Способ количественного определения аскорбиновой кислоты

(51) БРЕТЕНИ ПИОАНИ ИОЧУ СВИДЕТЕЛЬСТВ ИАВ(71) Институт питания АМН СССР(56) Руководство к лабораторнымнятиям по биологической химии.Медицина, 1976, с. 109-110.Методы оценки и контроля витаной обеспеченности населения.МОИП, 1984, с. 140-141.(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ(57) Изобретение относятсяводорастворимых витаминовопределения аскообиновой касаетслоты в елью изобретенияпособа, Способ вых про ется уп люч ает ся уктах., ощение нище явля а которого с помощью оуфер а устанавливают в диападобавляют избыток рее 2,о-дихлорфенолиндофееляют величину поглощего в водной среде при редственно после добавта, 2 ил ,1 табл. образцу, рН ного раствор зоне 3,8-4,5 агента в вид иола н ойрец ния последне 540 нм непос аМ.: ния реаге ОСУДАРСТБЕННЫИ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ом, что к испытуемому1442912 наблюдается 50 -ное разрушение в течение 10 мин.На фиг.2 представлена зависимостьстепени разложения 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия от рН среды приразличных интервалах времени. На практике время от момента добавления фенолята до момента колориметрирования, как правило, составляет 2-3 мин.Интервал времени, равный 1 мин, обычно соблюдается редко.Как видно из приведенных данных,при рН в области 3,8-4,5 реактивТилманса при выдерживании пробы в течение 2-3 мин разлагается от 0,5до 1,5 . При рН ниже 3,8 скоростьразложения фенолята значительно увеличивается, Следовательно, в выбранном интервале рН ошибка определенияне превысит 1,5% при условии, есликолориметрирование пробы осуществлять непосредственно после добавленияреактива Тилманса,Таким образом, существенным впредлагаемом способе является выборрН, смещенный в более нейтральнуюобласть, при котором замедляется разложение фенолята, а аскорбиновая кислота устойчива и может быть легко дезактивирована формалином для определения редуцирующих веществ, а такжевыбор водной среды, улучшающий условия проведения айализа. Проведениеанализа в этой среде исключает необходимость экстракции ксилолом, врезультате чего отсутствует ошибкаопределения, связанная с неполнымэкстрагированием фенолята ксилолом.Для осуществления анализа к исследуемому экстракту в З -ной метафосфорной кислоте или в 2%-ной солянойкислоте добавляют буфер, в количестве, необходимом для доведения рН дозначения, входящего в выбранный интервал рН. Измеряют оптическую плотность полученного раствора после добавления избытка фенолята при 540 нм.В качестве контрольного (кювета сравнения) используют раствор, содержащий вместо фенолята равное ему пообъему количество дистиллированнойводы. Содержание аскорбиновой кислоты в пробе определяют по формуле При рН выше 4,5 разложение фенолята незначительно, а при рН 7,2 не наблюдается совсем, однако в этих условиях измерение проводить нельзя Из-за невозможности определения редуцирующих примесей и малой устойчивости аскорбиновой кислоты. При рН 4,5 связывание аскорбиновой кислоты формалином становится неполным, что вносит ошибку в определение истинного содержания витамийа С. Кроме того, при рН более 7 начинает проявляться склонность аскорбиновой кислотык окислению: при рН 7 витамин С разлагается на 1,7 за 1 ч, при рН 8 Изобретение относится к химии водорастворимых витаминов и касаетсяопределения аскорбиновой кислоты впищевых продуктах.5Цель изобретения - упрощение способаа.Способ заключается в следующем.При определении аскорбиновой кислоты, предусматривающем добавлениек исследуемому экстракту избытка 2,6 дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ илиреактив Тилманса) и измерение поглощения последнего, величину поглощения 2,6-ДХФИФ определяют в водномэкстракте при рН 3,8-4,5 и длине волны 540 нм,Метод прост, имеет высокую чувствительность (предел обнаружения аскорбиновой кислоты5 мкг), позволяет . 20сократить время анализа до 10-15 мин.Пригоден для анализа окрашенныхи неокрашенных продуктов.Выбор условий анализа основан наисследовании стабильности 2,6-ДХФИФ 25при различных рН. Как видно из фиг.1,при рН ниже 3,8 скорость обесцвечивания реактива Тилманса возрастает,что делает метод колориметрическогоопределения мало пригодным. 30При рН в интервале 3,8-4,5 2,6 ДХФИФ разлагается достаточно медленно,что дает воэможность осуществлятьего колориметрическое определение.При наличии редуцирующих примесей,взаимодействующих с 2,6-ДХФИФ, интервал рН 3,8-4,5 также пригоден дляопределения аскорбиновой кислоты, поскольку в этих условиях аскорбиновуюкислоту можно дезактивизировать обработкой формалином и определить количество фенолята, прореагировавшего средуктонами. тп(Р - О) Ч 100Х мг . = ( П ) 1(1,где Э - величина поглощения. фенолята в растворителе;1442912 П, - величина поглощения фенолята в исследуемом растворе;Л - величина поглощения феноля 2та в растворе стандарта;щ - количество аскорбиновойкислоты в пробе стандартного раствора, мг;Ч, - общий объем экстракта, мп;Ч - объем экстракта, взятый наопр едел ени е, мп;навеска или объем пробы,г (мл) 1100 - пересчет на 100 г (мп) продукта.При анализе во все пробы добавляют одинаковое количество фенолята и ацетатного буфера (рН 4,5), количество растворителя в стандартном и исследуемом растворах таково, что общий объем проб одинаков.Дпя учета редуцирующих примесей к пробе, содержащей экстракт, после добавления буфера приливают формалин в количестве, равном 1/4 полученного объема, Через 1 О мин добавляют установленное количество Фенолята и определяют поглощение при 540 нм против соответствующего раствора, содержащего вместо фенолята равное ему по объему количество воды. Количество аскорбиновой кислоты определяют по формуле 35 40 .цессе экстракции. 45Ф5055 т(П Ч- Чай, )Чь 100где П - величина поглощения фенолята3в пробе для определения редуцирующих примесей;Ч - объем .пробы для определения3редуцирующих примесей последобавления фенолята, мп;Ч 4 - объем остальных проб последобавления Фенолята, мл.Пример 1: рН 3,8.10 мп витаминизированного морковного сока разбавляют 2 .-ной солянойкислотой до 100 мп, раствор Фильтруют25 мл полученного экстракта повторноразбавляют 2 -ной соляной кислотойдо 100 мл,Готовят четыре пробы:1) 5 мл 2%-ной соляной кислоты +5 мп ацетатного буфера, рН 4,5(49,75 г трехводного ацетата натрия +70 мл воды + 150 мп ледяной уксуснойкислоты) + 1,5 мл фенолята (0,2 г Фе-,нолята в 500 мл воды); 5 10 15 20 25 30 2) О, 5 ст андартного р аств ор а аскорбиновой кислоты ( 1 мкг/мл) + + 4,5 мп 2 .-ной соляной кислоты + 5 мп ацетатного буфера + 1,5 мл фенолята;3) 5 мл полученного экстракта + + 5 мл ацетатного буфера + 1,5 мл фенолята;4) 5 мл полученного экстракта + + 5 мл ацетатного буфера + 2,5 мп Формалина, через 10 мин добавляют 1,5 мл фенолята,Определяют величину поглощения указанных растворов на колориметре КФКпри 540 нм. В качестве растворов сравнения используют соответствующие растворы (1-4) с добавлением вместо фенолята равного объема дистиллированной воды, Содержание аскорбиновой кислоты, определенное по формуле (2)(среднее иэ двух определений), составляет 54,5 мгРезультаты определения аскорбиновой кислоты колориметрическим методом методом индофенол-ксилольной экстракции (известный способ) и прямым титрованием (общепринятыи метод анализа) представлены в таблице. Как видно из таблицы, метод удобен для анапиза как окрашенных, так и неокрашенных продуктов. Более высокие значения концентрации аскорбиновой кислоты, полученные колориметрическим методом, по сравнению со значениями для индофенол-ксилольной экстракции связаны с частичным удерживанием фенолята водным раствором в проП р и м е р 2.(известный). Готовят экстракт витаминизированного морковного сока в 3%-ной метафосфорной кислоте аналогично примеру 1. В 4 колбы с притертыми пробками добавляют по 5 мп ацетатного буфера, рН 4,0 (49,75 г тригидрата ацетата натрия + + 70 мп воды + 225 мп уксусной кислоты). В первую колбу добавляют 5 мл экстракта,во вторую 5 мп З -ной метафосфорной кислоты, в третью 0,5 мп стандартного раствора аскорбиновой кислоты (1 мкг/мп) и 4,5 мл 3%- ной метафосфорной кислоты, в четвертую 5 мл экстракта и 2,5 мл формалина. В колбы 1-3 добавляют 1,5 мп фенолята, в колбу 4 - фенолят добав" ляют через 10 мин.1442912 в 0 - и, ч, 100 (В - П) Ч И составляет 46,3 мг%,П р и м е р 3. рН 4,5.Экстракт витаминизированного морковного сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2, используя 1,5 мл ацетатного буфера с рН 5,5 (30 г трехводного ацетата натрия + + 70 мл воды + 15 мл ледяной уксусной кислоты). Определяют поглощение водных растворов при 540 нм. Содержание аскорбиновой кислоты в , 54,4 мг%П р и м е р 4. рН 3,4.Экстракт витаминизированного морковного сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 1, используя по 3,5 мл ацетатного буфера с рН 4,5 (см.выше). Содержание аскорбиновой кислоты - 54,00 мг%.П р и м е р 5. рН 5,0.Экстракт витаминизированного морковного сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2, иснользуя,по 2,0 мл ацетатного буфера с рН 5,5 (приготовление буфера по примеру 3). Содержание аскорбиновой кислоты - 53,90 мг%.1П р и м е р 6. рН 4,2.Экстракт витаминизированного морковного. сока и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2, используя 10 мл буфера с рН 52 (100 мп 1,0 М соляной кислоты + 500 мл 1,0 М ацетата натрия + дистиллированной воды до 2,5 л). Содержание аскорбиновой кислоты, определенное аналогично примеру 1, - 54,40 мг%.П р и м е р 7. Экстракт и 4 пробы для анализа готовят аналогично примеру 2. Как до, так и после добавления фенолята растворы остаются мутными и прямое колориметрированиеневозможно (рН 3,6).П р и м е р 8. К смеси, состоящей из 0,5 мл витаминизированного газированного напитка "Саяны" (после дегазации пробы) и 4,5 мл солянокислого буфера (пример 6:), добавляют 20 Содержимое энергично встряхивают, приливают по 25 мп ксилола и снова встряхивают. Дают отстояться в темноте 20 мин. Измеряют оптическую плотность слоя ксилола при 490 нм, Содержание аскорбиновой кислоты, определенное по формуле 0,5 мл реактива Тилманса и определяют величину поглощения Л ) используя)в качестве кюветы сравнения раствор,содержащий 0,5 мл напитка, 4,5 млбуфера и 1 мл дистиллированной воды.Аналогично определяют величину поглощения 0,5 мл реактива Тилманса всмеси, состоящей из 4,5 мл буфера и 1 О 0,5 мл дистиллированной воды (0).Содержание аскорбиновой кислоты вмг/л напитка определяют по формуле х 0 225 Р -в, 1 ооо - 450(л-в,) + 15где 0)225 - коэффициент, найденныйэкспериментально и соответствующий величинем/(О Формулы, приведенной в примере 2;0,5 - величина пробы напитка,взятой на анализ, мл;1000 - коэффициент, учитывающийперевод на 1 л напитка.При сравнении определения аскорбиновой кислоты в витаминизированныхгазированных напитках методами колориметрического анализа и визуальноготитрования получено хорошее совпаде 30 ние результатов, мг/л; колориметрирование 121,50; 130,39; 113,40; 128,70;119,84; 117)60 титрование 121,98;129,47; 113,42; 126,26; 121)5; 113,42соответственно,Анализ газированных напитков нетребует осуществления стадии экстракции и определения редуцирующих примесей из-за их отсутствия. Это обеспечивает существенное упрощение анали 40 за: повышает чувствительность метода-.в 2,раза (2)5 мкг по сравнению с5 мкг), так как исключает дополнительное разведение пробы, при этомпроведение анализа ускоряется приб 45 лиэительно в 3 раза по сравнению сметодом визуального титрования, делая реальным осуществление автоматизации процесса,Таким образом, как видно из приме 50 ров 1,3 и 6, колориметрический методанализа аскорбиновой кислоты даетпрактически одинаковые результатыпри рН в области 3,8-4,5. При рН ниже 3,8 наблюдается некоторое занижение результата,(пример 4). При рН5,0 (пример 5) результаты также отличаются от результатов в интервале3,8-4,5. Как видно из примера 7,условия метода индофенол-ксилольной14429 Метод Продукт анализ а Колориметри- ческий Аскорбиновая кислота, мг% 6,03 5,60 Черная смородина 460,0 Определениюмешают при"родные пигменты 486,0 Витаминизированный томатный сок 94,60 89,40 94,60 Витаминизированный яблочноморковный 44 ю 04 45 ф 60 48,00 сок Витаминизированный мор ковный сок 52,80 46,30 54,50 экстракции непригодны для прямогоколориметрирования из-за мутностиводной фазы. Пример 6 иллюстрируеттакже возможность использования ванализе других буферных систем. Метод индофенол-ксилольной экстракции(пример 2) сложнее предлагаемогоспособа и дает заниженные результаты. Формула изобретенияСпособ количественного определения аскорбиновой кислоты, предусматриваю щий приготовление испытуемого образКартофельныехлопья длительного хранения 6,20 12 8ца, добавление к нему реагента в виде 2,6-дихлорфенолиндофенола, определение величины поглощения образца с последующим пересчетом полученных результатов по количеству восстановленного аскорбиновой кислотой реагента, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, перед добавлением реагента устанавливают рН образца буферным раствором до 3,8-4,5, при этом определение величины поглощения ведут в области 540 нм непосредственно после добавления реагент а.М Индофенол- Титр ованияксилольной (метод Тилэкстракции манса)Фиг 2 Сост авитель Техред Л.С. Мине ев аюкова Корректор М.Шароюи актор Е:Папп Заказ 6378/4Тираж 847 В 11 ИИПИ Государстве по делам изобре 13035, Москва, Ж, Подписноеного комитета СССРений и открьтийРаушская наб., д, 4/5 ф 1 нии 2 нин 9 нцн