Способ выделения над-зависимой формиатдегидрогеназы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19 И 9/ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Сп разоь Экн ом у пи ажд уп хрома сорбе честв т в ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) 1 отт С, Т., Раге К. 1., 1.язвс 1 п А. , Вагпяде 1., ИА 0-1,т.псед Гогтпяге депудго 8 епязе Гготп тпеспапо 1яготтп Р 1 стта разсог 1 я КК 1,-У, -АгсЬ, В 1 остетп. В 1 орЬув, 1982 ч. 216,1, 296-305,ЕВогоч А.М Ач 11 оча Т.Ч, Птс -1 соч М. И., Ророч Ч. О., Нод 1 опоч Ти. Ч.,Вегез 1 п 1.Ч. 1 АП-Перепдепг Гогтпясес 1 е 1 судгояепаве Гготп тпеспу 1 осгарЬдсЬассег 1 иш, зсгядп 1, Гиг, в ,1. Вдовсйспт., 1979, ч99,3, 569-576,(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИУ НАД-ЗАВИСРМОЙФОРМИАТД,ГИДРОГЕНАЗЫ 1 зобретение относится к биохимии и касается способа выделения и очистки НАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2,1,2.), которая является базовым ферментом для создания на ее основе систем регенерации кофактора (НАДИ), которые в свою очередь могут быть использованы в тонком органическом синтезе, биохимическом анализе, медицинской диагностике.Цель изобретения - увеличение1 удельной активчости препарата и упрощение процесса.(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именна к способам выделения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2,1,2). Цель изобретения -увеличение удельной активности препарата и упрощение процесса, Ферментвыделяют следуюптим образом: экстрактприготовленньпт разруп:ением клеточнойсуспензии, осаждают сульфатом аммония до насыщения 40%, а супернатантбез обессоливания подвергают гидрофобной хроматографии в условиях нисходящего градиента ионной силы на носителе, содержащем в качестве заместителя октильную группировку, Удельная активность препарата 11 мкмоль//мин мг, Выход 53%. Для достижениябольшей степени очистки проводят дополнительную очистку методом разделения белков по молекулярной массе,После очистки гель-проникающей хроматографией получают препарат ферментас удельной активностью 15 мкмоль//мин мг и выходом 40%. 2 з.п. ф-лы,1 табл. особ осуществляют следующим обтракт, приготовленный разрушелеточной суспензии в ультразвудезинтеграторе или разрушением женных клеток на Х-прессе или соответствующим способом, ют 40%-ным сульфатом аммония, рнатант подвергают гидрофобной аграфии, используя в качестве а носители, содсржащие в казаместителей актявную группи - (октил-сефяроэя, акти.т-сило 1479512 хром, октил-агароза) н услониях нисходящего градиента ионной силы элюирующега буфера. Удельная активностьполученного препарата составляет511 мкмоль/мин мг, что позволяет использовать его н практике, Основнымипримесными компонентами после стадиигидрофобной хроматографии являютсянизкомолекулярные пигменты и дна белка с молекулярными массами около 150и 10-25 кЛа соответственно. Для достижения большей степени очистки целесообразно дополнительно провести очистку методом, позволяющим разделитьбелки по молекулярной массе, например, последовательным пропусканиемпрепарата через мембраны (полые волокна) с отсекающей молекулярной массой около 100 и 30 кДа соответстненно или гель-фильтрацией на носителях,позволяющих осуществлять Фракционировацие белков н диапазоне молекулярныхмасс 20-200 кДа (например, ТойоперлНИ 55 (Тойо-Сода, Япония), Сефакрил 258-200, Сефадекс С(Фармация, 1.1 веция), ультрагель АсА(1.КВ, 11 неция.Все стадии выделения и очистки проводят в присутствии 0,01 М ЭДТА н качестве стабилизатора Ферментатинноиактивности. После очистки гель-проникающей хроматографией получают препарат фермента с выходом 407, и удельной активностью 15 мкмоль/мин мг.11 р и м е р 1. 50 г клеток Гзеи 35йойопан зр.101 суспендируют н 50 мл0,1 М калий-Фосфатцого буфера, 0,01 МЭДТА, рН 7,8. Разрушение проводят цаультразвуковом дезинтеграторе УЗДНв положении максимального резонанса(частота 20 кГц, мощность 0,3 Вт) нтечение 20 мин при охлаждении. Температура клеточной суспензии не должна/мин вмиг,К разрушенной клеточной суспецзиидобанляют при необходимости препарат50ДНК-азы для разрушения нуклеиновыхкислот, увеличивающих вязкость суспензии, и оставляют на 30 мин.Клеточную суспензию центрифугируют 60 мин при охлаждении при 15000 н,для удаления крупных клеточных и субклеточных частиц, Активность фермента 5500 мкмоль/мин. Удельная активность 0,6,мкмоль/минмг,К гомогенату порциями при постоянном переменгинании добавлякл насыщенный раствор сульфата аммония н0,05 М калий-фосфатном буфере, 0,01 МЭДТА, рН 7,8 до конечной концентрации сульфата, равной 407Через 12 ч раствор центрифугируют 30 мин при охлаждении при 15000 я,Осадок отбрасывают. Активность фермента 4900 мкмоль/минУдельная активность 0,7 мкмоль/мин мг.Свежий или регенериронанный носитель (октил-сефароза С 1.-4 В, Фармация,Швеция) помещают н колонку 50 х 100 ммобъемом около 200 мл и уравновешивают его 0,03 М калий-Фосфатным буфером, 0,01 М ЭДТА, 307 сульфат аммония, рН 7,8. Раствор Фермента наносят на колонку со скоростью от 2 до10 мл/см ч и промывают исходным буФером, 11 осле элюции белков, не сорбирующихся на гидрофобном носителе,формиатдегидрогенаэу элюируют линейными нисходящим градиентом 307-ногосульфата аммония в 0,03 М калий-фос-.фатном буфере, 0,01 М ЭДТА, рН 7,8,суммарным объемом 500 мл. Объединяютфракции Фермента с удельной активностью от 9 до 11. Фракции с удельной активностью от 5 до 9 могут бытьиснользонаны при очистке гидрофобнойхроматографией следующей партииФермента. Активность фермента2900 мкмоль/мин, Удельная активность10 мкмоль/мин мг,П р и м е р 2, Способ осуществляютсогласно примеру 1, но после стадиигидрофобной хроматографии объединенные фракции фермента концентрируютдо объема 25 мл ультрафильтрацией,используя мембраны или полые волокнас отсекающей молекулярной массой10 кДа, Раствор фермента наносят наколонку объемом 1,5 л (50 х 750 мм)с сефакрилом 8-200, уравновешенным0,05 М калий-фосфатным буфером, 0,01 МЭДТА, рН 7,8. Скорость нанесения формиатдегидрогенаэы до 2 мл/см.ч. Формиатдегидрогенаэа элюирует в объеме800-1100 мп, Объединяют фракции судельной активностью от 14 до 16.Фракции с удельной активностью от 9до 14 могут быть использованы приочистке гель-проникающей хроматограФией следующей партии фермента. Активность Фермента 2200 мкмоль/минУдельная активность 15 мкмоль/мин мг.Выход 407римеры 1 и ,. иллюстрируются таблицей.П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 2, но дезинтеграцию проводят на Х-прессе, 50 г размороженных клеток Рзецдошопаз зр.101 помещают в ячейку для разрушения, которую замораживают жидким азотом или смесью сухого льда с ацетоном. Разрушение производят постепенно повышая давление до .10 т/см . Процедуру разрушения повторяют два раза, Удельная активность 15 мкмоль/миг мг, Выход 35 .П р и м е р 4, Способ осуществляют согласно примеру 2, но дезинтеграцию проводят перетиранием клеток со стеклянными бусами. 50 г клеток суспендируют в минимальном объеме 0,1 М калий-Фосфатного буФера, 0,01 М ЭДТА, рН 7,0 и добавляют равный объем стеклянных бус (шариков) диаметром 0,3- 0,5 мм. При 1700 об/мин время разрушения составляет 20 мин. Удельная активность 15 мкмоль/минсмг. Выход 35П р и м е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 2, но на стадии гидрофобной хроматографии вместо октилсефарозы используют октил-силохром. Колонку с носителем (220 мл) уравновешивают 0,1 М калий-Фосфатным буфером, 0,01 М ЭДТА, 40/-ным сульфатом аммония, рН 7,0, Препарат фермента промывают 2 л 0,1 Г 1 калий-Фосфатного буфера, 0,01 М ЗДТА, 30 -ным сульфатом аммония, рН 7,0 и элюируют линейным нисходящим градиентом общим объемом 1000 мл 30 -ного сульфата аммония в О, 1 М калий-Фосфатном буфере, 0,01 М ЭДТА, рН 7,0. Скорость элюции составляет до 10 мл/см, ч. Объединяют фракции с удельной активностью более 9 мкмоль/мин мг. Удельная активность 13 мкмоль/мин мг. Выход 35П р и м е р б, Способ осуществляют согласно примеру 1, но вместо клеток Рзеидошопаз зр. 101 берут клетки СапсЫа шееЬУ 1 са. Общая активность фермента в бесклеточном экстракте после разрушения 50 г клеток составляет 1000 мкмоль/мин, Удельная активность собранных Фракций после гидрофобной хроматографии - 8 мкмоль/мин мг, Общая активность 500 мкмоль/мин, Выход 50 .П р и м е р 7. Способ осуществля. ют согласно примеру 2, но на стадии гидрофобной хроматографии вместо ок 15 40 45 50 ную группу. 55 5 10 20 25 30 35 тил-сефарозы используют октил-агарозу (Сигма, США). Колонку с носителем1 (200 мл) уравновешивают 0,1 И калийФосфатным буфером, 0,0 1 Г ЗДТА, 40 . - ным сульфатам аммония, рН 7,0. Препарат Фермента наносят на колонку, промывают 500 мл исходного буфера и элюируют линейным нисходящим градиентом общим объемом 500 мл 40 -ного сульфата аммония в 0,1 И калий-фосфатном буфере, 0,01 И ЭДТА, рН 7,0. Скорость элюции составляет 0,5- 1,0 мл/см.ч, Удельная активность 10 мкмоль/мин мг. Выход 30 ,П р и м е р 8, Способ осуществляют согласно примеру 1, Далее после стадии гидрофобной хроматографии объединенные фракции фермента очищают путем разделения по молекулярным массам методом ультрафильтрации с использованием мембран "Амикоп (Голландия), К исходному раствору по мере его Фильтрации добавляют 1 объем (от 50 до 100 мл) 0,05 И калий-Фосфатного буфера, 0,01 И ЭДТА, рН 7,8. На первом этапе используют мембраны ХМс отсекающей молекулярной массой 100 кДа. На втором этапе элюат очищают и концентрируют с испсльзованием мембран РИс отсекающей молекулярной массой 30 кДа, Уд льная активность Фермента 12 мкмоль/минамг. Выход 201.Формула изобретения 1, Способ выделения НАД-зависимой Формиатдегидрогеназы, включающий фракционирование сульфатом аммония гомогената клеток микроорганизма-продуцента с последующей хроматографической очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения удельной активности препарата и упрощения процесса, очистке подвергают супернатант, полученный после осаждения сульфатом аммония, а хроматографическую очистку выполняют методом гидрофобной хроматографиии в условиях нисходящего градиента ионной силы на носителях, имеющих в качестве заместителей октиль 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что осаждение сульфатом аммония ведут до степени насьшения 40 .1479512 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й. с я тем, что после гидрофобной хроматографии осуществляют дополнительную очистку методом разделениябелков по Молекулярной массе. Очистка,раэСтадия очистки Общий Общая ак- Удельнаябелок, тивность, активность,мг мкмоль/мин мкмоль/мин.мг Выход по активности, 7 Гегклеточный О,б 8700 5500 100 7000 4900 0,7 1,1, 90 290 2900 1 О 17 53 щая хроматография на сефакриле 145 2200 . 40 П р и м е ч а н и е, Очистка бактериальной формиатдегидрогенаэы на 50 г биомассы Гяеидотдопая яр,101. Редактор М,Недолуженко акая 2504725 Тираж 501, ПодписноеБНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ. СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,01 экстрактФракционирование 4 И сульфатом аммонияГидрофобнаяхроматографияна октил-сефароэеГель-проникаюСоставитель А,СеменовТехред М.Ходанич Корректор М.Максимишинец