюции фермента с колонки используютлинейный нисходящий градиент: 15-57.от насыщения раствором сульфата аммония. Удельная активности фермента11,9 мкмоль/мин/мг белка. Вьжод поактивности 84%.П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюциифермента с колонки используют линейный градиент: 20-0% от насыщенияраствором сульфата аммония. Удельнаяактивность формиатдегидрогеназы10,9 мкмоль/мин/мг белка. Выход поактивности 86 .П р и м е р 4, Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюциифермента с колонки используют линейный градйент: 14-07. от насьпцения раствором сульфата аммония. Удельнаяактивность формиатдегидрогеназы12,1 мкмоль/мин/мг белка, Выход поактивности 67%.П р и и е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для элюциифермента с колонки используют линей- .ный градиент: 21-07. от насыщения раствором сульфата аммония. Удельнаяактивности формиатдегидрогеназы9,8 мкмоль/мин/мг белка, Выход поактивности 89%,15 П р и м е р 6. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качественосителя используют фенил-сефарозуС 1;4 В (РЬаппасза, 1 п 1 веция) (140 мл).Удельная активность формиатдегидро 20 геназы 11,2 мкмоль/мин/мг белка. Выход по активности 822.П р и м е р 7. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качественосителя используют модифицирован 25 ный фенил-Тойоперл с концентрациейфенильных групп 230 мкмоль/г носителя(100 мл). Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,8 мкмоль/мин/мгбелка. Выход по активности 847.,П р и м е р 8. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качественосителя используют модифицированный Сферон 1000 с концентрацией фенильных групп 160 мкмоль/г носителя(100 мл). Удельная активность формиатдегидрогеназы 11,0 мкмоль/мин/мгбелка, Выход по активности 84 .П р и м е р 9. Способ осуществляют согласно примеру 1, но в качестве40 источника формиатдегидрогеназы берутбиВчассу дрожжей СапдЫа шеЬУ 1 са,Суммарная активность фермента в бесклеточном экстракте 830 мкмоль/мин,удельная активность 0,33 мкмоль/мин/мгбелка, После обработки растворомсульфата аммония (40% от насьпцения)суммарная активность 810 мкмоль/мин,удельная активность 0,51 мкмоль/мин/мгбелка. После очистки гидрофобнойхроматографией на фенилсилохромеудельная активность формиатдегидрогеназы равна 7,4 мкмоль/мин/мг, выходпо активности 787,Формула изобретенияСпособ выделения формиатдегидрогеназы, включающий дезинтеграцию биомассы микроорганизма-продуцента,1551741 6о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью увеличения выхода фермента поактивности, на стадии гидрофобной хро.5матографии используют носители с фенильными группами в условиях нисходящего градиента сульфата аммония от15-20 до 0-5 Х. 5осакдение части примесных белков сульфатом аммония в ,40 Х от насыщения - с последующей очисткой целевого продукта гидрофобной хроматографией на носителе с углеводородными группами в условиях нисходящего градиента концентрации сульфата аммония 1 Составитель А,СеменовРедактор Н.Рогулич Техред М.Дидык Корректор А.Обручар Заказ 309 Тиржк 484 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.уагород, ул. Гагарина, 101