Способ получения -лизина

Номер патента: 778256

Авторы: Бекер, Виестур, Клявиня, Лейте, Руклиша, Саксе, Селга, Швинка

ZIP архив

Текст

(56)по закл,2,У 498 циАН Латв СС льство СССР ство СССР 1973.Авторское 40, кл. А детел К 1/О 1, -Л 113 И 11 А ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТ 2696186/28-1312.12.7823,02,85. Бюл. Р 7А.К.Саксе, М,П.Руклелга, У,Э.Виестур,ейте, С,Ю.,Клявиця,вицка и М.Б,БекерИнститут микробиолвгуста Кирхсццтейц668.394(088.8)1. Авторское свидеявке У 2429702/13,12 П 13/06, 1976.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧ путем глубинного кул ьтивировацияробцых условияхсодержащейй азота, цеобходиаминокислоты дическом добав,цой среды с поего продуцецтов в аэ ца питательной среде источники углерода, мые минеральные соли и витамины при перно леции свежей питател ЯО 7782 следующим выделением лизина, о т.л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода лизина, в процес культивирования, начиная с 16-18 ч, в клетках продуцен 1 а определяют, активности декарбоксилазы диаминопимелицовой кислоты или соответствую. щие им концентрации Ь-лизина и при достижении критического для данной культуры уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты,-Лравной 12 - 9.10 моль лизина/смг белка, вводят свежую питательную среду до снижения уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты до 8-6.10 моль лизина/с мг белка, после чего продолжают. процесс культивирования и, начиная с 30-36 ч с начала процесса культивирования, при достижении активности 5.10 ф 4.10 моль лизина/с мг белка вводят источник углерода и витаминыдо сцижения активности до 2,5. 10"- 112.10 моль лизина/сфмг белка.Однако при многократном периодическом добавлении мелассы в среде -растет концентрация треонина, который. содержит меласса. Треонин совместно с лизичом вызывают мультивалентное ингибирование активности -аспартаткиназы, что в свою очередь резко уменьшает лизиноинтезирующую активность культуры и снижает выход . целевого продукта, Мультивалентное ингибирование активности Р -аспартки назы наступает при определенных пределах активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты.Эффект особенно выражен .при переработке концентрированных питатель 50 Изобретение относится к микробиологической промышленности, а имен" но к способу получения одной из незаменииых аминокислот 1.-лизина.В процессе ферментации в результате изменения сосТава питательнойсреды уменьшается темп роста клеток, а также изменяется их морфология, Биомасса стареет, в ней идут процессы автолиза и физиолого-биохимичес О кая активйость клеток падает. Это приводит к снижению выхода 1.-лизина,Известен способ получения 1.-лизина, согласно которому для повышения выхода целевого продукта в процессе 15 Ферментации, начиная с 16 до 30 ч определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидрогеназы, либо определяют активность изоцитратдегидрогеназы в клетках 20 продуцента и с учетом этого ведут весь процесс культивирования 11.Известен также способ получейия .-лизина путем глубинного культивирования его продуцентов в аэробных 25 условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, аминокислоты и .витамины при периодическомддобавлении свежей питательной среды с последующим выделением лизина 2 .Выращивание продуцента проводят при периодическом добавлении стерильного раствора одного из компонентов питательной среды мелассы,35 обеспечивающей поддержанйе редуцирующих веществ в культуральной жидкости в пределах 2,5-3%. Этот способ позволяет повысить выхоц Е-лизина до 30 г/л, а экономический коэффици" 0 ент выхода ,-лизина до 40,27 ных сред; концентрация редуцирующихвеществ 12-157,Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта.Цель достигается тем, что в процессе культивирования, начинаяс 16-18 ч, в клетках продуцента определяют активности декарбоксилазыдиаминопимелиновой кислоты или соответствующие им концентрации Ь-лизина и при достижении критического дляданной культуры уровня активностидекарбоксилазы диаминопимелиновойкислоты, равной 12-9.10 моль лизина/с мг белка вводят свежую питательную среду до снижения уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты до 8-6,10моль лизина /с мг белка, после чего продолжа-.ют процесс культивирования и, начиная с 30 - 36 ч с начала процессакультивирования при дост 1 ренииактивности 5.10- 4.10моль лизина/с мг белка, вводят источник углерода и витамины до снижения активности до 2,5,10 ц. - 2.10 1 моль лизина/с мг белка.В процессе культивирования определяют концентрацию Ь-лизина и поней судят об активности декарбоксила.зы диаминополимелиновой кислоты.Способ осуществляют следующимобразом.В качестве продуцента Е-лизина используют микроорганизмы рода Вге 1 Ьасег 1 шп или И 1 сгососсцз.После выращивания культуры в посевном ферментаторе дальнейшее куль-тивирование проводят в производственных ферментаторах на углеводнойпитательной среде, например мелас-сной, При Ферментации во время ростапродуцента рО поддерживают на уровне 20-257. от насыщения В составпитательной среды входят, кроме источников углерода,. дефицитные дляпродуцента аминокислоты и .витамины,а также источники азота и фосфора.Начиная с 16-18 ч, определяютактивность декарбоксилазы диаминополимелиновой кислоты (ДАП-ДК), уровень аэрации снижают до 10-122 насыщения, сохраняя интенсивность перемешивания системы. При достиженииуровня активности ДАП-ДК преимущественно 1,2-10 - 10" моль лизина//с мг белка в ферментатор добавляютсвежую стерильную питательную среду30 50 3 7782до достижения критической для даннои-икультуры активности ДАП-ДК 8 1 О,6.1;) моль лизина/с мг белка. Пита-тельную среду вводят непрерывно нлиотдельными порциями с интервалами 5в 1-2 ч. При достижении уровня ДАПДК 810 - 6,10 моль лизина//сек мг белка вводпитательной средыпрекращают, Ва время культивированиятемпературу поддерживают на уровне 10311 С, рН среды 7,4-7,8. При достижении уровня активности ДАП-ДК5,10 ц - 4.10 " моль лизина/сек тамгбелка, что происходит на 30-36-м часу культивирования, начинают вводить 15источники углерода и витамины даснижения активности ДАП-ДК до,-112,5 10 - 2,10 моль лизина/с мг белка. В качестве источников углеродаиспользуют глюкозу, сахарозу, фруктазу. После последней подпитки приактивности ДАЛ-ДК равной 2.10 моль-Цлизина/с мг белка процесс ведут ещенесколько часов да концентрации редуцирующих веществ равной 1-1,2%. 25После окончания культивирования изкультуральнай жидкости выделяют1.-лизин одним из известных методов,или получают кормовой концентратлизина.Активность ДАП-ДК определяют манаметрически па количеству образующегося углекислого газа при использовании в качестве субстрата диаминаполимелиновой кислоты.35Активность ДАП-ДК также определяют по концентрации лизина в культуральной жидкости.На чертеже представлена зависимость для культуры ВгечЬасгегцпГ 1 ачитп 221 Л активности ДАП-ДК отконцентрации 1,-лизина, где па асиабсцисс отложена концентрация 1.-лизи.на в г/л, а по оси ординат - активмоль 10 н лизина 45ность ДАП-ДК вс мг белкаТакая калибровочная кривая строится для каждой культуры,Ниже приведены примеры осуществления способа,П р и м е р 1. В качестве продуцента используют культуру ВгечЬасг.его Г 1 ачив 22 1.0. Исходную культуру размножают вначале на агаровыхкосяках, затем в колбах на качалке, 55а затем в посевном ферментаторе емкостью 400 л на мелассной питательной среде, Культивирование прадол 56 4жают 14 ч прц температуре 3+1 С, аэрации 60 мг 0/л мин, рН среды поддерживают в пределах 7,4-7,8, Посевной материал передавливают в ферментер емкостью 3000 л со средой следующего составаМеласса 470 кг (при содержании сахара 46 мас. %)Кукурузный экстракт 50 кг (йН,), 804 37 кг (МН 4)г НР 04 0,75 кг КН Р 04 0,75 кг Подсолнечное масло 3 л Вода До 1300 л Начальная концентрация РВ=14%, содержание 1,-лизина 2,8 г/л после добавления посевного материала.Во время роста продуцента рО поддерживают на уровне 20-25% насыщения, на 8-10-м часу рН увеличивают,;.до 7,4- 7,8 и поддерживают на этом уровне. На 18-м часу культивирования актив+/ ность ДАП-ДК составляет 9.10 моль лизина/с мг белка, содержание 1.-лизина 18 г/л, концентрация РВ 8,8%.В ферментатор непрерывно вводят в течение 2 ч стерильную свежую среду. со скоростью 1% РВ в 2 ч до снижения активности ДАП-ДК до 6,8"10 моль лизина/смг белка, содержание лизина 19 г/л. В дальнейшем активность ДАПДК определяют каждые 2-3 ч.После подпитки уровень аэрации уменьшают.до 10% насыщения На 37-м часу культивирования активность ДАП-ДК составляет 5.10 Я моль лизина/с мг белка, в среду вводят источники углерода и витамины.В качестве источника углерода вводят сахарозу двумя порциями с периодом в 2 ч до снижения активности ДАП-ДК до 3,4,10моль лизина/с мг белка, концентрация лизина на 48-м часу после подпитки составляет 48 г/л. Затем продолжают культивирование, а на 52-м часу вновь вводят сахарозу и витамины: биотин и тиамин до снижения активности ДАП-ДК - 2,2.10 " моль лизина/смг белка, концентрация лизина при этом составляет 58 г/л. После чего продолжают культивирование до концентрации редуцирующих веществ 1,4%. На 63-м часу ферментации культуральная жидкость содержит 65 г/л лизина, биомассы продуцента 24 г/л. Культуральную жидкость обрабатывают одним из известных способов, например, с по778256 ВЯИИПИ Заказ 546/3 Тиваж 525 Поютписиа Выжал шмшм Патект , г.Ужгород, ул.Проектиая, 4 мощью ионообменных смол для выделения Ь"лизина или получают кормовой концентрат лизина.Выхэд лизина из использованных РВ составляет 43,3%. 5П р и м е р 2. В качестве продуцентаиспользуют культуру ВгечЬасСегьцв Г 1 ачцщ КС. Посевной материал готовят по примеру 1, Затем ферментацию продолжают в пилотном 10 ферментаторе на среде следующего сосФтаваМеласса 1,65 кг (при содержании сахаров 46%)Кукурузный экстракт 15(ИН,), Яо, 150 гКНРО,. 2,5 гК,ЙРО,2,5 г 20 1 гСаСО 25 гПодсолнечное масло 30 гВодаДо 4,6 лКоличество посевного материала 8%.25Во время роста продуцента рО поддерживайт на уровне 20-25% насьпцения, Интенсивность неремешивания 600 об/ /мин. На 8-10-м часу ферментации рН увеличиваются до величины 7,6-7,8 30 и поддерживаютна этом уровне.На 14-м часу культивирования при активности ДАП-ДК 12.10 ферментацйи рН увеличиваются до величины 7,6-7,1 и поддерживают на этом уров не.На 14-м часу культивирования при активности ДАП - ДК 12.10моль лизина/с мг белка в среду вводят с периодом в два часа свежую питательную 40 среду из расчета использования РВ% в 2 ч. При этом между каждой подпиткой измеряют активность ДАП - ДК. Подпитку ведут до снижения активности ДАП-ДК до 7,5,10 моль лизина/смг 45 белка, Эта активность достигнута на 22-,м часу культивирования, концентрация лизина при этом составляет 26 г/л, На 24-м часу уровень аэрации снижают до 12% насьпцения. На 30-м 50 часу культивирования активность ДАП-ДК составляет 5.10 " моль лизина/смг белка. Концентрация лизина 35 г/л, в среду непрерывно вводят сахарозу и смесь витаминов В, и био тина. При содержании лизина 60 г/ли активности ДАП-ДК 2,1,10 моль лизина/с мг белка подпитку прекращают.К 52-му часу ферментации содержание лизина 80,5 г/л, биомассы продуцента 24 г/л, остаточные РВ,4%.Выход лизина от использования РВ составляет 43,5%.П р и м е р 3. В качестве продуцента 1.-лизина используют культуруМсгососсцз я 1 иапнсцз Т.-З,Культивирование ведут на среде,аналогичной примеру 1, В качествеисточника стим;ляторов роста используют гидролизат белково-витаминногоконцентрата,На 22-м часу ферментации активность ДАП-ДК составляет 9,2.10 смоль /лизина/смг белка, концентрация лизина 17 г/л, В среду непрерывно вводят свежую питательную среду до-н активности ДАП-ДК 6,6.10 моль лизина/с мг белка. Такая активность достигается к 32-му часу культивирования, концентрация лизина в культу- ральной жидкости 28 г/л. Затем уменьдают уровень аэрации с начального 15-20%-ного насьпцения до 10-12% насьпцения, На 48-м часу культивирования активность ДАП-ДК составляет-н4,10 моль лизина/с мг белка, в сре. ду порциями вводят глюкозу и витамины до снижения ДАП-ДК до уровня 2,5,10 " моль лизина/с .мг белка. Затем продолжают ферментацию до концентрации РВ 1,4%. На 65-м часу ферментации культуральная жидкость содержит Ь-лизина 48,5 г/л, биомассы продуцента в23 г/л. Выход 1.-лизина от РВ составляет 43,1%,В указанных примерах реализации рН среды поддерживают изменением аэрации в зависимости от активности лактатдегидрогеназы и изоцитратдегид - рогейазы, В конце процесса рН регулируют добавлением аммиачной воды.Таким образом, за счет устранейия эффекта мультивалентного ингибирования активности ф -аспартаткиназы увеличен выход целевого продукта до 80,5 г/л и соответственно увеличен выход лизина от введенных редуцирующих веществ до 43,5%

Смотреть

Заявка

2696186, 12.12.1978

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ ИМ. АВГУСТА КИРХЕНШТЕЙНА

САКСЕ А. К, РУКЛИША М. П, СЕЛГА С. Э, ВИЕСТУР У. Э, ЛЕЙТЕ М. П, КЛЯВИНЯ С. Ю, ШВИНКА Ю. Э, БЕКЕР М. Е

МПК / Метки

МПК: C12P 13/08

Метки: лизина

Опубликовано: 23.02.1985

Код ссылки

<a href="https://patents.su/4-778256-sposob-polucheniya-lizina.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения -лизина</a>

Похожие патенты