Питательная среда для выращивания фрезий in viтrо

,ь;Г НИЕ ЛЬСТ к биотех- тивироваРАЩИВАИзоб биотехноавов пиин, циу, сание относитс касается новых с г ных а Натрий кислыйщенный сфорно уэамеб 9-17 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИ(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДАНИЯ ФРЕЗИЙ 1 И Ч 1 ТВО д для выращивания рас тканевых культур или ний способомиз меристем,Цель изобретения - увеличение выхода и улучшение роста побегов,В известную питательную среду длявыращивания растений Ы Сго, содержащую натрий фосфорнокислый, аммоний азотнокислый, кальций хлористый,калий азотнокислый, магний сернокислый, калий Фосфорнокислый, железосернокислое, натрий ЗДТА, цинк сернокислый, бориую кислоту, марганец сер.нокислый,.медь сернокислую, кобальтхлористый, натрий молибденовокислый,калий иодистый, тиамин, пиридоксин,витамин РР, глицин, аденин, гидроли-,2(57) Изобретение относится нологии, в частности к куль нию растительных тканей и клеток п ух 1 го и касается приготовления новых составов питательных сред, Целью изобретения является увеличение выхода и улучшение роста побегов, Изоб ретение состоит в том, что мазоинозит, используемый при добавлении в питательную среду для последующего синтеза из него в растения карбоновых кислот, заменяют на введенные непосредственно в среду соли яблочной, лимонной и изо-лимонной кислот, Кроме того, в среду дополнительно вводят соли итаконовой и с-кетоглутаровой кислот, 1 з,п . ф-лы, 5 табл. зат казеина, мезоинозит, ауктокинин, гибберелловую кислхарозу и агар вместо мезоин вводится смесь органических кислотцинка трикарбоновых кислот таких, каклимонная кислота, яблочная кислотаили их соли, при этом дополнительнможет быть добавлена итаконоваяи (или) с-кетоглутаровая кислотаили ее соли, причем компоненты берв массовых соотношениях 1;1:1 или1:1:1;1:1, Питательная среда содержит макроэлементы, микроэлементы ибиологически активные вещества вследующих отношениях, мг/л:лотаЯблочная кислотаГлицин.АденинГидролизат казеинаАуксинЦитокининыГибберелловаякислота 0,05-0,15Сахарбза 20000-35000.Агар 8000-11000Вода ОстальноеЗаменитель мезоинозита - смесь органических кислот лимонная кислота, изо"лимонная кислота, яблочная кислота) или их соли может быть при" менены в любых модификациях, при этом можно добавлять дополнительно итаконовую и или) с-кетоглутаровую кислоту для интенсификации процессов цикла Кребса и ПАВ для лучшего достижения однородности питательной среды.Добавление лимонной, изо-лимонной и яблочной кислот интенсифицирует процессы дахания или так называемый цикл Кребса, ускоряя процессы роста и развития клеточных культур или меристем. Дополнительно добавленная итаконовая и (или) о-кетоглутаровая кислота могут в определенных условиАммоний азотнокислыйКальций хлористыйНатрий ЭДТАКалий азотнокислыйМагний сернокислыйКалий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислоеЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденов окислыйКалий иодистыйТиаминПиридоксинВитамин РРЛимонная кислотаИзо-лимонная кис 1 640-1 660 435-445 37, 2-37,4.,50 ях ускорять процессы роста и развития, но их присутствие не являетсяобязательным. Лимонная кислота действует также как комплексон, т.е.исключает возможность выпадания осадком тяжелых металлов, вместе с темвсе предлагаемые органические кислоты могут быть совместимы с поверхностно"активными веществами или дру"гимн комплексонами,П р и м е р 1, Питательную.среду для выращивания фрезий готовятрастворением в бидистиллированнойводе компонентов, мг/л:Натрий фосфорнокислый двузамещенный 170,0Аммоний азотнокислый 1650, ОКальций хлористый 440,0Калий азотнокислый 1 900,0Магний сернокислый370,0Калий фосфорнокислый. однозамещенный 170,0Железо сернокислое 27,8Иатриевая соль эти- лендиаминтетрауксусной кислотыЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислый 22,3Медь сернокислая 0,025Кобальт хлористый 0,025Натрий молибденовокислый35Калий иодистыйТиаминПиридоксинВитамин РРНатриевая соль лимонной кислотыНатриевая соль изолимонной кислоты 66,6Натриевая соль яблоч"ной кислотыГлицинАденинГидролизат казеина/3-Индолилукс усна якислотаф 2,0Кинетин 0,2Гибберелловая кислота 0,1Сахароза 30000,0Агар 10000,0 55 Отдельно готовят среду с мезоинозитом и среду без мезоинозита и .орга"нических кислот. После определениярН среду разливают в пробирки по5 155898410 мл и в течение 20 мин стерилиэуют в автоклав е при избыточном давле"нии пара 0,8-1,0 атм, В стерильномбоксе в каждую пробирку помещаютодну мерисФему, а штатив с пробирками помещают в климатическую камеру,где из меристем развиваются растения, образующие стебли, Стебелькиотделяют от маточного растения и вторично сажают на среду, где образуется корневая система, и получают готовые для пересадки саженцы,Среднее число побегов в пучке после 1,5 мес. культивирования фрезийприведено в табл. 1 . 6 Железо сернокислое Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 28,0 37,48,76,422,50,0250,025 Таблица 1 Сорт 70,0 2,5 81,0 1020, О(известная) тами 30 2,75 . 2,25 Рап 1 аву исамаа 4,45 Ргошпепсе 4,80 4,5 3,40 5,75 Скуга 4,69 шт.; выход побегов со.средой. с органическими кислотами 4,82 шт,; увеличение выхода: 1033,П р и м е р 3. Среду для выращивания фреэий готовят и опыт проводят Среднеечисло нобегов в 35 3,26 4,55 4,0 пучке примеру 1. по Увеличение выхода, Ж,противконтроля 00 40 169,01640,0435, 01850,0365,0 114 82 169, О27,5 50 3,28,56,022,00,0240,024 0,24 171,0 Число побегов, шт., на средеП р и м е р 2. Среду для выращивания фрезий готовят и опыт проводят как в примере 1 .Состав среды, мг/л:Натрий фосфорнокислый двузамещенный 172,0Аммоний азотнокислый 1660,0Кальций хлористый 445,0Калий азотнокислый 1910, ОМагний сернокислый 375,0Калий фосфорнокислый однозамещен- ный Цинк сернокислыйБорная кислотаМарг ане ц оернок ислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислый 0,25Калий иодистый 0,85Тиамин 0,5Пиридоксин 0,6Витамин РР 0,6Натриевая соль лимонной кислоты 70,0Натриевая соль изолимонной кислоты 70,0Натриевая соль яблочной кислотыГлицинАденинГидролизат казеинар-Индолилуксуснаякислота 3,0Кинетин 1,0Гибберелловая кислотаа О, 15Сахароза 35000,0Агар 11000,0Выход побегов со средой МурасигеСостав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислыйдвузамещенныйАммоний азотнокислыйКальций хлористый Калий азотнокислый Магний сернокислый Калий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислое Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислотыЦинк сернокислый Борная кислотаМарганец сернокислый Медь сернокислаяКобальт хлористый Натрий молибденово- кислый558984 2,030,01000,0 2,0 0,2 20,0 0,130000,010000,0 160, О 1640,0435, 01850,0365,0 160,027,5 37,28,56,0 прово 22,0О, 0240,024 ЗО 170,0 0,24 0,8 0,3 0,4 0,4 1650,0440,01900,0370,0 170,027,8 20,0 20,0 37,38,36,222,30,0250,025 20,01,579,0980,0 1,00,0520000,08000,0 0,25 0,83 0,4 0,5 0,5 66,6 170,01650, О440,01900,0370,0 66,6 66,6 Калий иодистый 0,8Тиамин 0,3Пиридоксин 0,4Витамин РР 0,4Натриевая соль лимонной кислоты 20,0Натриевая соль иэолимонной. кислотыНатриевая соль яблочной кислоты 20,0Глицин 1,5Аденин 70,0Гидролизат каэеина 980,0р-Индолилуксусная 15кислота 1,0Кинетин 0,1Гибберелловая кислота 0,05Сахароза 20000,0Агар 8000,0 20Выход побегов со средой МурасигеСкуга 3,8 шт.; выход побегов со средой с органическими кислотами 3,85 шт.; увеличение выхода: 1017,П р и м е р 4. Среду для выращи вания фреэий готовят и опыт дят по примеру 1.Состав сред, мг/мл:Опыт 1Натрий фосфорнокислыйдвузамещенныйАммоний азотнокислыйКальций хлористыйКалий азотнокислыйМагний сернокислыйКалий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислоеНатриевая соль этилендиаминтетрауксуснойкислотыЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислыйКалий иодистыйТиаминПиридокс инВитамин РРКалиевая соль лимонной кислотыКалиевая соль изолимонной кислотыКалиевая соль яблочной кислоты Глицин 2,0АденинГидролизат казеинар-индолилуксуснаякислота6-б ензиламинопуринГибберелловая кислотаСахарозаАгарОпыт 2Натрий фосфорнокислый двузамещенныйАммоний азотнокис"лыйКальций хлористыйКалий азотнокислый Магний сернокислыйКалий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислоеНатриевая соль этилендиаминтетрауксусной 1кислотыЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислыйКалий иодистый ТиаминПиридоксинВитамин РРКалиевая соль лимонной кислотыКалиевая соль изолимонной кислотыКалиевая соль яблочной кислотыГлицин "АденинГидролизат казеина 1-Индолилуксусная кислота6-БензиламинопуринГибберелловая кислотаСахарозаАгарОпыт 3Натрий фосфорнокислыйдвузамещенныйАммоний азотнокислыйКальций хлористыйКалий . азотнокислыйМагний сернокислый(с мезоинозитом) 4,0 100 115 4,5 50 107 4,3 119 Среда безмезоинозита 170,0 3,3 55 1650,0440,01990, 0370,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 170,0Железо сернокислое 27,8Натриевая соль этилендиаминтетрауксуснойкислотыЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислый 0,25Калий иодистый 0,83Тиамин 0,4ПиридоксинВитамин РРЛитиевая соль лимонной кислоты 66,3.Литиевая соль изолимонной кислоты 66,3Литиевая соль яблочной кислоты 66,3Глицин 2,0Аде нин 80,0Гидролизат казеина 1000,0р-Индолилук суснаякислота 2,0б-Бензиламинопурин 0,2.Гибберелловая кислота 0,1Сахароза 30000,0Агар 10000,0Среднее количество побегоа в пучке после 1,5 мес. культивирования приведено в табл. 2.35 П р и м е р 5. Среду готовят иопыт проводят по примеру 1. Состав среды, мг/л: Натрий фосфорнокислый двузамещенный)Аммоний азотнокислыйКальций хлористый Калий азотнокислый Магний сернокислый Калий фосфорнокислый однозамещенный Железо сернокислое Натриевая соль зти- лендиаминтетрауксусной кислотыЦинк сернокислый Борная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислая Кобальт хлористый Натрий молибденовокислыйКалий иодистыйТиаминПиридоксинВитамин РРНатриевая соль лимонной кислотыНатриевая соль изолимонной кислоты Натриевая соль яблочной кислотыНатриевая соль итаконовой кислоты-Кетоглутаровой кислоты натриевая соль ГлицинАденинГидролизат казеина -Индолилуксусная кислотаКинетинГибберелловая кислотаСахарозаАгарВыход побегов, по срав вестной средой 1167 П р и м е р 6, Среду, готовят иопыт проводят по примеру 1. Состав среды, мг/л:Натрий фосфорнокислый двузамещенныйАммоний азотнокислыйКальций хлористыйКалий азотнокислыйМагний сернокислый170,027,8 37,38 ф 66,222,30,025О, 025 0,25 0,83 0,4 0,5 0,5 66,6 66,6 66,6 20,0 20,02,080,01000, 0 2,0 0,2 0,1 30000,0 0000,0 ению с отовяу 1,170,0 1650,0440,01900, О370,0 70,027,0 3.,38,36,222,3О, 025 Калий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислоеНатриевая соль эти- лендиаминтетрауксусной кислотыЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислыйКалий иодистыйТиамин1 иридоксинВитамин РРНатриевая соль лимонной кислотыНатриевая соль изолимонной кислотыНатриевая соль яблочной кислотыНатриевая соль итаконовой кислотыс-Кетоглутаровой кислоты иатриевая сольГлицинАденинГидролизат казеинар-Индолилуксусная кислотаКинетинГибберелловая кислотаСахарозаАгарВыход побегов, по сравн известной средой 1 083.П р и м е р , Среду г и опыт проводят по примеруСостав среды, мг/л,Натрий фосфорнокислый двузамещенныйАммоний азотнокислыйКальций хлористыйКалий азотнокислыйМагний сернокислыйКалий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислоеНатриевая соль этилендиаминтетрауксуснойкислотыЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяО 70,0 170,0 Кобальт хлористый 0,025Натрий молибденовокислый 0,25Калий иодистый 0,83Тиамин 0,4Пиридоксин 0,5Витамин РР 0,5Натриевая соль лимонной кислоты 66,6Натриевая соль изолимонной кислоты 66,6Натриевая соль яблочной кислоты 66,6Натриевая соль итаконовой кислотыс(-Кетоглутаровой кислоты натриевая соль 70,0Глицин 2,0Аденин 80,0Гидролизат казеина 1000,0р-Индолилукс уснаякислота 2,0Кинетин 0,225 Гибберелловая кислота 0,1Сахароза 30000,0Агар 10000,0Выход побегов по сравнению сконтролем 1 0 Е.Для получения 1 кг инозитала требуется 25,2 кг фитина медицинского.Источником фитина служат зерновыекукуруза, гречиха), и максимальноесодержание фитина в растениях можетсоставлять несколько процентов посухой массе. Замена инозита органическими кислотами позволяет на каждую тонну питательных сред сэкономить около 250 кг зерновых.40 При использовании смеси органических кислот можно увеличивать количество побегов на 7-193. Кроме того,смесь карбоновых кислот или их солейявляется уйиверсальной добавкой, ее45 можно применить также в модифицированных средах, например при выращивании фрезий из меристем на упрощен-.ной среде,Среду готовят и опыт проводят попримеру 1,Состав среды, мг/л.Натрий фосфорнокислыйдвузамещенный 170,0Аммоний азотнокислый 1650,0Кальций хлористый 440,0Калий азотнокислый 900,0Магний сернокислый . 370,0Калий фосфорнокислый однозамещенный3 4 1558984 27,8 37,38,66,222,3О, 0250,025 66,6 ты кальциевая сольЛимонной кислотынатриевая сольЯблочной кислоты 66,8 0,250,830,50,680,00,635000,08000, 0 66,6 натриевая соль Т а блица 3 Количество побегов фрезий в пучке,: шт., на среде Сорт х для сорта 2,8 2,2 4,5 4,1 4,8 3,4 4,0 3,3 3,4 РапСазуПсЬЫаРгопп.пепс е 4,4 4,6 х для среды Влияние инозита и смеси карбоновых кислот на длину побегов Т а блица 4 Сорт Длина побегов фреэий, см, для среды х для сорта 111 111 4,8 7,4 4,9 5,7 Рап 1 азу0 сЬЫаРгопп.пепс ех для среды 2,3 2,4 2,86,5 ,1 4,6 5,8 2,5 7,0 Влияние инозита и смеси карбоновых кислот на диаметр каллуса эксплан Железо сернокислоеНатриевая соль этилеидиаминтетрауксуснойкислбщЦинк сернокислыйБорная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислыйКалий иодистыйТиаминПиридоксинАденин6-БензиламинопуринСахарозаАгар р Н с реды 6, С реду ра зделяют натри части и добавляют контроль безмезоинозита (среда 1); 100 мг меэо 5инозита (среда 11) 200 мг смеси кар 9боновых кислот "Комплекс" (среда 111),содержащую, мг:Из о-лим он нд й к ис лоВлияние инозита и смеси карбоновых кислот на количество побегов фрезий в пучке после 1,5 мес. культивирования хп чего приведено в табл. 3,фрезий п ч 1 го приведено втабл.4. тов фрезий Ы чего приведено втабл. 5.15558984 Та бли ца 5 Сорт х для сорта 0,8 3,1 0,6 14 16 1 ф 2 0,8 Уап 1 аау33 сИЫа 1,4 Ргопппепсе 0,3 0,7 0,4 0,5 х для среды 08 1,1 О роводят по 170,0 1 650,044 О,О1900,0370,0 170,027,8 37,38,66,222,30,0250,025 0,250,830,4 бб,б 66,6 66,60,180,0 1850-1910 1,51,018000,08000,0ле в сред"в опыте 3 60-3 71 27, 5-28, 0 8,5-8,7 6,0-6,4Среда с дестибиотином.Среду готовят и опыт п примеру 1.Состав среды, мг/л:Натрий фосфорнокислыйдвузамещенныйАммоний азотнокислыйКальций хлористыйКалий азотнокислыйМагний сернокислыйКалий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислоеНатриевая соль эти- лендиаминтетрауксусной кислотыЦинк сернокислыйБарная кислотаМарганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислыйКалий иодистыйТиаминНатриевая соль лимонной кислотыНатриевая соль изолимонной кислотыНатриевая соль яблочной кислотыДестиобиотинАденин(3-ИндолилуксуснаякислотаКинвтинСахарозаАгарДлина побегов в контро ием 4,7 мм; длина побегов 5,0 мм; прирост 63,Диаметр каллуса эксплантов фреэий, см формула изобретения 203 . Питательная среда для выращивания фрезий п чхСго, содержащая натрийфосфорнокислый двузамещенный, аммоний азотнокислый, кальций хлористый,натрий ЭДТА, калий азотнокислый, 25 магний сернокислый, калий фосфорнокислый.однозамещенный, железо сернокисдое, цинк сернокислый, борнуюкислоту, марганец сернокислый, медьсернокислую, кобальт хлористый, 30 натрий.молибденовокислый, калий иодистый, тиамин, пиридоксин, витаминРР, глицин, аденин, гидролизат казенка, ауксин, цитокинин, гибберелловую кислоту, сахарозу, агар, ис 5 точник карбоновых кислот и водуфо т л и ч а ю щ а я с я тем, что,с целью увеличения выхода и улучшения роста побегов, в качестве источника карбоновых кислот используют 40 соли лимонной, изо-лимонной и яблочной кислот при следующем соотношениикомпонентов, мг/л:Натрий фосфорнокислый двузамещенный 169- 72 45 Аммоний азотнокис-.лый 1 640-1 660Кальций хлористый 435-445Натриевая соль этилендиаминтетрауксус" 50 ной кислоты 3 э 2 3 э 4Калий азотнокис"лыйМагний сернокис-лый 365-375Калий фосфорнокислый однозамещенныйЖелезо сернокислоеЦинк сернокиелыйБорная кислота22, 0-22,5О, 024-0, 0,250,024-0,025 0,24-0,26 0,8-0,85 0,3-0,5 0,4-0,6 0,4-0,6 О, 05-0,1520000-350008000-11 000Остальное О 2. Питательная среда по и.отличающа яс я тем, чтодополнительно содержит, мг/л: сольитаконовой кислоты 20-70 и соль(-кетоглутаровой кислоты 20-70. 20-70 20-70 20-70 кислотыСоль яблочной кислоты Редактор Н. Яцола Заказ 820 Тираж 489 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР3035, Москва, Ж, Рауыская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Марганец сернокислыйМедь сернокислаяКобальт хлористыйНатрий молибденовокислыйКалий иодистыйТиаминПиридоксинВитамин РРСоль лимонной кислоты.Соль изо-лимонной ГлицинАденинГидролизат,ка зеинаАук синЦитокининыГибберелловая кислотаСахарозаАгарВода Составитель В. ДемкинТехред М.Ходанич Корректор И, Муска