Способ определения мальтазной активности ферментов

ц) 572496 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик61) Дополнительное к авт. свид-ву22) Заявлено 28.03.76 (21) 2337969/1с присоединением заявки23) ПриоритетОпубликовано 15,09.77, Бюллетень1) М. Кл,Государственный комитет Совета Министров СССР 53) УДК 576.8(088,8) ро делам изобретеии И открытий(72) Авторы изобретения Л. Яровенко ендецкий и Е, С. Павлова 71) Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт уктов брожени СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАЛЬТАЗНОЙ АКТИВНОСТ ФЕРМЕНТОВя параццтрофеццлгллсдующсм,1 ссц, одсодержитрофеццлер срН является омпонсцпреде,к У,оп пнф,опУц вляется повышение за счет контроля вности, являющейся достижения постав- предусматривающем онной смеси, вклюгде ЛЕпвф, и и ЛЕппф, опской плотности окраше нитрофепола (ПНФ) - ния паранитрофенилглю 30 в опыте соответственно. ия оптпчеворов пара- превращеконтроле и- изменцых рапродукткозпда Изобретение относится к области микробиологии, а именно к способам определения мальтазной активности ферментов.Известны способы определения мальтазной активности ферментов путем приготовления инкубационной смеси, включающей ферментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор, причем в качестве обоих субстратов используется мальтоза 11. Мальтазную активность в этих способах определяют по скорости ферментативного гидролиза мальтозы. Из известных способов определения мальтазной активности ферментов наиболее близким изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ, предусматривающий приготовление инкубационной смеси, включающей ферментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор - глицерин 12, Однако данный способ является неточным, так как присутствующие в препарате трансглюкозилазы способны образовывать продукты трансглюкозилирования, которые существующий метод не учитывает.Целью изобретения яточности определениятрансглюкозилазной актичастью мальтазцой, Дляленной цели в способе,приготовление инкубаци чающеи фсрмецтцыи препарат, субстрат-до.цор и субстрат-акцептор - глицерин, составляют дополнительную инкубационную смесьбез субстрата-акцептора, сравнивают выход5 глюкозы в обеих смесях и по разности судято трансглюкозилазной активности,В качестве субстрата-донора можно использовать пар анитрофецилглюкозцд илимальтозу,0 Способ использовани окозида заключается в с Состаьляют две ицкуоаццоццые сца из которых является опытной ифермецтный препарат, 0,5% параццтглюкозида (ПНФГ), ацетатцый буф4,7 и 10% глицерина, другая смеськонтрольной и содержит все те же 1ты, за исключением глицерина.Степень трансглюкозилпрованцяется по формуле572496 4Степень трансглюкозилирования Т определяют графически.По значениям выхода глюкозы в контролеУ находят величину мальтазной активности 5УкМА =- 28 0,18 Ь ЛЕп и ЛЕ - изменение оптической плотности проб с глюкозооксидазным реактивом в контроле и в опыте.Мальтазная активность (МА), приходящаяся на единицу препарата, вычисляется по формуле МА=0,18 1 д где У, - прирост глюкозы в контроле за время инкубации, определяемый припомощи калибровочного графика;2 - коэффициент;1 в время инкубации;Ь - концентрация фермента в инкубационной смеси, г/мл,0,18 - коэффициент перевода из мг вмкмоль. где У, - выход глюкозы в мг на 1 мл контрольной инкубационной смеси;1 в время инкубации;О - концентрация фер мента, г/мл.Способ использования мальтозы заключается в следующем.Составляют две инкубационные смеси, одна из которых является опытной и содержит ферментный препарат, 0,05% мальтозы, 0,1 н. ацетатный буфер рН 4,7 и 10% глицерина. Другая смесь является контрольной и содержит те же компоненты, за исключением глицерина,10 15 Ацетатньш буфер 1 и.рН 4,7 1Раствор препарата фермента 6Вода Итого Глицерин ПНФГ 0,25%КонтрольОпыт 2 10 10 0,2 мл 5%-ной соды, Оптическую плотность окраски измеряли на ФЭКМ при синем све тофильтре при длине волны 400 в 4 нм.Выход глюкозы определяли с глюкозооксидазным реактивом по модифицированному методу Далквиста. На анализ брали по 0,5 мл инкубационной смеси, В результате 30 получили данные, приведенные в табл. 1.Значения степени трансглюкозилирования Т вычислили по формулеТ=1ДЕпнф к ДЕу оп1 3ДЕпнф,оп ДЕу,кгде ЛЕпнф,н и ЛЕпнфп - прирост экстинций ПНФ за время инкубации в контроле и в опыте соответственно, ЛЕоп и ЛЕу, - пРирост экстинций проб с глюкозооксидазным 40 реактивом за время инкубации 1 в опыте и вконтроле соответственно, Например, для г=30 минТ=1 4 0 080 0 031 0 240,092 - 0,052 0,141 - 0,040 Использовали препарат, полученный из глубинной культуры гриба Еп(1 отпусорз 1 з зрес 1 ез 20-9. Порошок растворяли в дистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл. Инкубацию вели в ультр атер мостате при 30 С.После указанных в табл. 1 сроков инкубации отбирали из инкубационной смеси пробы около 3 мл и нагревали в кипящей водяной бане 5 мин. В табл. 1 приведены оптические плотности, соответствующие выходу паранитрофенола и глюкозы в системе ПНФГ - глицерин под действием ферментов. 35 Таблица 1 Контроль Опыт Срок пнкубации,мин0,040 0,141 0,225 0,052 0,092 0,120 0,031 0,080 0,128 0,240,26 П р и м е р 2, Система; 0,05% мальтозы - 10% глицерина.Составляли инкубационные смеси из следующих компонентов (мл). Для определения оптических плотностей свободного паранитрофенола к 0,5 мл пробы приливали З,З мл дистиллированной воды и Ацетатный буфер 1 н. рН 4,7 1,0Растворпрепарата Л 1 альтоза 1%Контроль 0,5 Опыт 0,5 Итого Вода Глицерин 10 8,1 0,4 1,0 0,4 1,0 7,1 10 П р и м е р 1. Система: 0,05% паранитрофе 20 нилглюкозида (ПНФГ) - 10% глицерина, Составляли инкубационные смеси из следующих компонентов (мл).572496 Таблица 2 Взято на анализ мл пробы0,66 0,62 0,34 0,28 Формула изобретения Составитель Т. Серебренникова Корректор Л. Денискина Техред Е. Семенов Редактор Е. Хорина Подписное Заказ 2221/15 Изд.763 Тираж 563 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 5Инкубацию вели в ультратермостате при 30 С. После указанных в табл. 2 сроков инкубации отбирали из инкубационной смеси В пробах определяли выход глюкозы (оптическую плотность) с глюкозооксидазным реактивом, Полученные данные представлены в табл. 2, Значения степени трансглюкозилирования (Т) определяют графически. Значения, полученные в системах ПНФГ - глицерин и мальтоза - глицерин, близки.Мальтазную активность рассчитывали по формулеМА==2,1 10 - з мг мл -мин -0,1330 2 В международных единицахМА -290 ед/г,0,18 10 0,4 0,4 10 - згде концентрация препарата, г/мл 10 инкубационной смеси.Способ прост, быстро дает надежную характеристику препаратов. Использование предлагаемой характеристики мальтазной активности с указанием степени трансглюкозилирования дает возможность правильно оценивать эффективность и направление амилолититнческого препарата на различных этапах превращения крахмалистого сырья. пробы около 2 мл и нагревали в кипящей бане 5 мин,1. Способ определения мальтазной активности ферментов, предусматривающий приготовление инкубационной смеси, включающейферментный препарат, субстрат-донор и суб 10 страт-акцептор - глицерин, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точностиопределения за счет контроля трансглюкозилазной активности, являющейся частью мальтазной, составляют дополнительную инкуба 15 ционную смесь без субстрата-акцептора,сравнивают выход глюкозы в обеих смесях ипо разности судят о трансглюкозилазной активности,2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи й ся тем,20 что в качестве субстрата-донора используютпаранитрофенилглюкозид.3. Способ по п, 1, отличающийся тем,что в качестве субстрата-донора используютмальтозу.25 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1, Бендецкий К. М., Яровенко В. Л., Сенаторова Т. П. Биохимия, 1975, т, 40, с, 1135. 30 2. Ьцдачага Я, Стоцгпа 1 Гасц 11 у о 1 Ас 11 сц 11 цге НоЫеЫо Упйегзйу 52, 257, 1962.