Модифицированная 4-

сследователь ургии и ф Белорусский ий институт неврологии,иотерапии . Заявитель МОДИФИЦИРОВАННАЯ 4-(4-АМИНОА НИЛИНО) -5-МЕТОКСИ -1,2-БЕНЗОХИНОНОМ СЕФАРОЗА В КАЧЕСТВЕ АФФИННОГО ХРОМ АТОГРА ФИЧЕСКОГО СОРБЕНТА МЕНАДИОНРЕДУКТА(54 ств кач МНПс-Н- В 1 Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к эксперименталь ной и аналитической биохимии, в частности к новому химическому соединениюмодифипированной 4-(4-А мино-анющно)- 5-метокси,2-бензохиноном сефарозе.Данное соединение проявляет свойа, позволяющие использовать его вестве аффинного хроматографическогосор 15 ента менадионредуктазы НАД(Ф) Н: акпептор оксидоредуктазы (КФ 1.6.99.2) и может быть применено для быстрого . выделения или очистки данного фермента, а также для изучения свойств фермента в условиях гетерофазной системы,Известен ряд соединений на основе производных агарозы (сефарозы), которые используются в качестве аффинных хроматографических сорбентов для выделения и очистки различных ферментов.Известен ряд соединений общей фор-,где Р - остаток сефарозы,"ЬЪ - Мьсь%1 - сьнв )иО =1-окоторые получают посредством конденсации алифатических или ароматическихаминов с В О 4-активированной сефаразой4 В, применяемых в качестве аффинныхсорбентов гликозидаз 2.Опако, вышеуказанные соединенияиспользуются в качестве аффинных сорбентов для выделения ферментов лищьопределенного класса и не могут бытьиспользованы как аффинные хроматографические сорбенты менадионредуктазыАффинные хроматографические сорбенты для выделения и очистки менадионредуктазы в литературе не описаны.Цель изобретения - расширение ассортимента аффшных хроматографических сорбентов для выделения и очисткиферментов, получение аффинного сорбента менадионредуктазы, специфически связывающего этот фермент, и обеспечивающего такимобразом возможность быстрого получения3 82 очищенного фермента с высоким выходомиэ исходных неочищенных препаратов.Поставленная цель достигается свойствами модифицированной 4-(4-аминоанилино) -5- метокси 1,2-бензохиноном сефароэы общей формулыгде Р востаток сефарозы.На фиг, 1 представлена схема синтезамодифицированной 4-(4- аминоанилино)5-метокси,2-бензохиноном сефароэы,на фиг. 2 - .аффинная хроматографияменадионредуктаэы, на фиг. 3 - анализметодом диск-электрофореэа в полиакри"ламидном геле препаратов менадионре- дуктаэы опыта, показанного на фиг. 26Опыть (см. фиг, 1 и 2) выполнены наколонке с объемом сорбента 2,6 мл при20 фС, скорость прохождения растворовчерез колонку 0,3-0,4 мл/мин. Пунктирной линией показан белок и сплошной -содержание менадионредуктазы.А. Сорбент ОЧ). 1 - неочищенныйпрепарат менадионредуктазы, 2,2 мгбелка с удельной активностью4,2 мкмольУ(мин мг), 1,15 М фосфатныйбуфер,рН 7 5 с 0,5 М ЯС 6; 2-1/15 Мфосфатный буфер, рН 6,0,"0,5 МйаС 3;3-12 мМ НАДФН,; 1/15 М фосфатныйбуфер, рН 6,0; 0,5 МНаС 8, 4-10 мМНАДфН, 1/15 М фосфатный буфер, рН60 0,5 МКаС 3.Б,Сорбент (М ).1 - неочищенныйпрепарат менадионредуктазы, 17,8 мг .белка с удельной активностью,1,2 мкмоль/(мин мг); 1,15 М фосфатныйбуфер, рН 7,5; 0,6 МйаСС; 2-10 мМНАдфН, 1/15 М фосфатный буфер,рН 6,9; 0,6 М%С 8А и Б - неочищенный исходный препарат менадионредуктазы (см. фиг, 3);В и Г - препарат после хроматографиина сорбенте (УН ),М - положение менадионредуктаэы.Предлагаемое соединение получаютна основе СКВ - активированной сефарозы 4 В и активированной СН - сефарозы4 В 33путем нижеуказанных превращений (см. фиг. 1), где соединения (1)и (У) нредставляют соответственноСКВ- активированную сефарозу 4 В иактивированную СН - сефарозу 4 В, авертикальная черта обозначает полимерную матрицу сефарозы.. Как вытекает из схемы, синтез нового соединения проводят в несколькоэтапов. Реакции присоединения первичного амина к активированной сефарозе 5проводят известным способом ь 11, получение анилино-производных 4,5-диметокси,2-бензохинона (реакции (2) и (4также осуществляют известным путем 4,Модифицированные 4-(4-аминоани лино) -5-метокси,2-бензохи ионом сефарозы несут ковалентйо связанную струк"туру 4-анилино-метокси,2-6 ензохинона, который является субстратомменадионредуктазы. Этот хинон специфи чески взаимодействует с менвдионредуктазой с образованием фермент-суб .-.страктного комплекса, что обеспечивает высокую селективность извлече .ния фермента из смеси белков, Балласт ные белки несорбируются на этом сорбенте и выходят из хроматографическойколонки. Таким образом, модифицированная, сефароэа представляет собой аффинный сорбент менадионредуктазы, приме нение которого позволяет выделить менадионредуктаэу изсмеси белков и обеспечить высокий выход фермента.Н р и м е р 1. Модификация СМВ 2- активированной сефарозы 4 В.а) 3 г СМВ -активированной сефарозы,4 В подвергают набуханию в 1 мМ НС 8,Суспензию промывают 600 мл 1 мМ НС 1и 50 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,0,содержащего 0,5 ММаС 6 на стеклянномфильтре под вакуумом, создаваемымводоструйным насосом. Сефарозу переносятв колбу, содержащую 20 мл 0,13 М-фенилендиамина, растворенного в бораъ ном буфере Суспензию выдерживают 145 мин в условиях осторожного перемещения при 23 оС после чего переносятна фильтр и промывают 600 мл Н О 4600 мл0,5 М раствора И 4 СО и боратном буфере, рН 8,0.Промытая.сефароза имеет белый цвет слегким синеватым оттенком.б) К обработанной сефарозе добавляют21 мл 18 мМ 4,5-диметокси,2-бензо, хинона, приготовленного на боратном 50буфере (0,1 М, рН 8,0), Суспензию выдерживают при помешивании 1 ч 40 мнн,после чего промывают 500 мл воды,50 мл боратного буфера и 150 мл фосфатного буфера 0,07 М, рН 7,5, содержащего в растворе 0,5 МИцС 3, Промытыйпродукт в массе обладает краснофиолетовой окраской, у которого в электронномспектре обнаруживается типичный максимум аминохинона при 510 нм. В присут5 825543, 6 ствии восстановителей, (тетраборгидрида Сорбент, приготовленный, как описан натрия и др.) максимум исчезает. Про- выше, упаковывают в колонку высотой дукт при добавлении восстановителей около 2,4 см, Нв колонку наносят в обесцвечивается. После отмывки восста- объеме 0,5-1 мл исходный раствор, неновителя при.: .стоянии на воздухе про- очищенного фермента-менвдионредуктадукт восстанавливает свою краснофио-зы, (оствльные условия хроматографии-.5летовую окраску и максимум в видимой см фиг 2). области спектра. Все эти свойства при- Элюат, т.е. раствор, прошедший через сущи автооксидабельным дифенолам и их колонку, собирают фракциями в объеме амиыохинону, чтополностьюсоответствует 1-2 мл, как это показано на гистограм 1 Оуказанному в описании результату моди- мвх фиг. 2. Во всех фракциях определяют фикации. белок и испытывают на активность менаПродукт модификации сефарозы, полу- дионредуктазы. Результаты изложены в ченный по (в) и (б). обеспечивается пояснении к фиг. 2 и 3 и таблице. также в присутствии менвдионредук 15Как видно из эксперимента, связыватазы и НАДН (восстановленного никоти- вне менвдионредуктаэы с сорбентомнвмидаденнуклеотида) . Последний не .вос- высоко специфично. Балластные белки станавливает аминохиноны в отсутствие появляются вслед за свободным объемом менвдионредуктазы. Таким образом,колойки. Менвдионредуктвза остается на образование аминохинона указывает свЯзанной с сорбентом н ее элюиРУют.20также высокоспецифическая ферментативнчя добавлением другого субстрата - ЦАДФН.реакция. Таким образом, модифицированныеМодификация активированной СН с сефарозы удерживают менвдионредуктвзу, фароэы 4 В, но не связывают другие примеси. Наа) 2,2 г активированной СН сефв ,пример, в опыте, показанном на фиг. 2 4 В подвергают набухвнию и отмывке, . до введении НАДФН, вызывающего спе-,Хкак было описано выше для СЯВ -акти- цифическую десорбцию менвдионронредуктавироввнной сефарозы 4 В. зы, через колонку объемом 2,6 мл былоСефарозу вс ря ваю на протя енин пропущено 50 мл Разных Ра 9 творов. По ч при 25 С с 15 мл 0,09 М раствора следние отличались разным значениемой-фенилендиамина в боратном буфере, РН и высоким содержанием МЮССЕ, При РН 8,0. После этого производят отмывку такой обработке колонки вымывают все получившегося продукта 400 мл Н О белки, не обладающие способностью афи 50 мл боратного буфера. Огмытый финного связывания с сорбентом. продукт имеет белый цвет с легким35На фиг. 3 приведен пример электросиневатым оттенком, форетического анализа исходного, необ) К продукту, полученному по и. а чищенного препарата менвдионредуктвзы добавляют 11 мл 18 мМ раствора 4,5- и фермента после хроматографии на сордиметокси,2-бензохинона в боратном бенте (Чц ). Как видно из этого прибуфере, РН 8,0, Суспензию встряхивают 4 О меРа, происходит одномоментная очисткао1 ч 30 мин при 25 С, после чего от- . Фермента иэ сложной смеси белков до мыввют на стеклянном фильтре 500 мл двух белковых фракций. Аналогичные НО. К продукту добавляют 0,05 М трис- Резуль 1 вты получены для сорбента (1 Ч ). буфер, РН 8,0 и выдерживают при В таблице даны количественные встряхивании 2 ч. Производят отмывку .4 результаты хроматографии менадионреду.ь продукта дистиллированной водой, 400 мл тазы, из котоРых видно, что фермент Получившийся продукт обладает красно- повышает свою активность в 102 раза фиолетовой окраской. Его спектральные и выход его составляет 83 .%. характеристики идентичны таковым дляПриведенные выше примеры в совопродукта модификации СНВ - вктивироввннойО купность характеризуют высокую сорбционсефарозы 4 В. Продукт обесцвечивается ю, специфичность модифицированных при восстановлении, в том числе и при 4(4-аминоанилино)-5-метокси,2- .специфическом ферментвтивном восста- бензохиноном сефароз и;, доказывают новлении, как было описано выше. Окрас-аффинную природХ связывания менвдионка восстанавливается до исходной приРедукт зы с этими сорбентами. Приме- стоянии на воздухе, некие предлагаемых выше модифицированеиых сорбентов обеспечивает быстрое, одноП р и м е р 2, Аффиннвя хроматогра- этапное получение очищенного фермента фия менадионредуктаэы. с высоким его выходом.825543 ВНИИПИ Закаэ 257/8 Тараж 530 Подписное иал ППП "Патентф,род,ул.Проектная, 4