Реактив для определения тригицеридов

Союз Соеетсиитт Социалистимескин Республик(51) М, Кл,б 01 Й 31/14 1 осудерстеенный комктет СССР ло делам нэабретеннй н открытнй(54) РЕА 1(ТИВ ЙЛ 51 ОПРЕЛЕЛЕНИ 51 ТРИГЛИ 11 ЕРИДОВ Изобретение относится к аналитическойхимии, в именно к определению триглицеридов, в продуктах питания, крови и сыворотке.Известен реактив для определения триглицеридов, содержащий липвзу из К 111101Р 05 сегРЬ 1 ь О, буфер, Д, -химотрипсин,глицеринкиназу, лактатдегидрогенвзу, сы -вороточный альбумин аденозин-трифосфата, фосфоенолпировиноградную кислоту,восстановленный никотинамид - адениндинуклеотид, пируваткиназу 111,Недостатками реактива являются большой расход фермента и длительность проведения анализа для определения триглицеридов.По технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому реактиву наиболее близок реактив для определения триглицеридов, содержащий липвзу 2 оиз Я тт 120 ров аггтихОв, карбоксилостервзу из микроорганизмов, додецилсульфат натрия. никотинамид - вденин -динуклеотид в восстановленной форме,2вденозинтрифосфат, фосфсенолпируват, лвктатдегидрогеназу, фосфоегтолкинвзу, глицеринкинвзу, вльбумии сыворотки, сульфат магния, буфер ц водуНедостатком этого реактива является невысокая точность определения, твк как в сильно липемических сыворотках появляется муть в результате осаждения выделяющихся в свободном виде жлрных кислот, что сильно препятствует оптическому определению. Белью изобретения является повышение точности определения,Бель достигается описываемым реактивом для определения триглицеридов, который содержит лыпвзу из Ят 1120 рц ьОт 1 11 ту,об , карбоксилэстеразу из микроорганизмов, додецилсулыфат натрия,никотинвмид - аденин-динуклеотид в восстановленной форме, вденозинтрифосфат,фосфоенолпируват, лактатдегидрогеназу,фосфоенолкиназу, глицеринкиназу, альбумин сыворотки, сульфат магния, буфер641884 1 О О, 07-1,400,6-6,00,1-0,920 О, 03-0,3О, 1-3,0 35 и воду, а также дополнительно - соединение общей формулыЗО(СН СН,О)Н,где Я - апкидьная иди адкенильная группа С 1 - Си - 7-20,при следующем соотношении компонентов, вес%:Липаза из Я 1 хо)цб ОРГЮТ.Оь0,01-1,00 К арбоксилэс теразаиз микроорганизмов 0,001-2,00Д одецилс ульфатнатрия 0,001 -0,02Никотинамид-аденин-динуклеотид ввосстановденнойформеАден озинтриф осфатФосфоенолпируватЛактатдегидрогеназа 0,05-0,5Фосфоенодкиназа 0,02-05Гпицеринкиназа 0,005-0,5Альбумин сыворотки 0,01-0,2Судьфат магнияс содержаниемионов магнияБуферСоединениеЗОобщей формупый 0(СН,С, О)Нгде Я- апкильнаяили адкенипьнаягруппа С 1,- С11 -7-20 0,001 5-0,03В ода ОстальноеОтдичитепьный признак предлагаемогореактива состоит в том, что он дополнительно содержит соединение общей формулы йО(СН ОНО)п нгде К - влкипьная иди адкенидьная группа С 4- Сс,д - 7-20,Применение преддагаемого реактиваповышает точность определения. Крометого, он позволяет сократить продолжительность определения до 10 мин и приэтом работать при комнатной температу 51 П р и м е р 1, Реактив согласно изобретению приготавпивают из следующих смесеи:1) раствор буфера: 0,05 М натрийфосфатный буфер, рН 7,0, содержащий 4 ммопь сульфата магния 0,01% додецидсульфата натрия, 0,015% полигдикопевогь эфира цетилстеарилов ого спирта (с 1 2 мольокиси этилена);2) коферментная смесь 10 ммопьникотинамид-аденил-динукдеотид в восстановденной форме (НАДН+), 22 ммодьАТФ - СНАоди, 18 ммодь ФЭП-СНА-сопи.3) ферментная смесь 400 ед.акт/мппипазы (ЯЪЬОроь оггЫЬо ь )50 ед, акт/мп карбоксилэстеразы (измикроорганизмов) 50 ед. акт/мл фосфэенодкиназы (ФК) (из мускулов кролика), 300 ед, акт/мл лактатдегидрсгеназы (ЛДГ) ( из серца свиньи) ввиде суспензии в растворе сульфатааммония;4) 150 ед. акт/мл гпицеринкиназы(ГК), суспендированной в растворе сульфата аммония,оСмеси 1-4 могут храниться при 4 Сминимально в течение одного года, Смесь2 после растворения при этой температуре может храниться около двух недель,Из реактивов 1-3 приготавливаютсмесь, которая в охпажденном виде может храниться около двух дней, Смесь 2к тому же растворяют предварительно вдистиппированной воде, Для цриготовления реакционной смеси смешивают растворы реактивов 1; 2 и суспензию реактива3 в объемном соотношении 50:1,0;1,0.Определение с контропьной пробой,5,0 мл смеси 1-3 смешивают с 0,1 мдсыворотки, Затем отбирают 2,0 - 2,5 мди смешивают их с 0,01 мп суспензииреактива 4 (проба); остальное спужитконтрольной пробой. Растворы прсбы и контрольной пробы выдерживают около 10 минопри 20-25 С и измеряют экстинкцию пробы по отношению к величине контрольнойпробы. Найденную величину применяютдля расчета. Определение без контрольной пробы.2,5 мп смеси 1-3 смешивают с 0,05 мл сыворотки, выдерживают 10 мин прио20-25 С и измеряют экстинкцию этого раствора. Затем прибавляют 0,01 мл суспензии 4 и через 10 мин снова измеряют экстинкцию, Разницу между обоими показаниями применяют дпя расчета. Измеренчя проводят на фотометре при 365, 340 ипи 334 нм. Расчет проводят в зависимости от ддины вола измерения умножением разницы экстинкций на 15,5 (365 нм) иди 8,23 (340 нм), или 8,53Г(334 нм), При этом результат подучают в ммопях тригдвжридана 1 д пробы.Найдено после оценки без контрольной пробы 477 мг триглицерида/100 млсыворотки, Через 10 мин после оценкибез контрольной пробы найдено 513 мгтриглицерида /100 мл сыворотки,С реактивом согласно изобретению получают практически идентичные величиныпри измерениях с учетом и беэ учетаконтрольной пробы. С известным реактивом получают различные величины (засчет появления мути), разница определений в данном примере около 8%,50 Повторяя определения с различнымиколичествами триглицерида в сыворотке,получают прямую.Пропорциональность ( коэффициент корреляции) 0,997, 5П р и м е р 2. Для сравнения реактива согласно изобретению с известнымпроводят следующие опыты,Опыты 1 и 2, Смашивают 4,9 млраствора 1, который состоит из 0,1 М 10натрийфосфатного буфера, рН 7,6, содержащего 4 ммоль сульфата магния, 1,5 мгальбумина, сыворотки и 0,01% додецилсульфата натрия; 0,2 мл раствора 2, состоящего иэ коферментной смеси 6 ммоль 5НАНД, 33 ммоль аденозинтрифосфата(АТФ) и 11 моль фосфоенолпирувата (ФЕП);0,1 мл раствора 3, который включает 22 мг/мл ЛДГ и 1,мг/мл ФК, в формесуспензии в растворе сульфата аммония;раствор 4, состоящий из коферментнойсмеси 0,2 мг липазы из ЙЯ(хОРОЬ ОРРЪ 12.об и 4,0 мг карбоксилэстеразы;0,1 мл сыворотки (примерно 50 мг триглицерида). От полученного раствора отбирают 1,5 мл в кювету 1, остальное -в кювету 2,Опыты 3 и 4, Смешивают 5 мл реактива 1 по примеру 1; 0,1 мл реактива 2по примеру 1; 0,1 мл реактива 3 по приме- ЗОру 1 и 0,1 мл сыворотки (как в опытах1 и 2). От приготовленного раствора отбирают в кювету 3 2,5 мл, остальное -в кювету 4,Через примерно 20 мин отбирают пи 35петкой в каждую из кювет 1 и 3 по0,01 мл суспензии ГК, Кюветы 2 и 4остаются для контрольной пробы.Ниже приведены полученные результа 4 ОНайдено после оценки с контрольнойпробой 517 мг триглицерида /100 мл,сыворотки. Через 10 мин пссле оценкиконтрольной пробой найдено 508 мг три45глицерида/100 мл сыворотки,Непосредственно после прибавленияпробы загрузки во всех опытах почтипрозрачны, В кюветах 1 и 2 через 5 мииобразуется заметная муть, В кюветах 3и 4 через 0,5 мин раствор становитсяпрозрачным, Через 55 мин раствор вкювете 4 все еше прозрачен, а в кювете3 очень мутен.П р и м е р 3, Для приготовленияреактива согласно изобретению используют:1) раствор буфера; 0,02 М фосфатнатрия в качестве буфера, рН 7,0, содержащего 3 ммоль сульфата магния,0,01 мг/мл додецилсульфата натрия,0,01 5 мг/мл цетилстеарилалкогольполигликольэфира с 12 ммоль этиленоксида и 0,1 мг/мл альбумина плазмы;2) смесь коэнэимов, как в примере 1 р3) смесь ферментов; 0,2 мл липазыиз ЙВ 1 ХОРОЬ ОгИ 12 ц0,2 мг/млФК (из мускулов кролика),. 0,2 мг/млкарбоксилмтеразы (иэ микроорганизмов),0,5 мг/гл ЛДГ (из сердца, свиньи цлимускулов свиньи или кролика) в видекристаллической с успенэии;4) 0,05 мг/мл ГК в виде кристаллической суспензии,Смесь реактивов приготавливают попримеру 1, исследование проводят также, как в примере 1.При исследовании 10 сывороток человека и 3 контрольных сывороток получено хорошее совпадение результатов срезультатами, полученными в примере 1,Коэффициент корреляции 0,991,П р и м е р 4. Для приготовленияреактива согласно изобретению применяют;1) буферный раствор - 0,1 М фосфатнатрия в качестве буфера, рН 7,0, содержащего 8 ммоль сульфата магния,0,2 мг/мл додешлсульфата натрия,0,3 мг/мл цетилстеарилалкогольполигликольарира с 1 2 моль этиленоксида,2,0 мг/мл альбумпна сыворотки;2) смесь коферментов; 20 ммоль НАДН,100 ммоль АТФ, 20 ммоль ФГП в дистиллированной воде; 3) смеси ферментов; 10 мг/мл липаэыиз ЯЭ 1 ХарОЬ ОГГМХО, 20 мг/млкарбоксилэстеразы (цз микроорганизмов),5 мг/мл ФК (иэ мускулов кролика),5 мг/мл ЛДГ (иэ сердца свиньи или мускулов свиньи или кролика), как растворв буфере;4) 5 мг/мл ГК,0,03-0,3 О, 1-3,0 7-20 0,0015-0,0Остальное ЦНИИПИ Заказ 7564/59 Тираж ВСЯ Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Смесь реактивов приготавливают попримеру 1, исследование проводят квкв примере 1,При исследовании 10 сывороток человека и 3 контрольных сыворотгцс получено хорошее совпадение результатов с результатами примера 1, Коэффициент корреляции 0,994,П р и м е р 5, В одном сравнительном эксперименте вместо 0,015% цетилстеарилалкогольполигликольэфяра используют подобные вещества,Смесь реактивов приготавливают попримеру 1, эксперимент проводят, какв примере 1,15При использовании 0,01% олеилалкогольполигликодьэфира ( Я-Св Н;35и) достигнуто хорошее совпадениеодиночных результатов, коэффициент корреляции 0,989,20Аналогично применяют 0,1% миристидалкогольполигдикольэфир ( Я Сц НуМ), 0,05% стеаридалкогольполигликольэфир ( - С 8 Н, - 20),О, 03% цетилалкогольполигликольэфир( Я- С 1 в Н , Й), а также 0,01%эйк озилалк ог ольп олиглик ольэфир( ц -С ОН; О).При 20 пробах получены следующиекоэффициенты корреляции; 0,992; 0,990;0,997; 0,987.П р и м е р 6. Ст одного и того желица взяты плазма, гепарин (около0,75 мг гепарина на 1 мл крови) и сывортка ЕДТА (примерно1 мг ЕДТА -этилендиаминтетраацетата двойной натриевой соли нв 1 мл крови) и использованыв качестве обоазцов. Реактив готовят,так в примере 1. В сыворотке установлено 576, в плазме гепаринв 552 и вплазме ЕДТА 563 мг триглицеридов в100 мл пробы, Повторяемость в отношении сыворотки составляет 96-98%, Показатели отличаются в пределах, обусловленных точностью метода. Формула изобретении50Реактив для определения триглицеридовна водной внове, состожций из липвзыиз ЯЬ 1 ХОроб агМ 7 О Ь, карбоксилэстеразы из микроорганизмов, лоленнлсульфата натрия, никотинамид - аленнндинуклеотида в восстановленной Форме,аденозинтрифосфата, фосфоенолпируввталвктатдегидрогеназы, фосфоенолкиназы,глицеринкиназы, альбуминв сыворотки,сульфата магния и буфера, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, он дополнительно содержит соединение общей форЯО(СН СН 0),Н,где Й - алкильнвя или алкенильнаягруппа С- Со,- 7-20,при следующем соотношении компонентов, вес, %:Липазв из РЬ 17 ароб агРЬ 1 хов0,01-1,00 К арб окс ил эс те разаиз микроорганизмовДодецилс ульфатнатрияНикотинвмид-аденин-динуклеотидв восстановленнойформеАденозинтрифосфатфосфоенолпируватЛактатдегидрогеназафосфоенолкиназаГлицеринкиназаАльбумин сывороткиСульфат магния ссодержанием ионовмагнияБуферСоединение общейформулыЙО(СН СНО) , Нгде %- алкильнаяили алкенильнаягруппаС 1 - Со, ивВ одв Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе:1,6,ВоСойо е 1 де МЕсЬапЮЕЙ ЕнВвоОс Берег ЫпаОап о 1 Тщбсегдеьюьегощ Сйщ.СИее, 1975. 21,