Способ получения фосфодиэстераз

ОП ИГРАНИ Е ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоцналистическикРеспублик787413 АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС 61) Дополнительное к авт У -2)Заявлено 27.11,2713 У 8-,1 3 С 07 02 соединением заявки Государственный комитет(23) Приоритет ло делам изобретений публнковано 15,12.80. Ьктллетень46(53) УДК 615 779 .94(088,8) ытнн ата опубликования описания 1 8. 12,. А. Луценко Д Бердыше Батур Авторы зобретенняКиевский ордена Ленина государственный университет им, Шевченко( 54) С ПОСО УЧЕНИЯ ФОСФОДИЭСТЕ РАЗ( чение 5 -фосих органов кар 1 б, включающие селезенку, мосразу же после Пол утре аныИзобретение относится к медицинской промышленности и касается получения биологически активных веществ, которые могут найти применение в метицине в качестве терапевтических средств.Известен способ получения фосфоди-5 эстераз путем гомогенизации исходного сырья с последующим отстаиванием гомогената, цекантированием образовавшейся надосацочной жидкости, содержащей фер- . ментный белок, и высаливанием целевого10 продукта сульфатом аммония 1. э тцелению проводят на холоду ри 0-4з г свежеполученной (или замороткани внутренних органов, рыб ают в гомогенизаторе (например-1; 2000 об/мин; 3 мин) в холодной дистиллированной воды. змельчения ткани добавляют еще дистиллированной воды и по капдят 0,4 М серную кислоту мл) до конечной кОнцентрации ее оре О,025 М, При этом рН гомо- снижается цо 3. Экстракцию фербелков осуществляют встряхиваоГената с кислотой в течение 100енной)мельч Однакспособомностью.Целью марки РТ 150 мл я повыше- После и ение 150 мл лям вво в ка 2 О (25 нутрен-, в раств левого гената ульфа вляетсв и. обретен ме ниесырьЭт ментныхн.ием гом рмент, полученный данным бладает недостаточной актив активности фер нто расшир евой базы.а цель достигается тем, чтотве сырья используют отходы в них органов рыб, а высаливание це процукта ведут при концентрации с та аммония 30-80%. Прим.е р 1фодиэстеразы иэ впа. Внутренние оргпечень, кишечник,поки и т, и. исполизвлечения из рыбженном вице до уп6 мес. беэ потериновоти), Все операц5 -фосфодиэстераз или хранят в заморотребления (вплоть добиологической актив6 6 Гомогенат после центрифугирован 2 0 Белок после осаждения АМБ от 0до 30% насыщенияи обессоливания 0 300(4,2 12 Белок после осаждния АМБ от 30 д80% насыщения иобессоливания. 1, выделение едлагаемым сподве стадии работЫ дн. для заверше-ход целевого проость которого появнению с исходАналогичные ре1выделении 5 -фосфвнутренних органоввующем увеличениичих растворов.Пример 2фодиэстеразы из впа. Все операции п ультаты получены п диэстеразы из 5 кг рыбы при соответст всех объемов рабоПолучение 3 -фосутренних органов ка о выделению 3 -фосукта, удельнаяышена в 20 р ктивн по ср 4-5 ч на механической качалке, либо отстаиванием его в течение 3-х сут при 2-4 С. Выход ферментных белков приодвух способах экстракции одинаков, но фосфодиэстеразная активность в первом случае выше. В ходе экстракции в описанных условиях (рН 3; 0,025 М серной кислоты; температура 0-4 С) резко0 снижается активность фосфомоноэстеразы и происходит денатурация сопутству ющих (балластных) белков, что способствует очистке целевого продукта.После окончания экстракции гомогенат центрифугируют ( например на центрифуге ИЛРпри 2500 об/мин, 30 мин) или фильтруют на воронке Бюхнера для удаления обрывков ткани, субклеточных структур и денатурированных белков. Осадок отбрасывают, а из прозрачной надосадочной жидкости проводят дробное фракционирование (высаливание) белков сернокислым аммонием. Высаливание проводят на холоду (2-4 С), постоянно переемешивая раствор и добавляя соответствуг, Как видно из табл.5 -фосфодиэстеразы пр собом включает в себя (требуюшие всего 1-3 ния) и дает высокий вь 13ющее количество сухого сернокислого аммония. Определение границ высаливания белков, облядаюших фосфодиэстеразной активностью, показывает, что они содержатся во фракции, полученной при насышении надосадочной жидкости от 30% до 80%. Полученный белковый осадок растворяют в минимальном количестве холодной дистиллированной воры (3-6 мл) и обессоливают известным способом, например диализом или гельфильтрацией на колонке, содержащей сефадекс Гили био гель Рили биогель Р.Обессоленный раствор фосфодиэстераз хранят в замороженном виде (6 мес без потери биологической активности) или сразу используют для гидролиза ДНК. В табл, 1 показано выделение препарата 5 -фосфодиэстераз из 100 г внутренних органов рыб, например карпа Сзрг 1 пць Сси.р 1 о Ь.13 ббелковый осадок растворяют в миним.зльном количестве (5-7 мл) холодной дистиллированной воды, обессоливают и хранят в замороженном вице (4-5 мес без потери биологической активности) или сразу используют для гицролиза ДНК.В табл. 2 показано выделение препарата 3 -фосфодиэстеразы из 100 г внутренних органов рыб, например кар- ва Сзрг(пм Сарово Ь. 7874 1 О Таблица 2 0 2 80 380,2 г/мл) 0 Гомогенат после центрифугирования 0 300 1,23(5,4 мг/мл) 6 Еелок после осаждения АМ 5 от 0до 30% насыщенияи обессоливания ж Белок после о дейия АМЬ о до 80% насыщ и обессоливан 0 206 18(4,1 мг/мл ) 5 3 ени ормула ретения Способ получения фосфо .тем гомогенизации исходн последующим отстаиванием цекантированием образова дочной жицкости, содержа ный белок и высаливанием дукта сульфатом аммония, ю щ и й с я тем, что, с ния активности ферментов сырьевой базы, в качеств зуют отходы внутренних о высаливание целевого прод при концентрации сульфата 80%. укта ведутаммония 30 Источники ин принятые во внимани 1. Авторское свиц у Мц 566589, кл, А 6формации,е при экспертизеетельство СССР1 К 35/68, 197 ВНИИПИ Заказ 8270/23 Тираж 495 Подписное фил иал ПППБ Патентф,г. Ужгород, ул. Проектная,5фоциэстеразы проводят на холоду при 0-4 С.100 гвнутренних органов рыб (свежеполученных или хранившихся замороженными) гомогенизируют, затем проводят водно-кислотную экстракцию белков из гомогената при рН 3 с последующимвысаливанием сульфатом аммония белков, обладающих 3 -фосфодиэкстеразной активностью (30% - 80% насыщения). Полученный после центрифугирования Из табл. 2 видно, что выцеление препарата 3 -фосфоциэстеразы предлагаемым способом включает цве стадии работы ( требующие 1-3 дн. для проведения), дает высокий выход фермента, удельная активность которого. повышена в 18 раз по сравнению с исходной,Аналогичные результаты получены при выделении 3 -фосфодиэстеразы из 5 кг внутренних органов рыбы при соответствуюшем увеличении всех объемов рабочих растворов.Предлагаемый способ позволяет повысить активность целевого продукта. Источник для получения целевого продукта (фосфодиэстераз) - внутренние органы рыб - является бросовым материалом, нигде ранее не использовавшимся. Поэтому он. является менее дорогостоящим материалом для получения фосфодиэстеразы, чем в известных способах. диэстераз пуого сырья сгомогената, шейся надосащей ферментцелевого проо т л и ч а- целью повышен расширениясырья испольрганов рыб, а