Способ получения аминогрупп в хитозане и его водорастворимых производных

)5 С 12 6,С 08 ВЗ ПИСАНИ БРЕТЕНИ чД(57) Использование: в аналитической химии, при использовании хитозана в медицине и биотехнологии. Сущность изобретения: к раствору исследуемого полимера добавляют буфер, фермент - холинэстеразу и егосубстрат, и определяютактивность фермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера. Содержание аминогрупп, рассчитывают по формулеА =Ч/Ч - 1=К , где А - содержание аминог)друпп, мас,%;.Ч - активность фермента в отсутствии полимера, Е/мг, Ч - активность .фермента в присутствии полимера, Е/мг; К -коэффициент пропорциональности; )т) - масса полимера в реакционной смеси, мг, 1 ил. нстинной еноаа Л, П. и хи 8,ППВМЫХ ние аминогрупп. етения является у охранении низкого миногрупп, цель достигается яют буфер, ферме субстрат, и регист нта по сравнению не содержаще,й по ногрупп рассчиты роще- редетем, что нт - хори руют с контлимера, вают по де А - содержание аминогруп Ч - активность фермента олимера, Е/мг; Ч - активность фермента олимера, Е/мг;мот твие сутствии ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР МУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Ленинградский технологический итут им. Ленсовета и Институт эволюциофизиологии и биохимии им, И, М, Сеч, (56) Авторское свидетельство СССРМ 802290, кл. С 08 В 37/08, 1981.Губен-Вейль. Методы органическомии, М,; Госхимиздат, 1963, с, 687-68(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОГРУХИТОЗАНЕ И ЕГО ВОДОРАСТВОРИПРОИЗВОДНЫХ Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению содержания аминогрупп вхитозане и его.производных.Известен способ определения аминог-: рупп в хитозане и его производных путем перевода подймера в водный раствор с последующим анализом аминогрупп методом потенциометрического титрования, Недостатком данного способа является высокий предел обнаружения аминогрупп и недостаточная надежность их определения,Понизить предел обнаружения аминогрупп и обеспечить надежное их определе-ние в хитоэане и его производных позволяет способ, основанный на методе Ван-Слайка принятый за прототип, По данному способу водный раствор полимера обрабатывают азотистой кислотой, измеряют объем выделившегося азота и рассчитывают содержаявляется высокаяспособа.Целью изобрние способа при сла обнаружения аПоставленнаяк раствору добавллинэстеразу и егоактивность фермеральной пробой,а содержание амиформулеЧ/Ч - 1 Ъю Недостатком прототипа ф ожность и трудоемкостьК - коэффиЦиент пропорциональностии а - масса полимера в реакционной. смеси,мг.П р и м е р 1. Перед определениемаминогрупп в хитозане и его производных 5проводят градуировку по хитоэану с известным содержанием аминогрупп,Градуировка методаСтандартный образец хитоэана из панциря краба анализируют на аминогруппы 10методами потенциометрического титрования и Ван-Слайка и находят их содержание8,7 мас.%,Готовят точно 0,2%-ный раствор станДйртного хитозана в 0,1 М уксусной кислоте 15и разводят водой до концентрации полимера 0,025, 0,0175, 0,0125 и 0,005%, Затемотбирают по 1 мл каждого раствора и каж.дйй раз добавляют о реакционную смесь,составленную из 1 мл раствора промьпцленкого препарата бутирилхолинэстеразы сыворотки кровилошади (КФ 3.1.1.8) сактивностью 1 Е, 1 мл 0,5 М хлорида калияи 1 мл фосфатного буфер (1/300 М, рН 7,5).Реакцию начинают добавлением 1 мл 255 10 М бутирилтиохолина при 25 С. В последнюю (контрольную) пробу вместо раствора хитозана вводят 1 мл воды. Рабочиеконцентрации хитоэана в реакционной смесисоставляют 0,005, 0,0035, 0,0025, 0,0010 и 300% соответственно, Активность ферментаизмеряют методом потенциометрического.титрования при рН 7,5 и выстраивают градуировочную пряму 1 о в координатах Ч/% -молярная концейтрация аминогрупп. На 35графике, приведенном на чертеже, отмечают интервал рабочих концентраций аминогрупп - (0,2 - 1,8) 104 ммоль/мл. Дляудобства вычислений выводят расчетную.форМулу40АЮЧ - 1) сс 9 а Мдн 2 и 100где А - содержание аминогрупп, мас.%;а - угол наклона прямой, Мин 2 - моле кулярная масса аминогруппы (Мйн 2 = 16);п - степень разведения раствора полимера (п -5);т - масса полимера в реакционной сме-си, мг,Объединяют множитель сна Мнн 2 пх х 100) в коэффициент и ропс рциональности КК=сщаМин 2 и 100=2,73 10 /(4,15- 55 1,0) 16 5 100 = 0,69 и получаем окончательную расчетную формулуЧ/Ч - 1 ВОпределение аминогрупп,Анализируют образец хитона, полученный щелочным дезацетилированием панциря краба в течение 40 мин. 200 мг хитоэана растворяют в 100 мл 0,1 М уксусной кислоты, отбирают 1 мл раствора и добавляют к нему 15 мл воды. Получают 0,025%-ный раствор хитозана, Затем проводят ферментную реакцию по прописи, описанной при градуировке метода. Получают значение относительной активности фермента Ч/Ч - - 2,3, Содержание аминогрупп рассчитывают по формуле:7,2%0,125П р и м е р 2. Анализируют образец хитозана, полученный щелочным дезацетилированием панциря криля в течение 6 ч. Определение проводят аналогично примеру 1. Ч/Ч = 2,8, А = 9,8%.П р и м е р 3. Анализируют образец, Йа -соли М-фталилхитозана, полученного иэ крабового хитозана и по условиям синтеза, предположительно не содержащего свободных аминогрупп,200 мг полимера растворяют в 100 мл 0,01 М фосфатного буфера, отбирают 1 мл раствора, добавляют к нему 3 мл воды и получают 0,05%-ный раствор, Далее проводят определение аналогично примеру 1. Ч/Ч = 1,0, А = 0%.Для проверки отсутствия аминогрупп увеличивают испытуемую концентрацию полимера в 10 раз, Проводят повторное определение аналогично примеру 1. Ч/Ч = 1,0, А =0%.П р и м е р 4. Анализируют образец Мз -соли частично эамещенного Й-фталилхитоэана, в котором по условиям синтеза половина аминогрупп.п редположительно . не замещена. Определение проводят аналогично примеру 3, вводя в измерительную ячейку, 0,025%-ный раствор полимера. Ч/Ч 1 = 2,2, А = 3,3 %,П р и м е р 5. Анализируют образец Ма -соли Й-фталилхитозана на остаточные аминогруппы, Растворяют 750 мг полимера в 100 мл 0,01 М фосфатного буфера, отбирают 1 мл раствора и добавляют к нему 9 мл воды, Получают 0,075%-ный раствор, который анализируют в условиях примера 1. Ч/Ч = 1,0. А=0%.Для установления наличия аминогрупп испытывают исходный раствор полимера с концентрацией 0,75%. Определение проводят аналогично примеру 1. Ч/% - 1,5, А = =5 102%П р и м е р 6. Перед определением аминагрупп проводят градуировку по стан1754780 А:Обб ЧIЧ П 1 30Ч/Ч - 11юП 3 2 дартному образцу хитоэана, использованному в примере 1, Готовят растворы стандартного хитоэана так же, как в примере 1. По 1 мл каждого раствора добавляют в реакционную смесь, составленную из 1 мл промышленного препарата бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади с активностью 1 Е, 1 мл реактива Эллмана (готовят растворением 80 мг 5,5-дитиобис-нитробензойной кислоты в 100 мл 0,1 М фосфат- ного буфера, рН 7,5) и 2 мл 2,5 10" М бутирилтиохинолина, В контрольную пробу вместо хитозана добавляют 1 мл воды, Активность фермента определяют по методу Эллмана по количеству тиохинолина с помощью фотоэлектроколориметра и ри длийе волны 412 нм. После этого аналогично примеру 1 строят. градуировочйую прямую, ко которой находят значение К = 0,66, и получают расчетную формулу Анализируют хитоэан, полученный щелочным дезацетилированием панциря кри- ля втечение 4 ч 200 мг полимера растворяют в 100 мл 0,1 М уксусной кислоты, отбирают 1 мл раствора и добавляют к нему 19 мл воды. Получают 0,01%-ный раствор хитозана. Проводят определение активности по методу Эллмана, расчет ведут по формуле (2). Ч/Ч 2,4, А = 9,2%,П р и м е р 7. В условиях примера 1 анализируют образец 0-метилхитоэана со степенью метилирования 0,5). Исходная концентрация раствора полимера 0,0125%. Получают значения Ч/Ч = 2,5, А = 8,3%.П р и м е р 8. В условиях примера 1 анализируют образец 0-карбоксиметилхи,/К тоэана (со степенью карбоксиметилирования 0,8), Исходная концентрация полимера 0,0125%, Ч/Ч = 2,2 и А = 6,6%.П р и м е р 9. В условиях примера 6 5 анализируют образец частично И-сукцинилированного хитозана. Исходная концентрацияполимера 0,0125%, Ч/Ч 1 = 2,1, А =г 9%Реализация предлагаемого способа по зволяет упростить и ускорить процедуруанализа (до 3 - 12 мин). При этом сохраняется низкий предел обнаружения аминогрупп 10 мг, что соответствует их содержанию 5;10%15 Формула изобретенияСпособ получения аминогрупп в хитозане и его водорастворимыХпроизводных, включающий приготовление водного рас-.твора исследуемого полимера с последую щиманализом аминогрупп, о т л и ч а ющ и й ся тем, что, с целью упрощения способа при сохранении низкого предела обнаружения аминогрупп, к раствору добавляют буфер, фермент - холинэстеразу и 25 его субстрат и регистрируют активностьфермента по сравнению с контрольной пробой, не содержащей полимера, а содержание аминогрупп рассчитывают по формуле где А - содержание аминогрупп, мас.,4;Ч - активность фермента в отсутствии35 полимера, Е/мг;Ч 1 - активность фермента в присутствииполимера, Е/мг;К - коэффициент пропорциональности ищ - масса полимера в реакционной смеси,40 мг.