Способ получения формиатдегидрогеназы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ЯО 14795 1 3 д 5 дС 12 И 9/04 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ ЕН л. 918Ломоносова, ИнстиА.Н.Бахаственное объединеВ,В,Карзанов,вилова, А,М.ЕгоР,Й.Петкявичене.8) Ач 11 Еой 1 опоу ч Ч.О.,Ч. -Ецг. . В 69-576. етельство СССР 2 И 9/04, 1976 1 ос носится к микробиоленности, а именно бретение о ачестве топливаат, а также в научспольз етанол его и шо логическойк способу пформиатдеги ромы луче ния НАД-зависимои азы, и может быт роцессе полученйя роге в и использован чески активных различных физиолог соединений (аминок слоты, стероиды,истемой регенерапирты и т. д.) с ии НАДН на основ азы, для количес формиатде гидрогеецного определеоты (формиат-иогических смесях ния муравьиноина) в сложных(сыворотка кроды, пищевые прбиохимического с ол и, культуральные сре дукты), для создания топливного элемента,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР А ТОРСО СМДТЛСТ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОРМИАТДЕГИД -РОГЕНАЗЫ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и можетбыть использовано для промышленногополучения формиатдегидрогеназы.Целью изобретения является повышениевыхода фермента за счет снятия ре-.прессии его биосинтеза, вызываемогометаллами, входящими в материал ферментера. Культивирование метилотрофных бактерий Ряецйошопая яр. 101ВКМ ВД, продуцирующих формиатдегидрогеназу, осуществляют на синтетической питательной среде, содержащейисточники азота, фосфора, минеральныесоли и метанол в качестве единственного источника углерода и энергии,в присутствии 10- 10 М вольфраматиона. Удельная активность достигает1700 нмоль/мин на 1 мг белка, 2 табл. ных целях.Цель изобретения - повышение выхода формиатдегидрогеназы за счет снятия репрессии биосинтеза фермента под действием легирующих добавок покрытия ферментеров.Способ осуществляется следующим образом.Бактерии Ряецдошопая яр. (101) ВКМ В-.1545 Д культивируют на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: КНРО 2,0, сульфат аммония 2, 0; хлорид натрия 0,5; суль 1479513Фат магния семиводный 0,02 г 5, растворимая соль вольфрамовой кислоты (калия, натрия, аммония и т. д.) как источник вольфрамата-иона 10- 10 М 1 дистиллированная вода, Среду стерилц 5 зуют в течение 20 мин при 1 атм, рН среды после стерилизации 7, 2. Отдельно готовят 10 - ный раствор дрожжевого автоли - эата, который стерилизует в течение 20 мин прц О, 5 атм и вносят в среду из расчета 0,1-10 мл на 1 л среды. Метанол не стерилцэуют и добавляют к среде до концентрации 1 . Посевной материал вносят в количестве 2-515 Культивирование проводят в 100 л ферментере при 28 С,расходе воздуха О, 5: 1 в течение 45-52 ч. Удельная активность формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составляет 1 б 00- 20 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. Выход биомассы 250-300 г сырых клеток.Наиболее оптимальной является концентрация вольфрамат-иона от 1 Г до 10М, В указанном диапазоне 25 концентраций удельная активность формиатдегидрогеназы практически одинакова и составляет 1 б 00- 1700 нмоль/мин на 1 мг белка. При повышении концентрации вольфрамат-иона З 0 до 10" М происходит резкое снижение скорости роста самой биомассы. При концентрации вольфрамата менее 10М увеличения выхода Фермента не наблюдается.35Исследование влияния ионв металлов на биосинтез формиатдегидрогеназы (табл, 1) показывает, что большинство из них, почти не влияя на общий выход биомассы, вызывает резкое уменьшение активности Формиатдегидрогеназы.Как было показано с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, снижение активности сЬормиатдегидрогеназы при культивировании в присутствии различных ионов металлов сопровождается уменьшением содержания самого Фермента в клетках, т, е, эти ионы вызывают репрессию биосинтеза Формиатдегццрогеназы. Единственным ионом, который не только не подавляет биосинтез Фермента, а наоборот индуцирует увеличение содержания и уровня активности формиатдегидрогеназы в клетках, является вольфрамат 55 ион. Такое влияние вольфрамат-иона на биосинтез Формцатдегидрогенаэы в метцлотрофных бактериях в литератур ных данных не описано, Предполагают,что вольфрамат-ион каким-то образомвлияет на процесс утилизации формца"та клетками. Положительное влияние вольфраматана выход формиатдедрогеназы подтвержден на примере ферментеров различной конструкции, При проведениикультивирования в 100-лцтровых фермен-.терах отечественного производства,фирм "Электролюкс (Ывеция), Нордон",(Франция) и в 15-литровом ферментерефирмы "Нью Браунсвик" (США) величинаудельной активности Формиатдегидрогеназы составила 1000, 80, 92и 410 нмоль/мцн на 1 мг белка соответственно, При проведении культифвирования в присутствии 10 М вольфрамата величина удельной активностинезависимо от типа ферментера составила 1640-1700 нмоль/мин на 1 мгбелка. Выход фермента увеличился нана 70, а в случае других Ферментерон выход возрос в 4-21 раз,Изобретение имеет важное значение,поскольку позволяет проводить крупномасштабное культивирование бактерий Рзецс 1 ошопаз зр. (10,1) ВКМВЛдля получения формиатдегидрогеназынезависимо от марки и объема ферментера с. более высоким выходом.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Метилотрофные бактерии Рзеис 1 ошопаз зр. (101) ВКМВЛ культивируют согласно известному способу в 100-литровом Ферментере отечественного производства наминеральной среде следующего состава,г/л: КНРО 2,0; сульфат аммония 2, О,хлорид натрия 0,5; сульфат магниясемиводный О, 025; вода дистиллированная. рН среды после стерилизации7,2. Во время посева вносят 1 метанола и 0,2 мл 10%-го раствора дрожжевого автолизата на 1 л среды. Посевной материал вносят в количестве2-3 , Режим Ферментации: температура28 С, расход воздуха 1:1, избыточноедавление О, 5 атм, стерилизация при120 ОС в течение 2 ч, паракультурувыращивают 48 ч, Удельная активностьформиатдегидрогеназы в бесклеточныхэкстрактах составляет 1000 нмольНВЛН/мин на 1 мг белка.П р и м е р 2. Метилотрофные бактерии Рзецс 1 ошопаз зр. (101) ВКМ1479513 Таблица ирция/ 1,0 1,1 Мп( ВД культивируют согласно примеру 1, но в ферментере Фирмы "Электролюкс веция), Удельная активность1 Формиатдегидрогеназы в бесклеточных экстрактах составляет 80 нмоль/мин на 1 мг белка.П р и м е р 3, Метилотрофные бактерии Ряецс 1 оюопая яр. (101) ВКМ ВД культивируют согласно примеру 2, но в минеральную среду перед стерилизацией вносят различные концентрации вольфрамата натрия, Влияние концентраций вольфрамат-иона на выход формиатдегидрогеназы представлен в табл. 2. П р и м е р 4. Метилотрофные бактерии Рвецсовопав яр. (101) ВКМ ВД культивируют соглас.но примеру 1, но в минеральную срецу перед стерилизацией добавляют вольфрамат калия в концентрации 10 М. Удельная-4 активность формиатдегидрогеназы составляет 1700 нмоль/мин на мг белкаП р и м е р 5. Метилотрофные бактерии Ряецс 1 ощопая яр, (101) ВКМ ВД культивируют согласно примеру 1, но в ферментере фирмы "Нордон" (Франция). Удельная активность формиатдегидрогенаэы составляет 92 92 нмоль/мин на 1 мг белка.П р и м е р 6, Метилотрофные бактерии Ряецсовопая яр. (101) ВКМ ВД культивируют согласно примеру 5, но в минеральную среду добавляют вольфрамат аммония в концентрации 10 М. Удельная активность Формиатдегидрогеназы составляет 1670 нмоль/мин на 1 мг белка.П р и м е р 7. Метилотрофные бактерии Ряецсощопая вр. 101) ВКМ Контроль /отечественный ферментер/Контроль /ферментер ф мы Электролюкс , Шве МоО2 ВД культивируют согласно примеру 1, но в Ферментере фирмы "цьюБраунсвик" (СШЛ), Удельная активностьформиатдегидрогеназы составляет5410 нмоль/мин на 1 мг белка.П р и м е р 8, Метилотрофные бактерии Ряецсогпопая яр, (101) ВКИВД культивируют согласно приме 10 ру 7, но в минеральную среду добавляют вольфрамат натрия в концентрации 10 М. Удельная активность формиатдегидрогеназы составляет1640 нмоль/мин на 1 мг белка,15 Как следует из результатов экспериментов, приведенных в примерах 1-8,добавление в минеральную среду растворимой соли вольфрамовой кислотыпозволяет повысить выход формиатде 20 гидрогеназы и снять репрессию еебиосинтеза в любом типе ферментера,Формула изобретения 25 Способ получения формиатдегидрогеназы, предсматривающий культивирование продуцирующих ее бактерийРяецс 1 ощопая яр. ВКМ ВД в аэроб 1ных условиях на синтетической пита тельной среде, содержащей источникиазота, фосфора, минеральные соли иметиловый спирт в качестве единственного источника энергии и углерода,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повьпцения выхода целевогопродукта эа счет снятия репрессиибиосинтеза формиатдегидрогеназы легирующими добавками материала ферментеров, в среду перед ее стерили зацией вносят растворимую соль вольфрамата в концентрации вольфраматаиона 10-1 ОМ.Сгг Т ЯОд а 2 б л МО Но Удельная активнос атдегидрогенаэы в точных экстрактах нмоль/мин на 1 мг форми склеоццентр ер /п лка 1 2 ер 2) Составитель И.Приваловнко Техред М.Ходанич орректор М,Максимишин дактор М.Недол аказ 2504/25 Тираж 501НИИПИ Государственного комитета п113035, Москва, ЖПодписн оиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул, Гагарина, 1 В (ОН)гСогЕпгг+СгО ль (пр10-810101010"1010 1,03 0,61 0,85 1,12 Нет роста Нет роста 80 81 250 1660 1700 1680 1700 Нет роста о иэебретениям и открытиям при ГКНТ СССР35, Раущская наб., д. 4/5