Реактив для определения триглицеридов

ОП И САНИ Е И 306 РЕТЕН ИЯ Соигз Советских.73 (32) 19.06.72 (33) ФРГ Государстввнный комит СССР по делам изобретений и открытий(088,8) 43) Опубликовано 25,12.78, Бюллетень в 4 5) Дата опублико ия описания 23.01.7 2) Авторы изобретен Иностранцы Аугуст Вильхельм Валефельд, Ханс Меллеринг Вольфганг Грубер, Эрих Бернт и Петер Решлау1) Заявител странная фирмар Маннхайм ГмбХ(ФРГ) гБерин В ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИГЛИЦЕ 2,04 - 0,4 ,05 - 0,5 ,01 - 0,2 005 - 1,0 ,05 - 2,0 001 - 0,0 ,02 - 0,5 0,007 - 0,07остальное Изобретение относится к аналитическойхимии, а именно к реактивам для определения триглицеридов в продуктах питания,крови и сыворотке.Известен реактив для определения триглчцеридов, состоящий,из перекиси водорода, периодата и хромотроновой кислоты, добавляемой,после эгсстракции триглицеридовхлороформом с последующим удалениеммешающих определению веществ цеолитом,омылением фильтрата спиртовой щелочьюпри 60 - 70 С с последующим выдерживанием раствора при 100 С в течение30 мин 11,Недостатком реактива является необходимость длительной предварительной подготовки пробы для анализа.Известен также реактивов для определения триглицидов, содержащий липазу изКгугориз аггггааз, буфер, а-химотрипсин,глицеринкиназу, лактатдегидрогеназу, сывороточный альбумин, аденозин-фосфат,фоофоенолпировиноградную кислоту, восстановленный никотинамидадениндинуклеотид, пируваткиназу и триолин 21.Для этого, реактива характерны большойрасход энзима и большая длительность проведечия анализа для определения триглицеридов. Целью изобретения является повышениеэффективности реактива.Предлагаемый реактив для определениятриглицеридов содержит буфер, лппазу из5 Югугориз аггггиии, аденозинтрифосфат(АТФ), никотинамидаденпндинуклеотид ввосстановленной форме, фосфоенолпировиноградную кислоту, лактатдегидрогеназу,сывороточный аль бумин, глицеринкиназу,О карбоксилэстеразу, додецилсульфат натрия,фосфоенолкиназу и сульфат магния, приследующем содержании компонентов,вес фоЛип аза пз Кгугория аггггггиз 0,01 - 1,0Аденозпнтрифосфат 0,5, - 5,0Никотинамидадениндинуклеотид в восстановленнойформе 0,05 - 1,0Фосфоенолпировиноградная0кислота 0Лактатдегндрогеназа 0Сывороточный альбумин 0Глицеринкиназа О,Карбоксилэстераза 05 Додецилсульфат натрия О, 2Фосфоенолкиназа 0Сульфат магния с содержанием ионов магнияБ фер639487 Компоненты: Отличительным, признаком реактива является то, что он дополнительно содержит кар боксилэстер азу, додецил сульфат натрия, фосфоренолкиназу,и сульфат магния при мказанном содержании компонентов реак тива. Предлагаемый, реактив позволяет сократить время проведения анализа в два раза,т. е. до 30 мин, и,количество потребления 10энзима в 50 раз,В качестве буфера предпочтительно использовать 0,03 - 0,3 М раствор триэтаноламина при рН 6 - 9 или боратный буфер. 15П р и м е р 1. Приготавливают реактив, устойчивый при хранении, состоящий из пяти компонентов, которые, перед употреблением смешивают, его можно хранить в виде смеси в течение 1 - 2 дней, 20 Компоненты:0,1 моль триэтаноламинного буфера с рН 7,6, содержащего 3 млсоль сульфата магния, 1,5 лсг/лсл коровьевого сывороточного 25 альбумина и 0,1 мг/мл додецилсульфата натрия (1);раствор 6 лсмоль никотинамидадениндинуклеотида в воостановленной форме (НАДН), 33 лслсоль АТФ и 11 ммоль фос фоенолпировиноградной кислоты в дистиллированной воде (2);кристаллическая суспензия 2 мгlмл лактатдегидрогеназы и 1 мг/мл фосфоенолкиназы (3); 3раствор 0,2 лсг/мл липазы из Югугориз аггйскпз и 4,0 мг/мл карбоксилэстеразы (4);кристаллическая суспензия 2 мг/мл глпцеринкиназы (5),40При умножении величины количества компонентов в л г/мл на 0,1 получают количество компонентов в вес. % . Для компонентов, указанных в ллолял., 45 учитывается еще молекулярный вес.2,9 мл компонента 1, 0,1 лсл компонента 2 и 0,02 мл компонента 3 смешивают и устанавливают температуру смеси 25 С. Затем прибавляют 0,1 лсл сывороткисодержащей 50 подлежащий определению триглицерид, и инкубирусот 5 лсссн при заданной температуре. Затем прибавляют 0,1 мл компонента 4, смесь выдерживают 15 - 20 мин при указанной температуре и затем замеряют, величину экстинщии на индикаторной шкале фотометра (при 366 или 340 нм). Эту величину обозначают Ес, Затем нрибавляют к пробе 0,02 мл компонента 5,и через 10 мин снова замеряют экстинкцию. 3 амеренную 60 величину обозначает Е 2. Еще через 10 мин снова замеряют экстинкцию и замеренную величину обозначают Ез, Расчет: КЕ = (Е, - Е 2) - (Е 2 - Еэ) Общее количество .глицерина из триглицерида в лсг/100 мл=ЬЕ 89,1,Описачное определение повторяют девять,разпричем прибавляемое количество сыворотки может быть уменьшено на 0,01 мл. При построении графика полученные таким образом значения ЬЕ по отношению к применяемому количеству сыворотки образуют, прямую. Из определенных, величин вычисляют пропорциональность (г), равную 0,9986, по сравнению с г (идеальный случай), равной 1,000, что показывает очень высокую точность метода. П р и м е,р 2 (для предельно низких концентраций отдельных компонентов).Определяют коэффициет изменения (К). стандартссое отклонение (С)/ь среднее значение (Х) 100 Проводят 10 измерений в 1 день, точно таяке,проводят 10,измерений в течение 10 дней по одному измерению в день. Приготавливают успойчивый при хранении реактивсостоящий,из пяти компонентов, котор ые смеши в а ют,пер ед употр еблением, в виде смеси они могут хоаниться в течение 1 - 2 дней,0,03 моль триэтаноламинного буфера, рН 7,6, содержащего 3 млсоль сульфата магния, 0,1 лсг/мл коровьего сывороточного альбумина и 0,01 мг/мл додецилсульфата натрия (1);,раствор 1 лсмоль НАДН, 10 лслсоль АТФ ,и 2 ммоль фоофоенолпировиноградной кислоты в дистиллированной воде (2);кристаллическая суспензия 0,5 мг/мл лактатдегидрогеназы и 0,2 лсг/лсл фосфоенолкиназы (3);раствор 0,1 мг/лсл липазы на Й/сугорт агп/ссгиз и 0,5 мг/лсл карбоксилэстеразы (4);кристаллическая суспензия 0,05 лсг/лсл глицеринкиназы (5).2,9 мл компонента 1,01 мл компонента 2 и 0,02 мл компонента 3 смешивают и устанавливают температуру смеси 25 С, Затем прибавляют 0,1 лсл сыворотки, содержащей подлежащий определению триглицерид и 15 мин инкубируют при 37 С. Затем прибавляют 0,1 мл компонента 4, смесь выдерживают 35 мин при указанной температуре и затем при 316 или 340 нм считывают величину экстинкции по индвкаторной шкале фотометра. Эту величину обознают Е;. Затем прибавляют к пробе 0,02 мл компонента 5 и через 20 мин снова считывают экстинкцпю. Эту величину обозначают Е 2.Еще через 20 лин снова считывают величину, обозначаемую Ез. Расчет:ХЕ= (Е, - Е) - (Е, - Ез)Общее количество глицерина из триглицерида в лг/100 лс.г=ЬЕ 89,1.Эти измерения повторяют 10 раз с каждой пробой серийно (одно за другим) пли в течение 10 дней, на основании полученных данных вычисляют среднюю величину и стандартное отклонение и определяютК (%).П р и м е,р 3 (для предельно высоких концентраций отдельных компонентов),Берут пробы в 15 различных сериях (первый столбец), к которым, прибавляют чистое вещество - трсиолин. Из сравнения ожидаемого (вычисленного) значения н найденного значения получают данные (в процентах). Результаты, приведены в таблице.Приготавливают устойчивый при хранении реактив, состоящий из пяти компонентов, которые смешивают перед употреблением, в виде смеси они могут храниться в течение 1 - 2 дней.Компоненты;0,3 лоль триэтаноламинного буфера рН 7,6, содержащего 30 ллоль сульфата- магния, 2 лсг/лл коровьего сывороточного альбумина и 0,2 лг/лл додецилсульфата натрия (1);раствор 20 ллоль НАДН, 100 ллоль АТФ,и 20 лслоль фосфоенолпировиноградной кислоты в дистиллированной, воде (2);кристаллическая суспензия 5 лг/лсл лактатдегидрогеназы и 5 лсг/лсл фосфоенолкиназы товарная марка (3);раствор 100 лг/лсл липазы из Лйугориз апсМгиз и 20 лсг/лсл карбоксилэстеразы (4);кристаллическая суспензия 10 лсг/лсл глицеринкиназы (5).2,9 лл компонента 1, 0,01 лсл компонента 2 и 0,02 лл компонента 3 смешнвают и устанавливают температуру смеси 25 С. Затем прибавляют 0,1 лсл сыворотки, содержащей лодлежащий определению триглицерид, и,инкубируют 5 лин,при 20 - 25 С. Затем прибавляют 0,1 лл компонента 4, смесь, выдерживают 7 - 10 лин при заданной температуре и затем считывают .величину экстинкции по индикаторной шкале фотометра при 366 или 340 нлс. Эту величину обозначают Ес. Затем прибавляют и пробе 0,02 лсл компонента 5 и через 5 мин снова считывают величину экстракции, обозначают считанное значение Е 2. Еше через 5 мин снова считывают значение экстинкции и обозначают его Е,. Расчет:ХЕ= (Е, - Ез) - ГЕ, - Ез )Оощее количество глицерина пз трпглицерида в лг/100 лл=ХЕ 89,1.Результаты приведены в таблице. Триглицерид Триглннерид св.во.ротни, лсг/ 100 лсл Триолинлобавка,ль/100 лл вычислено найдено, с с/0 с нс 118228324315423624 312 408 399 507 708 .412 508 96 607 708 118 118 118 1 всо 2 2 2022 212 но Зоо ч/2 302 302 Х , 99,9 25 30 Реактив для определения триглпцеридовна основе буфера, липазы из Югугориз агпнсгссз, аденозпнтрифосфата, никотинамидадениндинуклеотида в восстановленной форме, фосфоенолппровиноградной кислоты, 35 лактатдегидрогеназы, сывороточного альбумина и глицеринкиназы, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения эффективности реактива, он дополнительно содержит карбоксилэстеразу, додецилсульфат натрия, 40 фосфоенолкпназу и сульфат магния при следующем содержании компонентов, вес. %: Липаза из К/сугориз агп/саиз 0,01 - 1,0 Аденозинтрифосфат 0,5 - 5,0 45 Никотинамссдадениндинчклеотид в восстановленнойформе 0,05 - 1,0Фосфоенолппровинограднаякислота 0,04 - 0,4Л актатдегидрогеназа 0,05 - 0,5 Сывороточный альбумпн 0,01 - 0,2 Глице,ринкиназа 0,005 - 1,0 Кар бсксилэстераза 0,05 - 2,0 Додецилсульфат натрия 0,001 в ,02 Фосфоенолкиназа 0,02 - 0,5 Сульфат магния с содержанием,ионов магнияБуферИсточники снформацпс, принятые во60 внимание при экспертизе:1.оп Нагс 1 е 1 Е. Ъ., Ъсегзспс Р. В., 1.с аЬ С 11 п, Мед. 1957, 50 р, 152 - 157.2. Вцсо 1 о Сс. е 1 а 1, Мес 1 сап 1 гес 1 Епгппа 11 сРе 1 еггпша 11 оп о 1 Тпд 1 усепс 1 еэ 1 п Яегцсп, 65 С 1 ш. Осетп. 975 2 /3 о дои юг 0,007 - 0,07 остальное 10110 206 197 305 506 110 205 197 305 56 110 205 20305 506 Формула изобретения 100,9 100,0 100,3 100,2 100.8 6,7 100,2 99,8 100,6 99,0 100,0 100.0 09 99,7 97,2