Способ отбора микроорганизмов, содержащих рекомбинантные молекулы днк

ОП ИСАЙ ИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Со 1 оз СоветскикСоциалистическиеРеспублик и 1912754(5)М. Кд. С 12 Я 15/00 Ъеударотееииый комитет СССР ио делам изобретений и открытий(53) УДК 576 8" .078(088,8) Дата опубликования описания 1 5, 03 . 82/Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР "1(54) СПОСОБ ОТБОРА МИКРООРГАНИЗМОВ, СОДЕРЖА 4 ИХ РЕКОМБИНАНТНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК1Изобретение относится к областимолекулярной биологии, а именно к от,бору клеток микроорганизмов с измененными генетическими признаками в работах по .генной инженерии. Микрооргафнизмы, содержащие рекомбинантные мо- .лекулы ДНК с чужеродными генами,сконструированные 1 п чйго - продуценты различных биологически активныхвеществ, могут быть использованы в10микробиологической промышленности,Известен способ отбора бактериаль.- ных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, по их способностирасти на питательных средах, содержа 15щих антибиотикиСогласно известному способу трансформированные рекомбинантными молекулами ДНК клетки микроорганизмов припомощи шаблона высевают на две чашкиПетри с твердой питательной средой, каждая из которых содержит один изантибиотиков, После высева бактериальные клетки выращивают в течение 12-24 ч. Сравнивают результаты роста на обеих чашках и отбирают теклоны микроорганизмов, которые способны расти только на среде с однимиз антибиотиков, Если в качестве вектора применяют плазмиду рВ)1. 322,то каждый из отбираемых клоновтрансформантов высевают на твердуюпитательную среду с ампициллином итетрациклином (обычно используемыеконцентрации антибиотиков колеблютсяот 10 до 50 и более мкг/мл). Так,векторная плазмида рВк 322 придает клеткам резистентность к ампициллину итетрациклину, Поэтому бактериальныеклетки, содержащие исходный вектор,вырастают на обеих чашках, содержащихкак ампициллин, так и тетрациклин.Клетки утрачивают устойчивость к ам"пициллину при введении чужеродной ДНКв состав вектора по сайтам оестрикцииэндонуклеаз Рзт.или Рчц 1,. При этомклоны клеток, содержащие такие рекомбинантные молекулы ДНК, в отличие отОднако существующие методы отбора бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, осуществляются химическими агентами такими,1 20 как антибиотики, что повышает их возможную биологическую опасность для онружающей среды. Использование нескольких антибиотиков при селекции рекомбинантов увеличивает продолжительность операций при подготовке селективных сред. При использовании этого метода в промышленных масштабах возникают существенные трудности точное дозирование антибиотика, внесение в питательную среду после стерилизации, инактивация антибиотика .35 в.процессе хранения в сбставе среды, высокая себестоимость некоторых антибиотиков, разрушение антибиотиков в процессе культивирования за счет выделения в среду ферментов, дегра 40 дирующих антибиотики, таких какЪ-лактамаэа..Целью изобретения является упрощение. способа отбора клеток микроор-, ганизмов, содержащих рекомбинантные45 ДНК, и уменьшение его биологической опасности,Поставленная цель достигается тем, что согласно способу отборки микроорганизмов, содержащих рекомбинант" ные молекулы ДНК, включающему пересев микроорганизмов по шаблону на поверхность твердой питательной. среды,инкубацию и отбор клонов микроорганизмов на основании сравнения сконтролем перед инкубацией микробныклетки подвергают ультрафиолетовомуоблучению, а клетки клонов микроор 3 9125 клеток, содержащих исходный вектор, растут на среде с тетрациклином и не растут .на среде с ампициллином. Это является фенотипическим признаком для отбора клеток с рекомбинантными молекулами ДНК.Иаркер устойчивости к тетрацикли 1ну инактивируется при интеграции чужеродной ДНК в сайты рестрикции эндонуклеаз Нпй 1, Ваа Н 1, 3 а .Транс формированные такими рекомбинантными молекулами ДНК клетки растут на среде с ампициллином и не растут на среде с тетрацикЛином, что и йомогает отличить их от клеток, транс формированных исходным вектором. Такие векторные молекулы ДНК называют векторами инсерционной инактивации. 4ганиэмов отбирают с того места контроля, где клетки опыта погибли,П р и м е р 1, Клоны клеток получают после трансформации компетентных клеток Е,сой НВ 101 .чесА смесью сшитых с помощью полинуклеотидлигазы фага Т 4, Гсо 1-Фрагментов ДНК Фага Т 4 с расщепленной эндонуклеазой Есор ДНК векторной молекулы рХ 13.Полученные клоны клеток пересевают на поверхность твердой питательной среды, содержащей 10 г бакто"трипто" на, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г МаСВ, 15 г бакто-агара на 1000 мл воды, с помощью шаблона. Пересев де.лают одновременно на две чашки Петри, после чего поверхность питательной среды одной чашки облучаютУф-светом, (опыт). Клетки, высеянные на вторую , чашку, воздействию УФ-света не под-вергают (контроль). В качестве источника Уф-света ( Л -254 нм) используютч бактерициднуюлампу БУФпрогретую перед опытом в течение 30-45 мин, высот между поверхностью,на которой находят - ся клетки, и УФ-источником 40 см, время воздействия УФ-света 60 с.После Уф-облучения выращивают клетки без. воздействия видимого све" та (полная темнота). Для этого после облучения чашки Петри (опыт) сразу помещают в светонепроницаемый контейнер (конверт из черной бумаги, ящик. и т.п) и выращивают в полной темноте 24 ч, После появления видимых ко" лоний клеток сравнивают соответствие роста каждого клона клеток в контро" ле и опыте, На поверхности питательной среды обеих чашек Петри (конт,- роль и опыт) вырастают клетки, содержащие исходные векторные молекулы ДНК, с ненарушенным геном Уф-устойчи- . вости. Вырастают на контрольной чашке Петри и отсутствуют в опыте (не вырастают) клоны клеток, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК,в ген устойчивости к Уф-облучению которых произошла вставка чужеродного Фрагмента ДНК. Сущность явления заключается в том, что в качестве генетического . маркера, по инактивации которого происходит отбор рекомбинантов, исполь- зуют чесА ген Е, со- . Сайт расщеп" ления эндануклеазы Есо Р 1 находится в структурной части этого гена. Таким образом, интеграция чужеродного Фрагмента ДНК в Есо В 1-сайт вектор2 Ю бПреимуществами предложенногоспособа отбора микроорганизмов,содержащих рекомбинантные молекулыДНК, без использования антибиотиковявляются упрощение способа за счетиспользования физических Факторов(УФ-свет) взамен химических факторов; биологическая безопасность дляокружающей среды микроорганизмов с 10 рекомбинантными ДНК; упрощение соста-ва питательной среды за счет отсутст вия антибиотиков. Формула изобретения 5 91 ной молекулы ДНК ведет к инактивации (нарушению) гена, что фенотипическипроявляется в исходной Уф-чувствительности трансформированных клеток. Если встройка чужеродной ДНК в Есок"сайт векторной молекулы ДНК отсутству .т, ген Уф-резистентности функционирует и обеспечивает выживаемость клеток после облучения.П р и м е р .2. Аналогичным спо". собом отбирались клетки, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, создан" ные на основе векторной молекулы ДНК рХ 15, где при встраивании чуже. родного фрагмента ДНК инактивирует ся ген .Уф-устойчивости из Ргойецз а 1 гаЪ 1 В з. Ген устойчивости к ультрафиолету Ргойецз о 1 гаЪ Ь з име ет другую (отличную от чес А Гена Е со 11) первичную структуру ДНК,кото- щ рую определяют наличием сайтов рас: щепления для других эндонуклеаз рестрикции, в которые возможна интеграция чужеродного фрагмента ДНК,приводящая к нарушению гена Уф-устойчивости, Рассмотренный в примерах способ отбора на основе инсерционнойинактивации генов позволяет конструировать новые векторы, так как эти .гены имеют отличную первичную струк- .ЗОтуру ДНК и, тем самым, увеличиваютчисло рестрикционных. эндонуклеаз,применяемых при конструировании 1 п :ч 1 го рекомбинантных молекул ДНК. Способ отбора микроорганизмов,содержащих рекомбинантные молекулы ДНК,включающий пересев микроорганизмов,.по шаблону на поверхность твердой питательной среды, инкубацию и отборклонов микроорганизмов на основаниисравнения с контролем, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и уменьшения его биологической опасности, перед инкубациейклетки микроорганизмов подвергаютультрафиолетовому облучению, а клетки клонов микроорганизмов отбираютс того места контроля, где клеткиопыта погибли.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Г. ВО 11 чаг ейаВ, Сепе, 2,1977, р 95-113Составитель А.МакаровРедактор Л. Веселовская Техред И. Надь Корректор С, Шекмара Заказ 1316/35 Тираж 505 - Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, ч/5 е юе ев а еФилиал ППП "Патент", г. УжгорОд, ул. Проектная,