Способ определения активности ферментов крови после длительного хранения

(39) П 1) СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСП 4 ЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 3(50 Ь 01 М ЗЗ 48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Алооф аЪ" ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) 1, Мартинек К., Торчилин В. Основные принципы стабилизации ферментов. - В кн. Инженерная знзимология и биоорганический катализ. Итоги науки и техники. Сер, ПБиологическая химия", т.12, 1978, с.17-48.2. Подольский М,В. Высушивание препаратов крови и их заменителей. М., "Медицинаф, 1973, с.130-134. (прототип).(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КРОВИ ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРА.НЕНИЯ путем биохимического анализа пробы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, пробу крови наносят на беззольный фильтр или хроматографическую бумагу, высушивают при комнатной температуре и хранят в течение 1-30 сут без доступа влаги, затем кровь элюируют физиологическим раствором в течение 25-30 мин, определяют активность фермента и зна-. чение исходной активности фермента вычисляют по формуле где А . - активность фермента послехранения образца высушен- .ной крови,а и Ъ - постоянные величины для Екаждого фермента, опре-деленные эмперическимпутем,и - количество суток хране- (ния.45 где Ап - активность Фермента послехранения образца высушенной крови,и ИЬ - постоянные величины длякаждого фермента, определяемые эмперическим путем,П - количество суток хранения.Способ осуществляется следующимобразом.0,01-0,04 мл крови наносят на впи тывающую подложку (например безеольный фильтр, хроматографическуюбумагу и т.п.) в виде нескольких полосок, число которых определяетсяколичеством планируемых, анализов. 60Высохшие образцы крови хранятбез доступа влаги над силикагелемили хлористым кальцием в целофановом пакете и т,.п. ПРедельный срокхранения устанавливается экспери Изобретение относится к биохимий, а именно к способам количественных исследований активности ферментов, и может быть использовано при лабораторных и клинических анализах крови.5Известен способ определения актив. ности ферментов после длительного хранения путем мобилизации их на различных подложках 1 .Однако этот способ длителен, тре бует очистки ферментов, не пригоден для диагностического анализа ферментов крови.Известен также способ определения активности ферментов крови путем 15 высушивания препаратов крови с последующим растворением их в физиологических растворах для дальнейшего биохимического анализа 2 .Однако этот способ длителен, тре бует специального оборудования (леофильная сушка) и не пригоден при заборе и фиксации проб для анализа в полевых условиях.Целью изобретения является ускорение и упрощение количественного определения активности ферментов крови, длительно сохраняемой для диагностических анализов.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности ферментов крови после длиельного хранения путем биохимического анализа, пробу крови наносят на беззольный фильтр или хроматогра" фическую бумагу, высушивают при ком-.35 .натной температуре и хранят в тече-. ние 1-30 сут. без доступа влаги, затем кровь злюируют Физиологическим раствором в течение 25-30 мин, проводят биохимический анализ и значение ис ходной активности фермента определяют по формуле ментально для каждого фермента и обус. ловлен тем, чтобы спонтанное уменьшение активности не превышало 50 от уровня в свежей крови, ХранеНие образцов крови в высушенном виде до 30-60 сут вполне удовлетворяет этому необходимому условию.Затем пятна крови вырезают, элюируют с помощью физиологического раствора на холоде. Для точности анализа условия элюации должны быть стандартными: температура 0-4 С, опО ределенное время (наиболее оптимально 25-30 мин), одинаковое по интенсивности и частоте размешивание проб. В полученном элюате неэамедли" тельно производят определение активности Фермента тем методом. которым пользуются при анализах свежей крови.Искомую величину активности исследуемых Ферментов находят с учетом степени инактиваиииг зависящей от прололжительности хранения образцов высушенной крови,А- 000где Ап - активность Фермента на иФ сутки хранения образцавысушенной крови, измеренная в результате биохимического анализа",поправочный коэффициент,учитывающий степень ин. -активации Фермента наЬсутки,Активностьферментов в образцахвысушенной крови по мере увеличениядлительности их хранения снижаетсяпо сравнению с величинагли в свежейкровиЭто снижение активности Ферментовпроисходит закономерно и математически может быть выражено экспоненциальной кривой типаВ данном уравнении запринимаем .величину сохранения активности Фермента в процентах от исходного уровня,зависимую от длительности хранения образцов высушенной кровиТогдаАп 400 0 Ь" Численные значения а и Ъ являются постоянными величинами для каждого фермента и определяются,экспериментально.Так, для каталазы процент сохранения активности на и сутки хранения крови 75,8+0,987",для глюкозо- -фосфатдегидрогенаэы 97,70,980 п;для холинэстеразы 98,0 п 0,990"для тиоловых групп 77,60,986".1081541 Величина пооцентного сохоанения активности Феоментов найденная в результате экспеоиментальных иссле. дований путем сравнения результатов опоеделения активности Феоментов в образцах свежей и высушенной крови и апробированная на точность анализа, может быть использована пои исследовании феоментных показателей любых образцов крови, сохраняемой длительное время в высушенном виде. 1 О П о и м е о 1. Опоеделение активности глюкозо-б-Фосфатдегидоогеназы в крови.А. Активность фермента в свежей коови белых крыс 4870,18 М НАДФ +(мл)мин. Актйвность Феомента в высушенных обРазцах коови (А 0) на 3 сут хранения 4,32 на 9 сут 388; на 19 сут 3,00. 20Для поовеоки точности способа истинную активность Феомента 4(поепеляли в разные-сроки хоанения обоазцов высушенной крови и получили следующие результаты: Д, 00 75,0(987 5"го 00Ао 75,8 0,987 25 , Б. Активность фермента в кровилюдей до испытаний в свежей крови 5,30 - 0,04.После пребывания испытуемых вэкстремальных условиях активность ферЗ 0 мента составила А(оо т,о (ооо от,т.о,то( ( отт.ото.4,60, 35 Предлагаемый способ позволяетрасширить диапазон использования ферментных показателей при диагностических анализах крови и при лабора О торных биохимических исследованиях;в лабораторных условиях дает возможность производить массовый забор крови для последующего их анализа в любой отдаленный срок в пределах до 45 60 сут, вне лабораторной базы взятыена анализ микроколичества кровимогут быть удобно, надежно и простосохранены и при необходимости транспортированы для последующего иссле О дования в лабораторных условиях, т.е.возможно проводить биохимические исследования на современном научнометодическом уровне. А ОО ( а,4,004( -А:В,та7,7 0 980(5 0 07,7 0 т(8045Дср 002 Я(40 00 (о(о( оо тИ(т 94.Ог,7 0,98 о 07,7 0,98 РщРазница в полученных значениях активности фермента в крови одних и тех же людей свидетельствует об изменении его активности в Результате воздействия неблагопоиятных Факторов внешней среды.ВНИИПИ Заказ 1540/39филиал ППП "Патент", г Применение предлагаемого способапозволит использовать ферментные показатели, как наиболее чувствительные критерии изменения гомостаза, для оценки неблагоприятного действия на организм вредных факторов окружаю щей среды непосредственно на местахпроизводственной или служебной деятельности людей;Тираж 823 Подписное,полученные пои исследовании обоазцов высушенной коови с оазными сосками хоанения близки к опоеделеннымв свежей коови и находятся в поеделах погрешности анализа, что вполне допустимо при биохимических исследованиях.Б. Определение активности глюкозо-фосфатдегидрогеназы в крови людей. По оезттльтатам обследования по (А,)и после (А 0)пребывания испытуемых в экстремальных условиях получено П р и м е р 2, Определение ак,тивности каталазы крови.А. Активность фермента в свежей крови лабораторных животных (белых крыс) 5, б 4 0,25. Активность фермента в высушенных образцах крови этих же животных ца 5 сут хранения 3,82, на 10 сут 3,75, на 20 сут 3,50. Истинная активность фермента с учетом инактивации за эти, сроки хранения йолучилась,582 ЮО Ао - -3810438 75,8 0,0875 3,75 00 Ао0=5,65+0,е; 79,8 0,9874 О