Способ получения иммобилизован-ной -амилазы

Союз Советских Социалистических РеспубликЗЮ 219 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ ГВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М.Кл,С 07 6 7/О 2621396/23-04 с присоединением заявки Л осударственныи комитет СССР е яеяам иэобрете чй и открытий) Опубликовано 07.0 1. Бюллетень М 45) Дата исаи ия 07.03,81. чоликован(54) СПОСОБ ПОЛ УЧ ЕН ИЯ ММОБИЛ ИЗОВАН НОЙ а-АМИЛАЗЫ(61) Дополнительное к (22) Заявлено 01.06.78 1Изобретение относится к способу получения иммобилизованной а-амилазы, используемой в ряде отраслей промышленности, в частности в пищевой при производстве кристаллической глюкозы нз крахмала, производстве плодово-ягодных соков, пивоварении и з других областях.Известно несколько способов получения иммобилизованной а-амилазы с использованием в качестве матрицы акрильных полимеров 11) производных целлюлозы 12, фильтровальной бумаги типа %а(гпап 113.Наиболее близким по технической суш,- ности и достигаемому положительному эффекту является способ получения иммобилизованной а-амилазы, в котором в качестве матрицы для иммобилизации используют бумагу типа Юа 1 гпап 1. активиоованную Т 1 С 1 з ЯСпособ включает активацию мат трихлоридом титана при 44 - 46 С в ние суток и связывание с ней ферме среде 0,02 М ацетатного буфера (рН при 20 С в течение часа. Получают п рат иммобилизованной а-амилазы с а ностью 54 ед/г.Однако данный способ имеет относительно низкую активность иммобилизованной а-амилазы и ее невысокую стабильность (подверженность ми кробиальному поражению и рно.ть) .Целью изобретения является повышение активности и увеличение стабильности иммобилизованной а-амилазы.Указанная цель достигается тем, что в качестве матрицы используют неорганический Я-содержащий материал (обычно силохром или силикагель), а связывание фермента осуществляют при рН реакционной среды 4,5 - 4,7 и в присутствии 0,05 М ацетата кальция, причем в случае приме. нения для активации матрицы тетрахлорида титана активацию проводят при 3 - 5 С в течение 30 - 40 мин с последующим прокаливанием при 535 в 5 С в течение часа и связыванием фермента при 3 - ГС в те. чение 19 - 20 час, а в случае применения для активации трихлорида титана связывание фермента с активированной матрицей проводят в течение 2 час.Согласно изобретению описывается способ получения иммобилизованной а-амилаз( путем активации неорганической %-содержащей матрицы трихлоридом или тетрахлоридом титана и связывания фермен та с активированной матрицей в среде ацетатного буфера рН 4,5 - 4,7 в присутствии 0,5 М ацетата кальция, причем актнвацьпо матрицы тетрахлоридом титана осуществ 8107193ляют цри 3 - 5 С в теченис 30 - 40 миц с последуощим прокаливанисм при 535- 540 С в течение часа и связыванием фермента при 3 в 5"С в течение 19 - 20 ч, а связывание фермента с матрицсй акти.впрованной трихлоридом титана, осущсствляот В течение 2 час.Активацию матрицы трцхлоридом титана ооычцо осуществляют при 44 - 66 С в течение суток.0 и ис ы В а е ы Р с и Ос 0 0 поз Вол 51 с и Ол у.чпть пммобилизованную а-амилазу с высокой активцостшо до 480 сд/ Носитсля, Иммобилизовапцая данным способом а-амилаза обладает также высокой стабльцостью.Хранение фермснтного препарата прирН 4,7 и 4"С в течение года, а также пятпдссятикратпос повторение специфической реакции па 1,3 и 1 Оо-ном растворимом крах)алс пс меняет активности иммобилизовап 1 ОГО фсрСнты.Это обуславливается прцмсцсписм ВкачсстВс матрРцы актРВированпых сол 5 ми титана нсоргацичсских 81-содержащих ма.тсрцалов (силохрома и силцкагсля), обладающи:( высокой удсгпнои поверхностью, что обсспечиваст высокую активность полученного иммобилизова нного фсрмспта.Высокая микробиальная стойкость и механическая прочность силохромов и силикаГслсй обеспечивает высокую стабильность 11)мобРлизованцых данцы способом а-амилаз.Так как скязыванис фермента с посохОСТ 110 аСГ 1 кирова:1 Ой СО,5:.,1 .1- на матрицы проводят к црисутстши апстаГВ 1 КЗЛЬЦИ 51, ИСКЛ 10 ЧаСТС 51 И 011 НЬи ОО)101 между а-амилазой, которая содержит В своей мо.чскулс ион Са , и повсрхцостиь- мц ионами Н( сцлохромов и силцкагслсй.Присутствие иона Са- В молекуле а-амц.лазы обеспечивает се фермснтцую активность, а добавление апетата калыНя во время иммобилизации а-амилазы позволяет сохранить высокую активность препаратов. (Онцецтрация апетата ка.чь 1.15 0,05 М является оптимальной, так как далысйшсс повышение концентрации нс способствует повышению активности иммобилизованного фермента. Установление рН среды В пределах 4,5 - 4,7 также способствует повышению активности полученных препаратов.В качестве а-амилаз для иммобилизации можно использовать а-амилазы грибного (Акр. Огукае) и бактериального (Вас. ВНЬИ 11 В) происхождения. В качестве макропористых кремнеземов можно использовать силохромы и силикагели различных марок.Пример 1. 1 г силикагсля МСАзаливают 5 мл 12,5 Ъ ТС 1 З, растворенного ь абсолютном этиловом спиртс, интснсивнэ перемешивают и выдержива)от 24 часа при 45, затем реакционную смесь фильтруют, носитель промывают (трижды) 1 н. ЯаС 1,Оилисти:1 лирОВанной Водой (дважды) и 0,02 М ацетатцым буфером (трижды) р 1.1 4, 7 .Активированный носитель инкубиру)от 5 с 20 мл ферментного раствора, содержащего 80 мг фермента а-амилазы Лвр. огухас, в 0,02 М ацетатном буфере (рН 4,7) в присутствии 005 М ацетата кальция, Умеренно перемешивают при 20 С, 2 час.10 р 1 ммобилизованный фермент отфильтровывают и промывают ацетатньв буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 ц. МаС (трижды) и ОидистиллирОВанной Водой. Актив.ность иммобилизованной а-амилазы 445 сдг 15 1 оситсля.Активность иммобилизованной а-амилазы. определяют по методу Рухлядевои А. П, и Горячевой М. Г.Пример 2, 1 г силохрома СХ,5 зали каот 5 мл 12,5 о ТС 1 ь растворснпо 1 о г, абсолютном зтиловом спиртс, интснсивцо перемешивают и выдерживают 24 час поц 45 С, затем реакционную смесь фильтруют, носитель промывают (трижды) 1 ц.25 МаС 1, бидистиллированной водой 1 два)кды) и 0,02 М ацетатцым буфером (трижды) р 4,7.ЛктияирОВанный цоситсл 1 Р 111 куоирук)тс 20 мл фсрментпого раствора, содсржаЗ 0 щего 100 мг фсрмснта а-амилазы Азр. огухас в 0,02 М ацстатцом буфере (р 11 4,7) в 1 рисутств;и 0,05 апстата кальция. Умеренно перссиИкают при 20 С 2 ч. Иммо.билнзовашЫй фсрмснч Отфильтровываю г 35 и промывают ацстатцым буфером, рН 4,7(трижды), затем 1 н, МаС (трижды) и бьдпстиллироваппой водой. Активность пре 1 а рата 347 сдг носителя.Пример 3. 1 г силохрома СХ,5 сус пендируют в 5 мл дистиллированной водьцрн 4 С и порциями по 0,1 мл через каждыс 5 миц добавляют при интенсивном и.рсмсшивации 0,5 мл Т 1 С 4, Через 40 мин носитель отделяют, промывают 001 и. НС 1, 45 затем бидистиллироваццой водой до цсй 1ральной реакции и прокаливаюг 1 час при 540"-С.Актпкированцый носитель инкубируючс 20 мл фсрмецтного раствора, содержаще го 00 мг фермента а-амилазы Лзр. Огукас,в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают в течение 20 час. при 4 С, фильтруют и промывают ацетатным буфс ром, рН 4,5 (трижды), затем 1 н. 4 аС(трижды) и бидистиллированцой водой.Активность прспарата 353 ед/г носителя. Г 1 римср 4, 1 г силохрома СХ,5 суспсн дируют В 5 мл дистиллированной воды при4 С и порциями по 0,1 мл через каждь)с 5 мин добавляют при интенсивном перемешивании 0,5 мл Т)С 14. Через 40 мин носитель отделяют, промьвают 0,01 н. 1-1 С 1, за тем бидистиллировацной водой до нейт10719 5 10 15 20 25 30 35 4 О 45 50 55 60 65 85ральной реакции и прокаливают 1 час при540"С.Актцвированцый носитель инкубируютс 20 мл фермецтного раствора, содержащего 100 мг фермента а-амичазы Азр.огу 7 ас, в 0,1 М ацетатном буферс (рН 4,5)в присутствии 0,05 М ацетата кальция,Учсрснцо перемешивают в теченис 20 часпрц 4 С, Фильтруют и промывают ацстатцыч буфером, рН 4,5 (три)кды), затем 1 и.ХаС (трижды) ц бидистиллироваццой водой.Активность препарата 337 с,ъг носителя.Пример 5. 1 г силохрома Сзаливают 5 мл 12,57 о ТС 1 растворенного в абсол 1 отцом этиловом спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 час при 45",затем реакционную смесь фильтруют, носитсль промывают (трижды) 1 и. МаС 1,бидистиллирова иной водой (дважды) ц0,02 М ацетатным буфером (трижды),рН 4,7.Активированный носитель ицкубцруютс 20 мл ферментцого раствора, со 1 сржащего 100 мг фермента -амцлазь 1 Вас, зц)111 з (Препарат Амилосубтцлиц Г-ОХ, производимый в г. Вильшосс) в 0,02 М апетатцом буфере (рН 4,7) в присутствии0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают при 20 С 2 ч, фильтруют ц промывают ацетатцым буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 цаС (трюкг 1 ь 1) ц бидистиллироваццой водой. Активность прспарата 340 сд/г носителя.Пример 6. 1 г силохрома Сзаливают 5 мл 12,5% ТС 1 растворенного в абсолютном этиловом спирте, интенсивно перемсшива 1 от и выдерживают 24 час при 45 С,затем фильтруют и промывают (трижды)1 и. ХаС 1, бидистиллированной водой(трижды), рН 4,7,Активированный носитель инкубируютс 20 мл фсрментцого раствора, содержащего 80 мг фермента а.-амилазы Вас. зпЬЫз, в 0,02 М ацетатном буфере (рН 4,7)в присутствии 0,05 М ацетата кальция.Умерси 1 о перемешивают при 20 С 2 час,фильтруют, промывают ацетатным буфером рН 4,7 (трижды), затем 1 и. лаС(трижды) 1 и. ХаС 1, бидистиллированнойводой (дважды) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды), р 1-1 4,7.Активированный носитель инкубируютс 20 мл ферментного раствора, содержа 1 цсго 80 мг фермента я-амилазы Вас, зцз 1 з, в 0,02 М ацетатном буфере (рН 4,7)в присутствии 0,05 М ацетата кальция. 6Умеренно перемешивают при 20 С " час. Фильтруют, промывают ацетатным буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 н. КаС 1 (трижды) и бидистиллированной водой. Активность препарата 400 ед/г носителя.Пример 8. 1 г сцлцкагеля МСАсуспсндируют в 5 мл дистиллированной воды прц 4 С и порциями по 0,1 мл через каждыс 5 миц добавляют при интенсивном перемсшцвании 0,5 мл Т 1 С 4. Через 40 мин носитель отделяют, промывают 0,01 н. НС 1, а затем дистиллированной водой до нейтральной рсакции и прокаливают 1 час прц 540"С,Активированный носитель инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержа. ьцсго 100 мг фермента а-амилазы Вас. знЬ з, в 0,1 М ацстатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция. Умсрсццо перемешивают в течснцс 20 час при 4 С. Фильтруют и промывают ацетатцыч буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 н, ;аС (трижды) и бидистцллированцой водой. Активность препарата 480 сдпг носителя. Причср 9, 1 г сцлцкагеля МСАсуспсцдцруют в 5 мл дистиллированной воды прц 4-С и порциями по 0.1 мл через каждыс. 5 мин добавляют при интенсивном пе. ремешиванцц 0,5 мл Т 1 С 4. Через 10 миц носитель отделяют, промывают 0,01 н. НС 1,а затем бидцстиллированной водой до нейтральной реакции и прокаливают 1 часпри 540 С.Активированный носитель ццкубцруютс 20 мл ферментцого раствора, содержащего 100 мг фермента х-амцлазы Вас. зпЬ 1115. в 0,01 М ацетатцом буфере рН 4,5в присутствии 0,05 М ацетата кальция.Умеренно перемешивают в течение 20 часпри 4 С, фильтру 1 от ц промывают ацетатцым буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 н..аС (трцждь 11 и бидцстцллированной водой, Активность препарата 390 ед/г но.ситсля.Пример 10. 1сцлцкагсля МСАсуспендируют в 5 мл дистиллированной водь 1прц 4 С ц порццячц по 0,1 мл через каждые 5 мин добавляют при интенсивном перемсшцвании 0,5 мл Т 1 С 14. Через 10 минноситель отделяют, промывают 0,01 и. НС,а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции и прокалива 1 оч 1 часпри 540 С,Активированный носитель инкуоируюгс 20 мл ферментного раствора, содержагцего 100 мг фермента я-амилазы Вас. зпо 111 з, в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,5)в присутствии 0,05 М ацетата кальция.Умеренно перемешивают в течение 20 часпри 4 С, фильтруют ц промывают ацетатным буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 и.МаС (трижды) и бидистиллированной водой. Активность препарата 325 ед/г но.сителя.810719 Составитель О. СкородумоваТехред А, Камышинкова Редактор Л. Курасова Корректор О. Силуянова Тираж 419 Изд. М 235 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб, д. 4/5Заказ 2151 Подписное Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома 7 Формула изобретения1, Способ получения иммобилизованной а-амилазы, включающий активацию нерастворимой матрицы хлоридом титана и связывание фермента с активированной матрицей в среде ацетатного буфера, о тличающийся тем, что, с целью повышения активности и увеличения стабильности целевого продукта, в качестве матрицы используют неорганический Я-содержащий материал, а связывание фермента осуществляют при рН реакционной среды 4,5 - 4,7 в присутствии 0,05 М ацетата кальция, причем активацию матрицы тетрахлоридом титана осуществляют при 3 - 5 С в течение 30 - 40 мин с последующим прокаливанием при 535 - 540 С в течение часа и связыванием фермента при 3 - 5 С в течение 19 - 20 час, связывание фермента с матрицей, активированной трихлоридом титана, осуществляют в течение 2 час.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неорганического Я-содержащего материала используют силохром или силикагель.3, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что активацию матрицы трихлоридом 5 титана осуществляют при 44 - 46 С в течение суток. Источники информации,10 принятые во внимание при экспертизе 1, Я. А. Ваг 1 сег, Р. . Яоп 1 егз, К. Ер 1 оп,Кесочегу апд ге-нзе о ка 1 ег-пзоцЫе агпуазе дег 1 а 1 уев, СагЬо 11 уд. Кев., 1970, 15 о. 14, 3, 323.2. Я. А. Ваг 1 сег, Р. Ю. Яогпегз, 1. Ер 1 он,Ргерага 1 оп апд ргорегез о 1 а-ан 1 у 1 азс с 11 еппса 1 у соцред 1 о гпусгосгуз 1 а 1 пе сс 1- нозе, СагЬо 11 уд. Кев., 1968, чо 1. 8, 491.20 3. А. 1 Я, Егпегу, б. Я, Ноцд 11, М. Хомаз,Т. Р. 1.уопз, Яоп 1 е аррса 1 опв о 1 во 1 др 11 азе спзугпез п Ыо 1 орса 1 епрпеег 1 пд, Г 11 с СЬеписа Епрпеегпд, Геогпагу, 1972, 258, 71 - 76 (прототип).