Способ получения аффинного сорбента

(н)883060 Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(22) Занвлено 18,01, 80(21) 2898691/23-05с присоелинением заявки РЙпо делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Специальное конструкторско-технологическое бюробиологически активных веществ Главного управлениямикробиологической промышленности эрм. СоветеМинистров СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯФФИННОГО СОРБЕНТА Изобретение относится кобластйбиохимии и может быть использованов аффинной хроматографии для выделения аденозинтрифосфат (АТФ)-зависимых ферментов.Известен способ получения аффин 5ного сорбента путем введения ароматического кольца в ВгСМ-активированную сефарозу, получения 8-амина-АТФи присоединения последнего азосоче 1 Отанием к матрице, содержащей ароматическое кольцоНедостатками известного способаявляются многостадийность процессатиспользование труднодоступных и дорогих реактивов, употребляемых привведении ароматического кольца и азосочетании (например, Й-сукцинимидный эфир бензойной кислоты, палладиевыйкатализатор), а также взрывоопасных (ГаМО) и высокотоксичных (НЙО) соединений.Наиболее близким по технической сущности к предлагаем.,му является способ получения аффинного адсорбен-,та, заключающийся в бромированииаденозинмонофосфата ( ЯМФ).до 8 Вг-ЯМФ( с выходом последнего приблизительно 75/), автоклавировании 8 Вг-ЯМФ при140 С в присутствии гексаметилендиамина (выход 8(6-аминогексил) амино АМФ составляет 85"), последующейзащите алифатической аминогруппы 8-(6-аминогексил) амино-АМФ обработкойэтиловым эфиром трифтортиоуксуснойкислоты, активировании фосфатнойгруппь 1 нуклеотида путем обработки высушенного продукта упариванием сабсолютным пиридином АМФ карбонилдиимидазолом в сухом диметилформамиде, добавлении к активированномупродукту неорганического пирофосфата до образования 8(СР-С-ИН(СНо)ь 0 -Г 1 Н) АТФ, снятии защиты с алифатической аминогруппы обработки 8 (СР -С-НН(Н)ЧИН) АТФ 1 М щелочью ио1 о присоединением полученного 8-6-аминогексил) аминоаденозинтрифосфата кВгСН-активированной сефарозе 21.Недостатками способа являютсямногостадийность процесса, низкий выход продукта, использование дефицитных и дорогих реагентов (карбонилдиимидазол, этиловый эфир, трифтортиоуксусная кислота), использование безводных растворителей, таких как пиридин и диметилформамид, и необходимость работы с ними в условиях, исклюцающих попадание влаги, что требует специальных мер безопасности,Цель изобретения - упрощение способа и увелицение выхода целевогопродукта,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу полученияаффинного сорбента, включающему обработку производного аденозина иприсоединение полученного в результате обработки 8-(6-аминогексил)аминоаденозинтрифосфата к ВгСН-активированной сефарозе, в качестве производного аденозина используют динатриевую соль аденозинтрифосфата иобработку проводят насыщенной бромной водой до полуцения .8-бромаденозинтрифосфата и затем гексаметилендиамином в присутствии эквимолярнойсмеси иодистого калия и сульфата меди в качестве катализатора в течение4-6 ч при 40-50 С.Сущность предлагаемого способаполучения аффинного сорбента заклюцается в следующем,Динатриевую соль АТФ обрабатывают насыщенной бромной водой до полуценил 8 Вг-АТФ. Продукт реакции выделяют ионообменной хромотографией наДЭАЭ-сефадексе,Готовят реакционную смесь, содержащую 8 Вг-АТФ, гексаметилендиамин,смесь СцБ 04. и К 3, выдерживают 4-6 цпри 40-50 С. 0 полноте прохожденияреакции судят по сдвигу максимумапоглощения реакционной смеси с 260 нмдо 280 нм. Продукт реакции выделяютионообменной хроматографией наДЗАЗ-целлюлозе.Полученный 8-(6-аминогексил) амино-АТФ выдерживают в течение 16 ц сВгСИ-активированной сефарозой, Продуктом реакции является сорбент, содержащий АТФ, ковалентно присоединенный через Сположение.П р и м е р 1, Синтез 8 Вг-АТФ,ммоль (551 мг) АТФ (натриевая соль 25 зо 35 40 45 50 55 растворяют в 40 мл 1 М СН С 0014 а(рН 4,0),добавляют 10 мл насыщенной бромнойводы. Реакционную смесь оставляют прикомнатной температуре в темном местеДобавляют ИаБгО до обесцвечиванияраствора. Реакционную смесь упаривают до масла, растворяют в 50 млНО и наносят на колонку (1,6 х 70 см)с ДЭАЭ-сефадексом А(в НС 09 -форме)Промывают колонку линейным градиентом (0,1-0,4 М ) триэтиламмоний дикарбоната (ТЭАБ) рН 7,5. Скоростьэлюирования 90 мл/час, объем элюата 1,8 л. Фракции, соответствующие8 Вг-АТФ, объединяют и упаривают наротационном испарителе, ОстатокТЭАБ удаляют повторным упариваниемс водным этанолом,Выход ОВг-АТФ составляет0)75 ммоль (75 Ц,Синтез МН СН)БАЯН-АТФ, 0,75 ммоль8 Вг-АТФ растворяют в 10 мл НО, добавляют 5 .г ИН(СН ) 6 МН , 20 мгСц 504 и 20 мг К 1. Выдерживают реакционную смесь 4 ц при 50 С. 0 полнотепрохождения реакции судят по сдвигумаксимума поглощения реакционнойсмеси с 260 нм до 280 нм, Реакционную смесь разбавливают дистиллированной водой до 500 мл и наносят наколонку (2,6 Х 70 см) с ДЭАЗ целлюлозой (в НСО-форме), Скорость нанесения 90 мл/час. Промывают колонкулинейным градиентом(0,1. 0,5 М)ТЭАБ рН 7,5. Скорость элюирования60 мл/ч, объем элюата 1,5 л фракции,соответствующие 8-(6-аминогексил) амино-АТФ, объединяют и упаривают наротационном испарителе, Остаток ТЭАБудаляют повторным упариванием с водньм этанолом,Выход ИН(СН) МН-АТФ составляет0,41 ммоль (554)П р и м е р 2. 0,75 ммоль 8 Вг-АТФ растворяют в 10 мл Н 0, добавляют 5 г МН(СН) МН, 20 мг СОБ 01 и20 мг К 1, Выдерживают реакционнуюсмесь 6 ч при 40 оС, 0 полноте про-,хождения реакции судят по сдвигу максимума поглощения реакционной смесис 260 нм до 280 нм. Реакционную смесьразбавляют дистиллированной водойдо 500 мл и наносят на колонку(НСО-форме) . Промывают колонку линейным градиентом (0,1 - 0,5 М) ТЭАБрН 7,5, Фракции, соответствующие8-(6-аминогексил)амино-АТФ, объединя883060 Формула изобретения Составитель Г.РусскихРедактор Т.Кугрышева Техред И.Гайду Корректор О.Билак Заказ 10115/32 Тираж 533 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва,Ж, Раушская наб.,д.4/5Филиал ППП "Патент". г. Ужгород, ул, Проектная, 4 ют и упаривают на ротационном испарителе. Остаток ТЭАБ удаляют повтор"ным упариванием с водным этанолом.Выход МН (СН )МН-АТФ составляет0,29 ммоль (653Присоединение МН (СН )МН-АТФ кВгСМ-активированной сефарозе9 гсухой ВгСМ-активированной сефароэыпромывают на фильтре 300 мл холодной0,001 МНС 1, затем 100 мл холодного0,1 М МаСО (рН 9,5) и переносятв колбу. Добавляют 5 мл раствора(30 ммоль) МН(СН 2)МН-АТФ в 0,5 ММаСО (рН 9,5) .Перемешивают 16 чпри 4 фС. Промывают сорбент 0,1 ММагСО (рН 9,5) до отсутствия оптической плотности и затем водой донейтрального значения рН,Выход сорбента составляет 9 г.Емкость сорбента 3 ммоль АТФ на 1 гсухого носителя.Использование предлагаемого способа получения аффинного сорбентапо сравнению с известным позволяетсократить число стадий получения, аффинного сорбента, исключить трудоемкую стадию автоклавирования, требующую специального оборудования,и стадии, связанные с необходимостьюработать с безводными растворителямиулучшить условия труда за счет исключения из процесса токсичных реагентов (таких как пиридин, диметилформамид), а также разместить процесс наобычном производстве органическогосинтеза без особых требований к оборудованию помещения и беэ специальных мер по технике безопасности, эаменить дефицитные реактивы на болеедоступные коммерческие препараты,увеличить выход целевого продуктаСпособ получения аффинного сорбента, включающий обработку произ Оводного аденозина и присоединение полученного в результате обработки8-(б-аминогексил,1 аминоаденозинтрифосфата к ВгСМ-активированной сефарозе,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что 5 с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, в качестве производного аденозина используют динатриевую соль аденозинтрифосфата и обработку проводят насышенв ной бромной водой до получения 8-бромаденозинтрифосфата и затем гексаметилендиамином в присутствии эквимолярной смеси иодистого калия и сульфата меди в качестве катализаторав течение 4-6 ч при 40-50 С. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. С,И.К;Кцпйг е 1:,а 1. эо 1 а 1 оп оГзв Р Ьоьр Ьоц 1 усе га е 1па эеэ Ьу АНи . йуСЬговайоогарЬу, Ецгореап Уоцгпа 1оГ Восйевэсгу, 1978,Ч 85, М 2,р.493-501.2.Хац Р, Тгауег ей а 1. Ргерагайчцзз оГ Адепоэпе йцс 1 еойсе Оегча 1 чеэЬцйаЬе аког,АЛп 1 йу,СЬговайодгарйу,ТЬе Восйевса 1 огпа 1. 1974, Ч 139,Г 3, р. 609-623 (прототип),