Способ выделения комплекса ферментов -глюканазы и амилазы

Союз Советскни Соцналнстнческнд Республик(51)М. Кл. С 12 О 13/10 с присоединением заявки Нов Государственный комитет СССР оо делам изобретений и открытий(23) Приоритет Опубликовано 15,09,80 Бюллетень Йо 34 Дата опубликования описания 15,09,80(72) Авторы изобретения Н.А.Тиунова, И.В.Зайкина, В.Ю.Авиженис, Р.К. Алекнавичютеи А.А.Глемжа Ордена Ленина институт биохимии имени А.Н.БахаАН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институтприкладной энзимологии(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ ф -ГЛЮКАНАЗЫ И АМИЛАЗЫИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству ферментных препаратов и используется в про" изводстве ферментов микробного происхождения.Известен способ выделения :з 1,3- 1,4-глюканаэы иэ культуральной жидкости Вас 1 И цв вцЬс 1 с 1 в, заключающийся в его осаждении сернокислым аммонием иэ водно-ацетонового раствора, оставшегося после осаждения фермента амилазы ацетоном 1.Однако при выделении амилазы из культуральной жидкости этого микроорганизма по производственному регламенту (ацетоном) фермент в-глюканаза почти не осаждается и остается в отходе: в водноацетоновом растворе,Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ выделения амилазы из культу- ральной жидкости микроорганизмов путем адсорбции фермента на крахмале 2 .Недостаток известного способа заключается в том, что крахмал является дорогостоящим пищевым сырьем. Кроме того, данный сорбент не может быть использован дляполучения р-глюканаэы.Целью изобретения является повышение выхода целевого продуктаи расширение сырьевой базы.Поставленная цель достигаетсятем, что в качестве адсорбирующегоматериала применяют сульфитнуюцеллюлозу или пшеничную солому,которые вводят в количестве 8-12 Вот объема культуральной жидкости.Указаннйе сорбенты содержатв качестве основного компонентацеллюлозу и являются отходами про иэводства.Способ осуществляется следующимобразом, В культуральную жидкость,содержащую ферменты после выращивания микроорганизма, или к раствору 20 ферментов добавляют иэмельченйВйцеллюлозосодержащий материал, получейную кашицеобраэную массуотжимают, фильтруют или центрифугируют, а затем высушивают на воз духе или роторной сушилке. Полу"ченный препарат является сорбатомферментов и проявляет свою активность в тех же условиях,как и ферментные препараты, полученные други ми способами.763465 Испытуемые образцы р -глюканазаед. (тыс.) Амилаэа ед. (тыс.) 3, 850 0,623 4,400 0,440 100 6625 100 2580,0 44370 6430,0 16,1 38,9 114 67,0 11,4 3,990 103, б 1328, 9 20-глюканаза,Амилаза Испытуемые образцы д, (тыс. 100 1101 11,8 Исходный раствор ФильтратСорбат 10,24 5,5 91,11, 00 П р и м е р 1. Выделение Ферментов путем адсорбцин на соломе. Пшеничную солому нарезают и иэмель. чают в шаровой мельнице затем " полученную муку пропускают через сито (с отверстиями в 0,25 мм )В качестве ферментов используют лиофильно высушенную культуральную жидкость Вас 1 СЙцв зцЬ 1181 з, полученную на Вильнюсском заводе Ферментов и содержащую как амилазу, так и-1,3-1,4-глюканаэу, Для опыта готовят 1-ный раствор этих ферментов, осадок нерастворившихся примесей отделяют центрифугирова- нием. К 100 мл раствора ферментов добавляют 10 г измельченной соломы. По истечении 30 мин твердую часть отделяют от раствора путем фильтрования на воронке БюхнераВ одном случае полученный сорбат Ферментов на порошке иэ соломы снова разводят Исходный Ферментныйраствор для опыта Ти Ц Опыт 1. ФильтратСырой сорбат на соломеОпыт П. Фильтрат Высушенный сорбат насоломе Из таблицы следует, что большая часть )з-глюканазы .адсорбируется на соломе и полностью проявляет свою активность при ее определении в сыром и высушенном препарате.Амилаза при этом адсорбируется в количестве 67 и 20 и также проявляет свою активность при определении ее в полученных препаратах.П р и м е р 2, Способ выделения ферментов путем адсорбции на сульфитной целлюлозе.В качестве ферментов используют пиофильно-высушенную культуральную . жидкость Вас 1 И цв зцЬСИ 1 з, полученную на Вильнюсском заводе Ферментов и содержащую амилаэу и р-глюканазу,100 мл ацетатного буфера рН 5,50,1 М, и в полученной суспензииопределяют активность ферментов,амилазы и Ъ -глюканаэы. Во второмслучае осадок с воронки Бюхера высушивают на воздухе, и затем осадокэамачивают в 100 мл ацетатного буФераи в суспензии определяют активностьферментов. Активность также определяют в фильтрате после отделенияосадка. Активность )5 -глюканаэы измеряют по образованию редуцирующихсахаров при действии фермента налихенин, активность амилазы - по 15 снижению иодной окраски растворакрахмала под действием Фермента.Результаты адсорбции ферментовна пшеничной соломе и исследованиеактивности полученных сорбатов 20 приведены в табл.1.Таблица 1 Цля опыта готовят 1-ный раствор этих ферментов. Осадок нераство 40, рившихся примесей отделяют центрифугированием.К 100 мл раствора ферментов добавляют 10 г сульфидной целлюлозы.45 По истечении 30 мин твердую частьотделяют от раствора путем фильтрования на воронке Бюхнера. Полученныйсорбат ферментов на порошке изцеллюлозы снова разводят 100 мл 50 ацетатного буфера рН .5,5 0,1 М ив полученной суспензии определяютактивность ферментов: амилазы иглюканазы. Результаты представленыв табл, 2.Таблица 2763465 Формула изобретения Составитель И.ПаниковРедактор Ю.Петрушко Техред А,Щепанская Корректор М Демчик Заказ 6580/12 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Иэ таблицы следует, что /5-1,3- 1,4-глюканаэа и амилаэа адсорбируют иэ раствора на целлюлозе и проявляют 93 и 90 активности при исследовании полученных сорбатов.Предлагаемый способ по сравнению известным позволяет в 10-15 раэ увеличить выход Д-глюканаэы в сравнении с существующими методами получения ферментных препаратов путем осаждения ацетоном и сернокислым аммонием,позволяет расширить сырьевую базу для получения ферментных препаратов путем применения измельченных отходов сельского и лесного хозяйства, а также бумажной промышленности: соломы, цветочныхпленок крупяных культур лузги, древесных опилок, скопа, отхода бумажного производства, хлопкового линта, хлопковых и вискоэных очесов и т.д.,которые в настоящее время н используются и загрязняют среду. Получение комплексного ферментного препарата амилазы и ф -глюканаэы в виде сорбата на вышеперечисленных материалах исключает необходимость применения ИаС 1, добавляемого в качестве наполнителя, что также снизит стоимость препарата.В отличие от способа получения ферментного препарата путем высушивания на распылительной сушилке, получаемый сорбат ферментов на перечисленных материалах является ферментным препаратом, очищенным от пигментов и некоторых других балластных веществ мик-. робного происхождения, содержашихся в исходной культуральной жидкости. Измельченный целлюлоэосодержащий материал добавляется в культуральную жидкость без предс варительного запаривания или другойобработки в отличие от способа получения сорбата амилаэы на крахмале, который требует предварительного запаривания в определенном режиме влажности и температуры. Способ выделения комплекса15 ферментов -глюканазы и амилазы иэкультуральной жидкости Вас 1 И цвэцЬ 111 з, путем использованияадсорбирующего материала,.о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью20 повышения выхода целевого продукта и расширения сырьевой базы, вкачестве адсорбирующего материалаприменяют сульфидную целлюлозу илипшеничную солому, которые вводятв количестве 8-12 от объема культуральной жидкости.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Алекнавичюте Р.К., Авиженис В.Ю,Глемжа А.А. Получение-глюканазыГ 15 Х иэ отходов производстваамилосубтилина Г 10 Х.-Микробиологическая промышленность,вып. 5, 1977, с, 9-11.2. Иульман М.С. Сорбция амилолитических ферментов; М.,Пищевая промышленность, 1966,