Способ получения сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов

САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ПАТЕН Яф 30ь де Вало) (Г 11)р, Клод Кансьер Миш(57) И ЛУЧЕНИЯ СОПРЯЖЕНННХ ТЕНОВ И МУРАМИЛПЕПТ зобр птид ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Ажанс Насьоналде ля Решерш ( АНВАР(56) Шредер. Э.,ЛюбМир, 1967, ч.1, с. ение касается производв частности сопряженного соединения гаптена и мурамилпептида формулы: М-ацетилмурамил-аланил-изоглютаминил.-лизил1.Н-ВН 1 (СГМ),которое обладает биологической активностью и может бытьиспользовано в медицине. Цельсоздание активных веществ указанного класса. Синтез СГМ ведут иэ гормона 1.Н-ВН в кислой форме и М-ацетилмурамилаланил-изоглютаминил-лизина при массовом соотношении 1:1,в водно-формамидной среде карбодиимидным методом в присутствии 1-оксибензотриазола. Выделение СГМ ведут спомощью молекулярного сита. Испытания СГМ показывают, что оно обладает высокой иммуногенной активностьюна уровне соответствующего мурамилтрипептида, но при этом проявляет более низкую пирогенность. 2 табл.10 16 20 2 с 30 ЗЬ 40 4550 55 1 133Изобретение относится к способуполучения новых сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидовбиологически активных соединений,которые могут найти применение в медицине.Цель изобретения - способ получения новых сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов, обладающихиммуногенной активностью с низкой пирогенностью.Синтез (НН)-МТР,3 мг .Н-ВН, взятого в кислой форме, добавляют к 242 мг хлоргидрата1й-эч ил-й - (3-метиламинпропил) -карбодиимида (ЕСО 1) и к 43 мг 1-оксибенэотриазола (НОВТ), используя вкачестве среды 0,4 мл диметилформамида (ОМГ).Инкубацию проводят примагнитном перемешивании в течение7 ч при температуре окружающей среды.Затем к этому раствору прибавляют3,24 мг МТР (М-ацетилмурамилаланил-О-изоглютаминил-.-лизин),смешанного с 0,3 мл дистиллированнойводы, и оставляют полученную смесьдля продолжения реакции при магнитном перемешивании в течение 48 ч притемпературе окружающей среды. Продукты реакции растворяют в 0,15 Мрастворе МаС и рекуперируют образовавшиеся сопряженные соединения путем фракционирования через молекулярное сито 5 ерЬадех С 10. Сопряженные соединения вымывают в мертвомобъеме. Определяют содержание пептидов в мураминовой кислоте. Обнаружено, что 937. МТР вступило в реакциюсочетания: число молекул МТР относится к числу молекул Н-РН как примерно 1:1.Синтез сопряженного соединенияМТР - тетанический (столбнячный) токсин (выполнен в качестве сравнительного примера).Смешивают 16 мг МТР, 0,15 мл ОМГ,более 0,01 мл РВ 5 с рН 7,4 (солянойраствор, тампонированный фосфатом ),затем 300 г ЕСО 1, 1 мг НОВТ и 2 мграствора тетанического токсина.Смесь оставляют для протекания реакции на 15 мин при магнитном перемешивании и при температуре окружающейсреды в темноте. Затем прибавляют кэтой смеси 300 1,г ЕСО 1, 1 мг НОВТи 2 мг тетанического токсина; реакция идет еще в течение 15 мин. Этуоперации повторяют 9 раз, Затем 14332констатируют, что 20 мг тетанического токсина было использовано. По окончании реакции рекуперируют сопряженное соединение путем хроматографии на колонке 5 ер 1 адех 075 в РВ 5.Сопряженное соединение содержится вверхней точке промывки, Соответствующие определения тетанического токсинаи МТР осуществлялись по методике Го 11 п и йезз 9.Иммунизация .Н-ВН,соединенным смурамилпептидом и введенным в соляной раствор или добавку (Г 1 А).На 1,2,4 и 29-й день вводят подкожно 0,1 мл следующего растворагруппе мьппей-самцов 5 и 5, имеющимвозраст 6 недель:1) 50 р г Н-ЙН, эмульгированного в добавке соп 1 р 1 ей се Ггецпд;2) 50 рг Н-ВН, эмульгированногов ГА;3) 8,6 рг Н-ВН, сопряженного с4,3г МОР и эмульгированного вГА;4) 50 р г Н-РН в РВ 5;5) 8,6 р г .Н-ВН, сопряженного с 4,3 р г МОР в РВ 5.Трем дополнительным группам мышей, взятых для сравнения, вводят аналогично либо ГСА,либо Г 1 А, либо РВ 5,не содержащие ни антигена, ни МОР,Перед использованием антиген(.Н-ВН чистый или подвергнутый сочетании ) был адсорбирован на 507.-ном РУР (поливинилпирролидоне ) в 0,9 Х МаС 1, а инкубация осуществлялась в течение 2 ч; затем смесь подвергали эмульгированию с ГА или ГСА, или добавлялись к РВ 5.0,1 мл соединения, содержащего 12,57,-ный РУР, вводили подкожно мышам.На 23 и 50-й день все мьппи были здоровы, их умерщвлили, а их сыворотку собрали и объединили по группам. Семенники мышей и семенные пузырьки анализировались, взвешивались, после чего их поместили в раствор Вои и приготовили для гистологического изучения.Обнаружение антител анти-(.Н-ВН). Антитела анти- Н-КН) обнаруживают следующим образом. Вводят 50л сыворотки, нерастворенной перед тестированием, 50 л нормальной сыворотки зайца, растворенной на 1/80-ю в13314 3РВ 5, и 10 л (.Н-ВН),помеченного йодом 125 приблизительно 1 О ООО распадок в минуту: бра). ИНкубация протекала в течение 72 ч при 4 С. Затем добавляли 150 р .; суспенэии, охлажденной на льду, активного угля, покрытого декстраном (полученной при добавлении 250 мг активного угля в 100 мл раствора декстрана в 0,01 М растворе РВ 5). Смесь оставляют при О о4 С в течение 5 мин. После центрифугирования, осуществляемого при 2500 об /мин в течение 20 мин, вещество, оказавшееся на поверхности смеси, декантируют и определяют его 5 радиоактивность по методу Хабер. Предварительное изучение показывает, что уголь, покрытый декстраном, может адсорбировать до 95 -ного (1.Н-Вн) чистого в указанных условиях. 20Обнаружение антител анти-МТР.Контролируют присутствие антител анти-ЧТР с помощью гемолитического теста, осуществляемого на пластинах микродозирующих, имеющих углубления в виде у (сосете Епдепег 1 пц), следующим образом: сыворотку разрушают путем инактивации в течение 30 мин при 56 С. 50 р л сыворотки, прошедшей двойное разбавление, смешивают с ЗО 50 с л РВ 5. Затем в смесь вводят 20г сопряженного соединения све жие кровяные шарики-МТР, имеющего концентрацию 2,5 , оставляют смесь для инкубации на пластинах при 37 С35о в течение 15 мин: наконец вводят 20 л добавления нормальной сыворотки морской свинки, разбавленной с РВ 5 до соотношения 1:20 и снова оставляют эту смесь для инкубации при 37 С в течение 30 мин перед тем, как заметить результаты.Оценка пирогенности.Опыты осуществлялись на новозеландских кроликах весом от 2,5 до 2,8 кг. Значения температуры определялись с помощью зонда с термистором, вводимого в прямую кишку кроликов на глубину примерно 8 см и соединенного с термометром модель Ф ТЕЗ, Копенгаген, Дания . Кролики содержались и наблюдались в климатической камере при 20 С. Инъекции вводились только тем животным, температура которых оставалась стабильной в течение предшествующих 30 мин. Значения температуры определялись в течение 3 ч после инжектирования композиции, пи Та блица Обработка 30,5 1.Н-ВН 50г + ССА Н-Рн 50 г + Г 1 А Н-Кн 50 г + РВ 5 2,5 10(.Н-КН) -МТР г + РВ 5 63 При отсутствии антигена не замечают никакой фиксации в сыворотке сравниваемых животных, получивших инъекцию ГСА, Г 1 А или РВ 5 (измеренная фиксация) по максимуму 2,3(не является показательной 1. Однако антитела образовались, когда испольэовали змульгированный в ГСА 50 р г(1.Н-Вн) (30,5% фиксирования ), Не отмечают показательного результата вгруппе животных, получивших 50 Р г(н-КН) в ГА (фиксация 2,5% , слабый результат, полученный при использовании РВ 5 (10 ),не имеет смысла. Значительный результат полученпри исследовании сыворотки, полученной от животных, иммунизированныхсопряжением соединения МТР-(н-ЙН)несмотря на то, что это соединениесодержит только 8,6 и г (1.Н-ВН) и4,4 1 г МТР. Действие антител дажеповышено, когда равное количествосопряженного соединения МТР-(Н-ЙН)введено в водной среде. Эти результаты указывают на то, что сопряженные соединения МТР-(1.Н-РН) являютсяоба более эффективными, чем соединение (н-Вн) с РСА, как и с Г 1 А, таки с РВ 5. 33 4рогенность которой изучалась. Результаты выражались по среднему измене нию температуры (С), полученному у кролика в течение 3 ч после внутривенного введения изучаемой композиции. Минимальная доза пирогенная соответствует количеству, вызывающему повышение температуры на 0,6 С.Опыты по иммунизации.Результаты, указанные в табл.1, выражают отношение числа ударов в минуту (срм) поверхностного вещества к числу срм общему и умноженному на 00.,3,0,3, 0 0,1, О,О,14 0,4-0,2 О,5 3Гистологический анализ.Средний вес семенников несколькоповысился ( от 252 до 279 мг) в ре -зультате введения животным от 5 до50 ,мг (ИН) в РВ 5. Хотя это повышение показательно (р 0,05), оно несвязано с никаким гистологическим изменением. Наоборот то же количествоантигенов, внеденных в РСА, вызываетсущественное увеличение веса семенников при снижении выработки спермЫи атрофии семенных каналон в некоторых случаях. И наоборот, у животных,получивших сопряженное соединениеМТР-(1.Н-ВН) взятое в растворе в РВ 5,вес семенников более низкий (р 0,01)чем у животных из других групп. Более того гистологический анализ семенников показал, что только в этойгруппе животных наблюдают атрофию,отметившую сразу интерстициальныеклетки и семенные каналы, которыебыли практически лишены герминатинных клеток, что отмечено у 9 мьппейиз 10,Определение антител анти-МТР.Те же сыворотки объединили, чтобыли использованы при определенииактивности к фиксированию .125 1 .Н-йНтакже были изучены по содержанию антител анти-МТР с помощью гемолитического теста с сопряженными соединениями красных кровяных шарикови МТР. Сыворотка кролика анти-МТР,полученная после гипериммунизации,осуществленной с сопряженным соединением альфа-метиловый сложный эфирМТР и сыворотка альбуминная быка,использовалась н качестве сравнительного антигена. Тогда как констатируя реакции гемолиза н сывороткеанти-МТР кролика до конечного растворения 1:30.720, не отмечают никакихантител анти-МТР ни в одной группеживотных, обработанных сопряженнымсоединением МТР-(.Н-ВН),Обнаружение возможной пирогенности изучаемых сопряженных соединенийсо сравниваемыми молекулами.10 Результаты, приведенные н табл,2,указывают на отсутствие пирогенностиу предлагаемых соединений по сравнению с пирогенностью либо самого мурамилпептида, когда он находится ввыделенном состоянии, либо сопряженного соединения, которое тот жемурамилпептид может образовать с естестненным антигеном, например с тетаническим токсином. Сопряженное20 предлагаемое соединение Н-ВН)-МТРне вызывает значительного повьпдения температуры у животного, даже когдаотносительная доза МТР в сопряженномсоединении составляет примерно9,3г МТР. Эти результаты сравнимы с результатами, полученными втех же условиях при использованиисравнительных сопряженных соединений(ТТ-МТР), вызывающих значительное повьпдение температуры, даже когда относительное содержание МТР в сопряженном соединении, введенном животному, н 100 раз ниже, чем количествопредлагаемого соединения.35 Кроме того, более высокие дозысопряженного соединения (Н-РН)-МТР,включающего относительное количество н 77г МТР, не вызывает у животного отмеченного повьппения темпера 40 туры,331433 Продолжение табл.2 0,1 О, 0,20,1, 0,1, 0,6 0,1, 0,3, 0,7 0,2 0,4 0,3 0,3 1,2 1,1, 1,3 86 МТР Знак "" относится к сочетанию в исследуемых сопряженныхсоединениях между относительными дозами в этихсопряженных соединениях, с одной стороны,с гормоном, ас другой стороны, с МТР. Составитель В.ВолковаРедактор А.Долинич Техред М.Ходанич Корректор С.Черни Заказ 3596/58 Тираж 347ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 1,2 0,63,4,-1,817,2;9,386-46 Полученные результаты свидетельствуют о низкой пирогенности полученного предлагаемым способом сопряженного соединения гаптена с мурамилпептидом: 1.Н-КН 1-й-ацетилмурамил.- аланил-О-изоглютаминил.-лиэил. Формула изобретенияСпособ получения сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов общей формулы: М-ацетилмурамил.аланил-О-иэоглютаминиллиэил1 Н-РН 1, заключающийся в том, что 25гормон НН в кислой форме вводятво взаимодействие с Й-ацетилмурамил 1.-аланил-О-иэоглютаминиллизиломпри массовом соотношении 1:1 в водно-формамидной среде карбодиимидньиметодом в присутствии 1-оксибенэотриаэола с последующим выделениемцелевого продукта на молекулярном