5-(n -сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил) аминонафталин-i-(n-пропил) сульфамид в качестве анса субстрата для определения химотрипсина и 5-(n бензилоксикарбонил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил) аминонафт

(57) Испольэ гической хим ределения иэобретени нил-пролил- -1-(й-пропил х=Яцси 5-(й -бензилоксикарбонил-аланил-аланили ролил-фен ил алан ил)-амин о нафталин-(й -пропил)сульфамид, 1 б, (Х = Е), в качестве подупродукта для получения 1 а. Реагент 1: (й -бенэилоксикарбонил аланил-аланилпропил-фенилаланил)аминонафталин-(й-пропил)сульфамид, полученный путем. взаимодействия й -бензилоксикарбонил фенилаланина с 5-аминонафталин-(йпропил)сульфамидом, деблокированием полученного продукта, постепенным наращиванием пептидной цепи до соединения 1 б и деблокированием последнего. Реагент 2: ангидрид янтарной кислоты. Процесс ведут в смеси ТГФ и ДМФА при 80 С, 1 а, 58, СзтНатйв 509 (а)О = -18,0 (0,5(, ДМФА). б С 41 Н 49 йвЯОв (а)У - 12,47 (1 (, ДМФА). в качеств мотрипси А 1 а-Аа-Р пил)сульф продукта найти пр гической Иэве ных субсИзоб ческим со нил-А 1 а-А пропил)су Мретение относится единениям, а име а-Рго-Р 1 е)-аминон льфамиду формул а"А 1 а-Рг В-РЬе-Н) но хим е субстрата для о на и 5-(й,-бенэи о-Р 1)е)-аминонафт амиду формулы 1 б для получения 1 а именение в медиц химии.тен ряд синтетиче ратов для определ пределения хи- оксикарбониллин-(й-про качестве полкоторые могу нской и биолоно 5-(й,-сукциафталин-(й 1 а У т Нт цс (1 г,. цс (1 б) ских хромогенения химотрипГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт биохимии Литовской АН и Институт молекулярной генетики АН СССР (72) Р.А,Янчене. А,И,Палайма, А.А,Недоспасов и Р,И,Матуляускене(73) Институт биохимии Литовской АН (5 б) Месс 1 осз и Емутооду чо. 80, Ргосеоусс Еп 7 увез, Рагс. С, й в опбоп, 1981, ес 1, бу.1 огавс, й.оссепЬегд ц др, "Аззау о 1 соадцасоп Ргосеазез цзлд Рерсс 1 е СЬгогподепе апс 1 Г 1 цгодепе БцЬзсгасез", раде 341 - 361,Недоспасов А.А Незавибатько В,Н. и др, "Возможный подход к анализу смесей протеаз" известия АН СССР серия биологич 1989, т,. 15, й. 1, с. 128.(54) 5-(й,;СУ КЦИ Н ИЛ-АЛАН ИЛ-АЛАНИЛПРОЛИЛ-ФЕНИЛАЛАНИЛ)-АМИНОНАФТАЛИН-(й-ПРОПИЛ)СУЛЬФАМИД В КАЧЕСТВЕ АНСА-СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИМОТРИПСИ НА И 5-(й -БЕ НЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-АЛАНИЛ-АЛАНИЛ-ПРОЛИЛ-ФЕНИЛАЛАНИЛ)-АМИНОНАФТАЛ И Н-(й-П РО ПИЛ) СУЛ Ь ФАМ ИД В КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТА ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ ование; в медицинской и биолоии как АНСА-субстрат для опхимотрипсина, Сущность : 5-(й-сукцинил-аланил-алафенилаланил)-аминонафталин сульфамид формулы 1 а: А 1 а-Иа-РО-Рье-Н 11- с-сн-с-сн=снр 1СН:С-С-СН=СЬО ННСЗН 7ферментов методом АНСА-анализа, 40 Поставленная цель достигается новымиспользованием нового 5-(К-бензилокси 50 сина на основе п-нитроанилина, 2-нафтиламина, и-метохси-нафталамина и др, Эти субстраты обычно успешно используют для определения только одного фермента в исследуемой про.бе (1).Описываемое соединение используется в АН СА-анализе.АНСА-анализ - новый метод анализа смесей протеаз, в том числе как близкой так и различной специфичности, Идея метода состоит в использовании в одном анализе смеси нескольких субстратов, с определением продуктов протеолиза каждого из них,Для реализации метода в варианте с применением хромотографии предложены хромогенные субстраты с аминонафталинсульфамидными детектируемыми группами. Найболее близкими по структуре являются пептидильные производные 5- аминонафталин-сульфамидов (2). Например, 5-тозилглицил-пролил-аргиниламинонафталин-(Й-пента метилен)сул ьфа мид для АНСА-анализа трипсина, Однако трипсин и химотрипсин, являющиеся сериновыми протеазами, различаются субстратной специфичностью, Указанный пептидильный производный Тозу-РгоАг 9-АНСА, как и другие известные АНСА- субстраты практически не расщепляются химотрипсином. Поэтому они не могут быть использованы в качестве АНСА-субстрата при определении химтрипсина.Целью изобретения является поиск в ряду замещенных пептидильных производных аминонафталинсульфамидов новых соединений, позволяощих при использовании их в качестве детектируемых групп для АНСА-анализа определить химотрипсин,т,е. увеличить количество анализируемых 5-(й,-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)-амин онафталин-(И-пропил) сульфамидом в качестве АНСЛ-субстрата и карбонил-аланил-аланил-пролил-фенилалан ил)-а ми н о нафталин-(К-и роп ил)сул ьфамида в качестве полупродукта для его получения.Изобретение иллюстрируется примерами (схема синтеза прилагается),П р и м е р 1. 5-(Бензилоксикарбонилфенилаланил)аминонафталин-(М-пропил) сульфамид (а). К раствору 2,99 г (0,01 моль) (М -бензилоксикарбонилфенилаланина и 1,4 мл (0,01 моль) триэтиламина в 50 мл абс, тетрагидрофурана (ТГФ) медленно добавляют 1,37 г (0,01 моль) хлорангидрида изобутилового эфира муравьиной кислоты при перемешивании при -18 С. Реакционную 5 10 15 20 25 30 35 смесь выдерживают 15 мин. при этой температуре, образуется осадок хлоргидрида триэтиламина, после чего добавляют раствор2,64 г (0,01 моль) 5-аминонафталин-(Мпропил)сульфамида в 20 мл абс, ТГФ. выдерживают 1 ч при -18 С и 2 ч при 20 С.Осадок отфильтровывают, растворительупаривают досуха, осадок растворяют в этилацетате, промывают 1 н, раствором НС. 5% раствором КаНСОз и водой, сушат и упаривают досуха. Полученный продукт три раза промывают кипящим эфиром иотфильтровывают, Получают 3,54 г (выход65 %) соединения (а) (Е-Рйе-АН СА-Рг) с т. пл.196-197 С, Я = 0,72 (СНС 3-этилацетат-метанол в соотношении 14:7:1 соответственно).Найдено, %: С 66,4 Н 5,7 3 5,7 К 7.8СзоНз 1 йз 053,Вычислено, %: 66,0 5,7 5,9 7,7:Спектр ПМР ( д, м,драстворительДМСО-бб): 0,64 (СНз, т, ЗН), 1,22 (СН 2. СК.,2 Н), 2,69 (КСН 2, 2 Н), 3,02 (СН 2 РЬ Н), 4,59(Е-РЬе-АНСА-Рг) растворяют в 30 мл 3 н,раствора НВг в уксусной кислоте и перемешивают на магнитной мешалке в течение 2ч. Реакционную смесь разбавляют абс. эфиром и отфильтровывают выпавший осадок,который на фильтре несколько раз промывают эфиром. Получают 2,85 г (выход 90 %)продукта (б) (РЬе-АНСА-Рг Н Вг) с т, пл. 220222 С, Яг = 0,67 (бутанол-уксусная кислотавода в соотношении 4:1:2), (п)Ъ = 24,7 (1 %диметилформамид) (ДМЕ).Найдено, %: С 54,0 Н 5,3 М 8,4 5 6,2 Вг15,9,С 22 Н 2 ЛзОзЯ В г.Вычислено: 53.7 5;3 8,5 6,5 16,2,Спектр ПМР( д, м,д., растворительДМСО дв): 0.64 (СНз, т, ЗН), 1,24 (СН 2, секс.,2 Н), 2,31 (МСН 2, 2 Н), 3,2 (СН 2 РЬ, 2 Н), 4,47(7,1 ммоль) триэтиламина растворяют в30 мл абс, ТГФ, охладжают до -20 С. добавляют при перемешивании 0,68 мл (7,1 ммоль)этилхлорформиата и выдерживают при 20 С 20 мин, К полученному смешанномуангидриду прибавляют предварительноподготовленный (охлажденный и отфильтрованный) раствор 3,5 г (7,1 ммоль) соединения (б) и 0,99 мл (7,1 ммоль) триэтиламинав 40 мл абс. ТГФ, Реакционную массу перемешивают при температуре -20 С 1 ч и 1 чпри комнатной температуре. Реакционный 5раствор фильтруют, упаривают досуха, остаток растворяют в этилацетате, промывают последовательно 1 н, раствором НС 1,5%раствором КаНСОз и насыщенным раствором йаС 1, сушат, упарива,от, заливают абс. 10эфиром, Выпавший осадок отфильтровывают, Получают 2,15 г(выход 50 0 ) соединения(а)Ь = -26,18 (1 0 , ДМ Е),Найдено, 70: С 63,2 Н 6,5 35,2 й 8,9.СЗ 2 Н 40 К 4065,Вычислено,; 63,1 6,6 5,3 9,2.Спектр ПМР ( д, м.драстворительДМСО 6): 0.62 (СНз, т, ЗН), 1,16 (СНз, с, и4 СН 2, КН), 1,64 (2 СН 2, 4 Н), 2,68 (СНгй, кв.,2 Н). 3,1 (СН 2 РТ, 2 Н), 3,28 (СН 2, 2 Н), 4,07 (СН,1 Н), 4.82 (СН, 1 Н), 7,24 (Ар, 6 Н), 8;49 (К Н, 9,1 Н), 10,2 (КН, с. 1 Н),П р и м е р 4, 5-(Пропил-фенилаланил)аминонафталин-(К-пропил)суп ьфамида гидрохлорид (г), 1,3 г (2 ммоль) соединения (в) растворяют в 15 мл 3 н. раствора НС 1в уксусной кислоте и перемешивают в течение 1 ч, Реакционную смесь разбавляютабс. эфиром и отфил ьтровы вают вы павшийосадок, который на фильтре промывают све-.жим эфиром. Получают 1,09 г (выход количественныйй) хроматографически однородноговещества, Вт = 0,4 (бутанол-уксусная кисло 35та-вода в соотношении 4:1;2).П р и м е р 5. й -Бензилоксикарбонилаланил-аланин (д). Раствор 10 г (62 млоль)аланил-аланина и 11,6 г (109 ммоль) йа 2 СОзв 75 мл воды охлаждают до 0 С и при энергичном перемешивании добавляют 13,64 г(80 ммоль) карбобензоксихлорида, Реакционная смесь в течение всего времени долкна оставаться слабощелочной. После4-часовой выдержки раствор осторожноподкисляют до рН 2 конц, НС 1. Осадок отфильтровывают, высушивают, растворяют вэтилацетате, промывают 1 н, растворомНС. водой и экстрагируют растворомКа 2 СОз. Экстракт подкисляют конц, НС 1,50выпавший осадок отфильтровывают и высушивают, Получают 11,6 г (выход 68 0 ) соединения (д) с т. пл. 147-148 С, Вт = 0,47(йН 2 Н) П р и м е р 6. 5-(К,-Бензилоксикарбонил-алан ил-алани п-пропил-фен илаланип )ами- нонафталин-(К-пропил)сульфамид ( б), 0,65 г(2,2 ммоль) соединения (д) растворяют в 15 мл абс, ДМЕ, охлаждают до -10 С, добавляют последовательно при перемешивании 0,31 г (2,4 ммоль) оксибензтриазола, 0,59 г (2,4 ммоль) й,й -дициклагексилкарбодиимида (ДЦК) и выдерживают при -10 С 30 мин. Затем к реакционной смеси прибавляют предварительно охлажденный раствор 1,21 г (2,2 ммоль) соединения (в) в 10 мл абс, ДМЕ. Реакционную массу перемешивают 30 мин., добавляют 0,3 мл (2,2 ммопь) триэтиламина и оставляют на 24 ч, Смесь отфильтровывают, выливают в 0,5 л Н 20, продукт экстрагируют этилацетатом, экстракт промывают раствороми 5 0 КаНСОз,н. НС 1 и насыщенным раствором йаС 1, высушивают над М 9504, упаривают, заливают абс. эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают. Получают 0,78 г (выход 430 ) соединения (1 б). Вт = 0,47 (хлороформэтилацетат-метанол в соотношении 14:7;1), (й) = -12,47 (1 %, ДМ Е).Найдено, 0 т 0; С 62,26 Н 6,49 5 3,81, Со НлойвЯО 8.Вычислено,: 62,55 6,28 4,07.Спектр ПМР ( д, м.д., растворитель ДМСО 1 ь): 0,6 (СНз, т. ЗН), 1,12 (две СНз, 29 перекрываются с ЗСН 2. 12 Н), 2,64 (КСНРП, кв., 2 Н), 2,89 (СН 2 Р., 2 Н), 3,36 (КСНРП, 2 Н), 3.98 (СН, 2 Н), 4,26 (СН, 1 Н), 4,76 (СН, 1 Н), 4,93 (СН 2, с, 2 Н), 7,22 (Ар, 10 Н), 7,22-8,21 (Ар, КН. 9 Н), 8.46 (КН, д, 1 Н). 10,03 (КНРт, с, 1 Н).П р и м е р 7, 5-(Аланил-аланил-пропилфенилаланил)аминонафталин-(К-пропил) сульфамида гидробромид(е). 7,2 г (8,7 ммоль) соединения ( б) (Е-Аа-А 1 а-Рго-РЬе-АНСА) заливают 90 мл 3 н. раствора НВг в СНзСООН и перемешивают 1 час при комнатной температуре, Затем прибавляют 400 мп абс. эфира, продукт выпадает после охлаждения. Осадок быстро отфильтровывают, промывают несколько раз эфиром и высушивают над Р 20 в вакууме. Получают 5,4 г (выход 82 0 ) хроматографически однородного вещества (е) в виде мелкокристаплического порошка, Вт = 0,69 (5 утанол-уксусная кислота-Н 20 в соотношении 4:1:2),П р и м е р 8. 5-(К;Сукцинил-аланилаланил-пролил-фенилаланил)алинонафталин-(й-пропил)сульфамид (1 а). 3,5 г (4,8 ммоль) соединения (е) (Аа-Аа-Рго-Рте- АНСА-Рг НВг) растворяют в смеси 100 мл абс. ТГФ и 5 мл абс, ДМЕ, прибавляют 0,48 г (4,8 ммоль) ангидрида янтарной кислоты, нагревают при 80 С 2 ч., раствор охлаждают1771478 Зк-ЛЩ-Л 1 а-Рго-Рье-Ннг 1 Уоао,ниса фго) ойнсн Составитель Р. ЯнченеТехред М.Моргентал Корректор А. Мотыль Редактор Заказ 3754 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 и прибавляют 350 мл абс. эфира. Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают и сушат под Р 205. Получают.2,1 г(выход 58 %) (1 а) (Яцс-А 1 а-А 1 а-Рго-РЬе-АНСА-Рг); Й = 0,78 (бутанол-уксусная кислота-Н 20 в соотношении 4:1;2), (а)Р =-18,0(0,5% ДМР).Найдено, %: С 56,37 Н 6,69 Я 4,39.С 37 Н 47 йб 309 2 Н 20.Вычислено, %: 56,40 6,52 4,07,Спектр ПМР ( д, м.д., растворитель ДМСО б 6): 0,69 (СНз, т, ЗН), 0,93-1,42 (две СНз и три СН 2, 12 Н), 2,44 (ОССН 2 СН 2 СО, перекрываются с сигналом растворителя), 2,62-3,23 (СН 2, 6 Н), 4,23 (СН, ЗН), 4,78 (СН, 1 Н), 7,07-8,14 (Ар и йН, 14 Н), 8,51 (йН, с 1, 1 Н), 9,9 (й Н, с, 1 Н).П р и м е р 9, Анализ химотрипсина и трипсина. К 0,35 мл субстратной смеси, содержащей по 3,5 О.Е, (у 1,= 300 нм)/мл 5- (й,;тозил-глицил-пролил-аргинил)аминонафталин-(й-бутил)сульфамида (субстрат трипсина р тромбина) и Бис-Аа-Аа-РгоРЬе-АЙСА (1 а, субстрат химотрипсина), 0,1 О,Е,(Л =340 нм)/млдансилвалина(внутренний стандарт) в 0 05 М трис-НО буфера рН 7,4 добавляют 10 мкл водного раствора одного или другого фермента (фермент разводят до концентрации, обеспечивающей гидропиа 1 16 субстрата в 1 мин, перемешивают, инициируют 2 мин п ри 37 С, добавляют СНзСООН до рН 4,3, перемешивают, .добавляют 0,5 мл смеси этилацетат, гексан (2:1), перемешивают верхний слой отделяют, высушивают досуха. Остаток растворяют в 0,05 моль ацетата аммония в 35%-ном ацетонитриле, хроматографируют на колонке ЕогЬах С(4,6 250 мм) при 40 С и скорости потока 1 мл/мин и определяют АНСА додетекции по поглощению при Х =-254 нм,При использовании тромбина и трипсина на хроматограмме присутствует только пик 5-амин она фталин-(й-бутил)сул ьфа мида ( 99 %, время удержания 10,60 мин), при 5 использовании химотрипсина - только пик5-аминонафталин-(й-пролил)сул ьфамида ( 99 %, время удержания 6,65 мин),Таким образом использование предложенного соединения 1 а в качестве субстрата 10 позволяет качественно определить химотрипсин и увеличить количество анализируемых ферментов при АНСА-анализе, а использование соединения 16 в качестве полупродукта - получить необходимый целе вой продукт 1 ат Формула и зоб рете н ия1. 5-Щ-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафталин-(й-пр 20 опил)сульфамид формулы а в качестве АНСА-субстрата для определения химотрипсина2. 5-(й-бензилоксикарбонил-аланил аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафталин-(й-и ропил)-сульфамид формулы 1 б в качестве полупродукта для получения АНСА-субстрата химотрипсина формулы а.40