Способ получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5 -гидроксильными группами

.А. Мяивинен, Н.С.Сидорова ени институт высонина р ордена ТргосударственныйЖданова рдена Трудового Красного Зна оединений АН СССР и ордена Л расного Знамени Ленинградскиуниверситет им, А,А омолекулярныхдового(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЦЕТИЛИРОВАННЫХ РИБОНУКЛЕОЗИДО СО СВОБОДНЫМИ 5 -ГИДРОКСИЛЬНЫМИ ГРУППАМИатками этого способа явля" Не нной20аИзобретение относится к усовераенствованному способу получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5-гидроксильными группами,являющихся промежуточными соединениямидля получения олигорибонуклеотидовзаданной структуры с природной межнуклеотидной связью, обладающих биологической активностью.Известен способ получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5 -гидроксильными группами (нап 1ример, 2,3 -ди-ацетилуридина) ферментативным дефосфорилированием полностью ацетилированных рибонуклеозид-фосфатов (2 ,3,ди-ацетилуриди-5 -фосфата) в присутствии щелочнойфосфатазы в буферных растворах (в0,2 М трис-НС 1 буфере с рН 8) при37 С в течение 3 ч,Целевой продукт выделяют бумажхроматографией в системах изопропнол;конц, ЙНОН-НО(7:1:2), ВцОНАсОН-НО (5: 2: 3), ( Данные об активности фермента отсутствуют, используетсякоммерческий препарат) 1,. ются:.а) необходимость проведения процесса в области щелочных рН, где защитныв ацетильные группировки лабильны, что приводит к загрязнению целевого продукта продуктами частичного гидроли" за ацетильных групп;б) использование щелочной фосфатазы - внутриклеточного Фермента, очист ка которой представляет содеи трудо" емкий и многостадийный процесс, не гарантирующий чистоты препарата,в) применение бумажной хроматографии для выделения целевого продукта "что делает метод малопригодным для препаративного получения целевого продукта.Цель изобретения - повышение качества целевого продукта и упрощение процесса.Эта цель достигается тем, чтосогласно способу получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободны"ми 5 -гидроксильными группами, ферментативное дефосфорилирование полностью ацетилированных рибонуклеозид-5-Фосфатов ведут в присутствии кислой фосфатаэы 1 иэ 5 ассЬаговусез сегеч 151 ае при рН 3,6-3,8 в растворе0,05-0,1 И ацетата аммония, предпочтительно в присутствии 0,8-30 ед.ферментной активности Фосфатазы на1 ммоль полностью ацетилированногорибонуклеозид-фосфата, предпочтительно в тецение 40 минч, предпочтительно при 20-37 ОС в выделениицелевого продукта хроматографией осуществляют на сефадексе .Нприсоотношении высоты и диаметра колонки 15-20:1, соотношении нуклеозида исорбента 1 ммоль: 100-105 мл, приэтом элюцию ведут водой.Существенными отличиями способаявляются использование кислой фосФатазы 1 из БассЬагоаусез сегеч 151 ае дв вышеуказанных условиях и применениедля очистки целевого продукта колоночной хроматографии,Использование способа полученияацетилированных рибонуклеозидов сосвободными гидраксильными групйамипоэволяетполучить целевой продукт,не загрязненный продуктами разложения,а применение в способе колоночной хро.;матографии для очистки целевого про-дукта упрощает способ и позволяетприменить его для препаративного получения продуктаП р и м е р 1. Раствор 1 ммоль6-й 2,3 -О-триацетиладенозин"5-фосфата в 50 мл 0,1 И ацетата аммония с рН 3,8 инкубируют с 0,8 ед.ферментной активности кислой фосфатазы 1 иэЯассьагощусез сегеч 151 ае при 37 с втечение 22 ч. За единицу ферментнойактивности применяют такое количество фосфатазы, которое дефосфолирует1 мкмол п-.нитрофенилфосфата за 1 минпри 37 С и рН 3,7. Раствор упариваютв вакууме до объема 1 мл и наносят наколонку с сорбентом сефадекс 1.Н объемом 100 мл. Колонку промывают дистиллированной водой со скоростью "25 мл/ц. Фосфатаэу вымывают с 34 поЙО мл элюата, цто показано наличием в55элюате дефосфорилирующей активности,Ацетат аммония вымывают с 53 по 65 млэлюата, что установлено по электропроводности, б-й, 2, 3 -0-триацетил,аденозин вымывают с 67 мл элюата, контроль ведется методом Уф-спектроскопии на длине волны 260 нм. Конечный продукт ведется лиофилизацией. Выход 390 мг, т.е. 934 от теории. Строение полученного продукта подтверждено анализом числа ацетильных групп в расчете на одну молекулу триацетильного производного рибонуклеоэи да. Найдено 2,98 ацетильных групп на молекулу рибонуклеозида. Методом хроматографии на бумаге в системе бутанол-этанол-вода (4:1:5) не обнаружено следов других продуктов.П р и м е р 2. Процесс ведут в условиях примера 1, однако 1 ммоль 6- -8,2,3 -0-триацетиладеноэин-Фосфата растворяют в 60 мл 0,05 М ацетата аммония с рН 3,6 и инкубируют в присутствии 2 ед. Ферментной активности кислой фосфатазы при 20 С в течение 25 ц. Конечный продукт выделяют лиофилизацией. Выход 398 мг, т,е. 953 от теории, При этом не найдено следов других продуктов.П р и м е р 3, Процесс ведут в условиях примера 1, однако 1 ммоль 6- -й, 2, 3 -0-триацетиладейоэин- фосфата растворяют в 50 мл 0,08 М ацетата аммония с рН 3,7 и инкубируют с 4,5 ед. Ферментной активности кислой фосфатазы в течение 5 ч. Выход 397 мг, т.е. 953 от теории. При этом не обнаружено следов других продуктов,П р и м е р 4, Процесс ведут в ус. ловиях примера 3, однако 1 ммоль 6- -М 230-триацетиладенозин-фосфата1 инкубируют с 30 ед.ферментной активности кислой фосфатаэы в течение 40 мин. Выход 379 мг, т,е. 904 от теории, Следов других продуктов не обнаруженоП р и м е р 5. Процесс ведут в условиях примера 1, однако инкубации подвергают 1 ммоль 2-8, 2,3-0-триацетилгуаноэин-фосфата, Получают 372 мг,.т.е. 91 2-М,2 ,3 -0-триацетилгуаноэиа. Строение полученного продукта подтверждено анализом числа ацетильных групп в расчете на одну молекулу триацетильногс производного рибонуклеозида, Найдено 2,96 ацетильных групп на молекулу рибонуклеозида. Методом хроматографии на бумаге не обнаружено следов других продуктов.П р и и е р 6. Процесс ведут в условиях примера 1, однако инкубации подвергают 1 ммоль 2,3-О-диацетилуридин-Фосфата. Получают3055 формула изобретения Составитель Л,НикулинаРедактор Т.Кугрышева Техред И.Гайду Корректор О.Билак Заказ 10114/32 Тираж 400 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва,Ж, Раушская наб.,д.4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул,Проектная,4 5 88 316 мг, т.е. 963 2,3-0-диацетуридина. Строение полученного продукта подтверждено анализом числа ацетильных групп в расчете на одну молекулу диацетильного производного рибонуклеозида. Найдено 2,01 ацетильных групп на молекулу нуклеозида. Мето,дом хроматографии на бумаге не обнаружено следов других продуктов. Способ получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5- -гидроксильными группами ферментативным дефосфорилированием в буферных растворах полностью ацетилированных рибонуклеозид-Фосфатов в присут-ствии фосфатаз, с последующим хроматографическим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения качества целевого продукта и упрощения процесса, дефосфорилирование ведут в присутствии кислой фосфатазы 1 из ассЬаговусез сегеч 1 з 1 ае при рН 3,6- 3,8 в растворе 0,05-0,1 И ацетата аммония, а хроматографическое выделение целевого продукта осуществляют наколонке с сефадексом Нпри соотношении высоты, и диаметра колонки3 15-20:1, соотношении нуклеозида исорбента 1 ммоль : 100-105 мл, приэтом элюцию ведут водой.2. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что ферментативноедефосфорилирование осуществляют втечение 40 минчас.3. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что Ферментативноедефосфорилирование проводят при 20% 37 оССпособ по п.1,о т л и ч а ющ и й с я тем, что фермвнтативноедефорфорилирование проводят в приюсутствии 0,8-30 единиц ферментной ак.тивности фосфатазы на 1 ммоль полностью ацетилированного рибонуклеозид-Фосфата.Источники информации,ипринятые во внимание при экспертизеТ.Всма, т.Та 1 сесГа, Н.Науайзи.