Способ получения тафцина

Сеюэ СоветсиикСоциалистическиаРеспублик. ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ иц 891647ьеударстеанлыа квинтет ьССР дю делам лэаарвтеклй и открытка(71), Заявитель Ордена Ленина институт элементоорганических соедийенийАН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАФЦИНА Изобретение относится к получению. биологически активного тетрапептида - тафцина, который стимулирует фагоцитозную активность лейкоцитов крови н может найти применение в медицине,Известны способы получения тафцина с использованием твердофаэного и классического методов пептидного синтеза, также с использованием полимерных активированных эфиров 1) -3) .Наиболее близким к предлагаемому по тех 10 нической сущности является способ получения тафцина, основанный на основании полимерных активированных эфиров Й-защищенных а - аминокислот 4). Согласно этому методу нерастворимый полимерный алкилированный эфир 1, полученный иэ Й-защищенной аминокислоты и полимера активатора, коцпенсируют с эфиром а -аминокислоты, содержащим свободную и - аминогруппу Н. Образующийся при этом защищенный дипептид 1 Н переходит в раствор, а иэ быток непрореагировавшего полимерного активированного эфира Й-защищенной а-аминокис. лоты и полимер. активатор 1 Ч удаляют фильтрацией. После удаления Й.концевой аминозащитной группы дипептида операцию повторяютдо получения желаемого пептида с заданнойаминокислотной последовательностью ,1 Х - ЙН-СНй - СОО-Р+ НЙ-СНВ - СООУЦХ-ЙН-СНЙ-ВОЙН-СНЯ -СООУ + Р-ОНЩ ЪЧ где Х - аминозащитная группа;У - карбоксилзащитная группа;Р - полимер-активатор.Однако используемые в известном способе полимерные активированные эфиры на основе сополимера стирола с 2% днвинилбенэола явля. ются гидрофобными полимерами, т, е, практически не набухают в водной среде и практи. чески не реагируют с водорастворимыми аминокомпонентами, и, в частности, со свободным 1.-аргииином и пептидами, содержащими свободный 1. - аргинин, По этой причине синтез ведут в среде органического растворителя с использованием Й -защищенного эфира .аргинина.-О- НОгде 8 - остаток й-винилпипролидона;аЙ - 4,4 -диаминодифенилоксида;В - остаток стирола;1и процесс ведут в водной среде в интервалерН 8 - 10,Предлагаемый способ позволяет проводитьсинтез тафцина с использованием свободногоС-концевого Л-аргинина, что значительно упроИРет и удешевляет весь процесс, Использованиесвободного Л-аргинина позволяет исключитьстадию деблокирования конечного тетрапептидабезводным втористым водородом, Последнееобстоятельство имеет особенно большое значение для промышленного производства тафцина,так как фтористый водород является очень токсичным соештнением и работа с ним требуетспециального оборудования. Кроме того, заменаорганического растворителя на водную среду 45 50 55 Использование йф-защищенного эфира ар. гинина приводит к значительному увеличению себестоимости конечного продукта, и, создает большие трудности на стадии деблокирования защищенного конечного тетрапептида.Для полного удаления й - йО -защитнои6группы аргинина необходимо использовать без. водный фтористый водород, который является очень токсичным соединением, и для работы с которым необходимо специальное оборудование Щ, Кроме того, использование органических растворителей в качестве среды для синтеза также увеличивает себестоимость конечного продукта,Указанные недостатки приводят к усложнению процесса и повышению себестоимости конечного продукта и делают этот метод малопригодным для крупнотонного производства тафцина.Цель изобретения - упрощение способа получения тафцина.Поставленная цель достигается способом получения тафцина последовательным наращиванием пептидной. цепи в присутствии гидрофильных поли-й-оксисукцинимидных эфиров общей формулы где Х - трет,: бутоксикарбонилгруппа; Ф-РО - И 5 В-- таг.,35 20 25 30 35 40 дает большой экономический эффект и снижает пожароопасность всего процесса,Исходные поли. й- оксисукцинимидные эфиры й.защищенных а-аминокислот получают известным методом смешанных ангидридов из й-защищенной а-аминокислоты и поли- й-окси.сукцинимидного гидрофильного полимера-акти. ватора 61. В свою очередь полимер-активатор получают сцщванием диамином смеси сополимера малеинового ангидрида с й.винилпирролидоном и сополимера малеинового ан. гидрида со стиролом с последующей обработкой гидроксиламином 73П р и м е р 1. й-трет,-Бутилоксикарбонил- -пролил-аргинин.К раствору 2,26 г (13 ммоль) 1-аргининав 10 мл воды прибавляют при перемешивании2,1 г (13,8 ммоль) поли-й-оксисукцинимидного (ПОС) эфира й.трет,-бутилоксикарбонил-пролина, Реакционную смесь перемешивают48 ч при рН,0. Протекание процесса контролируют с помощью тонкослойной хроматографиина пластинах "Силуфол", Затем избыток непрореагировавшего ПОС эфира й-трет,-бутилоксикарбонил.1.-пролина и полимер активатор отфильтровывают, промывают водой (2 раза по15 мл), метанолом (15 мл). Объединенныйфильтрат упаривают в вакууме. Остаток промывают этанолом (20 мл), этилацетатом (20 мл)серным эфиром (20 мл), отфильтровываюти сушат.Выход 4,10 г (82%), белое кристаллическоевещество. Т, пл, 178 - 185, а)о - 48,8(с. 1, МеОН),Вт - 0,78 (н-бутанол. пиридин-уксуснаякислота - вода 10:5:4:4),й - 0,43 (н-бутанол-н-пропанол-вода- хлоруксусная кислота 65:15:20:3) (ТСХ на пластинках "Силуфол", ЧССР).Найдено, %: С 49,44; Н 7,97; й 18,00С,Н 9 й,О НОВычислено,%: С 49,36; Н 7,97; й 17,99Пи м е р 2, й .трет.Бутилоксикарбонил- й -бензилоксикарбонил- Е-лизил- .-пролил.аргинин,К 1,40 г (3,64 ммоль) й.третбутидоксикарбонилпролил.-аргинина (см, пример 1)растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты,выдерживают 25 мин при комнатной темпера.туре и упаривают в вакууме. Остаток промывают серным эфиром (3 раза но 20 мл) ирастворяют в 25 мл воды. К полученномураствору прибавляют 5,8 г (5,7 ммоль) ПОСЙэфира й -трет.-бутилоксикарбонил-й -бензилоксикарбонил- .-лизина. Реакционную смесьперемешивают 30 ч при рН 8,4, контролируяпротекание реакции с помощью ТСХ, Затемполимер отфильтровывают, промывают водой(2 раза по 20 мл) и метанолом (3 раза по20 мл), Объединенный фильтрат упаривают ввакууме, Остаток промывают серным эфиром(3 раза по 20 мл) и суспендируют в воде,рН суспензии доводят до 3,5 и экстрагируютэтилацетатом (2 раза по 20 мл). Водный слойотделяют, насыщают хлористым натрием и вы- .павший при этом маслянистый осадок отделяют,сушат в вакууме изатирают с серным эфиром.Образовавшийся твердый осадок отфильтровывают и сушат в вакууме.Выход 1,48 г (61%), бело аморфное вещес.тво. Т.размягчения 110, йр - 43,0о О а-пролил. 1 -аргинин.0,58 г (0,89 ммоль) И .трет,-бутилоксикарбонил- М -бензилоксикарбонил- .-лизил пролил.-аргинина (см. пример 2) растворяют в5 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают30 мин и упаривают в вакууме, Остаток промывают серным эфиром (2 раза по 15 мл).растворяют в 10 мл воды, К полученному раст.вору прибавляют 2,0 г (2,5 ммоль) ПОС эфира М-трет.-бутилоксикарбонил.треонина. Реакционную смесь перемешивают 8 ч при рН 8,0,Затем полимер отфильтровывают, промываютметанолом (20 мл) и ацетоном (20 мл). Остаток растворяют в 5 мл метанола и осаждают10 мл серного эфира, Осадок отфильтровываютпромывают серным эфиром (10 мл) и сушатв вакууме,Выход 0,56 г (84,3%), белое аморфноесоединение,а= - 37,8 (с. 1, МеОН). 1 = 0,40(этилацетат.пиридин-уксусная кислота. вода1:1:1:1) (ТСХ).Найдено,%: С 54,10; Н 7,47; М 14,56С 44 Нз 4 Ив 01 оН 20Вычислено,%: С 54,24; Н 7,50; И 14,89Аминокислотный анализ: ТЬг 1,01; уз0,98; Рго 1,00; Агд 0,98П р и м е р 4, М-трет-Бутилоксикарбонил.1.-треонил.-лизил- -пролил -аргинин,0,372 г (0,50 смоль) М-трет.-бутилоксикар.бонил- Ь-треонил-Й -бенэилоксикарбонил.-лизил.1:пролил-аргинина (см. пример 3) растворяют в смеси 10 мл метанола и 1 мл ук.сусной кислоты, добавляют 0,2 г 5%-ногопалладия на угле и перемешивают в атмос 1647 6фере водорода в течение 6 ч, Затем катализатор отфильтровывают, а фильтрат упариваютв вакууме. К остатку прибавляют смесь 2 млсерного эфира и 2 мл этилацетата,.тщательно% перемешивают, осадок отфильтровывают, промывают серным эфиром (5 мл) и сушат ввакууме,Выход 0,29 г (94%), белое аморфноесоединение. а =- 59,0 О (с.1, МеОН).,16 В= 0,92 (изопропанол-пиридин-уксусная кислота-вода 10:5:4:4);В у - . 0,72 (н.бутанол-уксусная кислота-пиридин.вода 30:6:20:24);В у = 0,68 (иэопропанол-пиридин-водас 5 4:1:1) (ТСХ),Найдено,%: С 50,61; Н 8,14; М 18,12С 2 бН 4 В ИЬОбН 20Вычислено,%: С 50,47; Н 8,14; М 18,12,Аминокислотный анализ: ТЬг 0,99; 1.уа 1,01;20 РГО 1)00; Агд 1303 .П р и м е р 5, Три-трифторацетаттреонил=лизил-пролил.-аргинина,0,236 г (0,381 ммоль) М-трет,-бутилоксикарбонил- -треонил.-лизил.-нролил-аргининаИ (пример 4) растворяют в 2 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 ч и добавляют20 мл серного эфира, Образовавшийся осадокотфильтровывают, промывают. серным эфиром(20 мл) и сушат в вакууме.30 Выход 0,317 г (98%), белое аморфное соединение. а = 32,2 (с,1, МеОН).Ву = 0,29 (изопропанол-пиридин-уксуснаякислота. вода 1: 5:4:4);В = 0,22 (н-бутанол-уксусная кислота- пну ридин-вода 30:6:20:24) (ТСХ).Найдено,%: С 38,41; Н 5,38; М 13,30С 2, Н 4 о И ОоЗС Гэ СООН. Н, ОВычислено,%: С 38,39; Н 5,37; И 13,27,Аминокислотный анализ: ТЬг 1,01; 1.уа1,02; Рго 1,00; Агд 0,99Как видно из приведенных примеров, пред.лагаемый способ позволяет получать промежуточные и конечное соединения с достаточно высоким выходом (общий выход - 41%) без до.полнительной очйстки, заменить дорогие итруднодоступные . производные И - ИО - 1. - аргинина на дешевый и доступный свободный1:аргинин, исключить иэ процесса получениятафцина стадию деблокирования защищенногоконечного тетрапептида с помощью фтористоговодорода, исключить использование на стадииконденсации органического растворителя. Формула изобретенияЯСпособ получения тафцина путем последовательного наращивания пептидной цепи с исполь, зованием полимерных активированиьтх эфиров.Редактор Р, Цицика Корректор В. Синицкая Заказ 11140/32 Тираж 446 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Подписное ФилиалНПП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Й.защищенных а-аминокислот с последующим опцеплением защитных групп и выделением целевого.соединения, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве полимерных активированных эфиров й-защищенных, а.аминокислот используют гидрофивьные поли.й-оксисукцинимидные эфиры общей формулыХ - А - Р где Х - трет:бутилоксикарбонилгруппа; Д.Рсб;1-8 У(Ц; р Ес;О- -ф - -й Р - 0 ф Ю 0где й - остаток М-винилпирролидона;й - 4,4 -диаминодифенилоксида;й - остаток стирола,фи процесс ведут в водной среде в интервалерН 8-10. 8Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Маваг Ч.А., йвЬоса К. Тцйвп А па -1 цга рЬедосу 1 овв в 1 паа 1 пд рер 1 се, -в "йа 1 цге", 1970, ч. 228, р. 672.2. СЬацсЬцг М.К., йаЯаг Ч. А, Зо 1 с-рЬа -ве 1 ц 11 вп (ТЬгУв-Рго-Агд) вуп 1 Ьевв:серго -1 ес 1 оп апс гевп сеачаде чч 1 Ь 1 гПцоготе 1- Ьапе вцНопс асс. - "Апа 1,8 осЬеп 1." 1 д 79,ч. 95, р. 305.3. Патент США ф 3778426,кл. С 07 С 103/52 19734. Ргдсп М., З 1 аЫпасу у 2 асц 1 Ь Ч.,Зргег Е. Тцйвп апс вогпа апа 1 одв. Зуп 1 Ьеввапс п 1 егас 1 оп чч 1 Ь Ьцвап ро 1 увогрЬопцс 1 еаг1 ецсосу 1 ев. - "8 осЬав., 8 орЬув. Ас 1 а", 1977,ч. 496, Мф 1, р. 203-211 (прототип).5. Дж. Стюарт, Дж, Янг. Твердофаэныйсинтез пептидов. М., "Мир", 197.Зд 6, Рогожин С,В., Давидович И. А., Самойлова Н. А., Миронова Н, В., Вртанов А, ИАндреев С, М. Синтез полимерных Й.оксисукцинимидных эфиров И-замещенных аминокислотн пептидов, - "Известия АН СССР", Серия2 в химическая, 1975, И 2, с, 428 - 433.7, Авторское свидетельство СССР е 644800,кл. С 08 Р 222/06, 1979,