Способ получения карбоксипептидазы

(11)575353 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскик Социалистических Республик(43) Опубликовано 0510,77, Бюллетень37 (45) Дата опубликования описания 261077 С 07 О 7/020А 61 к 37/48 ГаауаарфтввкквВ кфптетВфветв Мккквтрев ВВВРкк Вкккв нк 1 иикВк вткрмтк 1(71) Заявитель Институт биохимии им.А.В.Палладина,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕП 1 ИДАЭЫ 1Изобретение относится к способу получения протеолитнческого фермента - карбоксипептидаэы (Кф 3.4.12), применяемой в пищевой, текстильной и медицинской промышленности, а также в научной и лабораторной практике.В проьвавпенном масштабе карбоксипептидаэу получают из сыръя животного происхождения - поджелудочной железы крупного рогатого скота - путем много"10 стадийной очистки.и выделения фракций, содержащей карбокснпептидазу, В результате получают суспензню фермента, весьма нестойкую при храненииВ настоящее время наиболее перспе тивными являются способы получения ферментов иэ микробных источников - дешевого сырья и мощного продуцента ферментов со специфическими свойствами.20Одним из таких способов является получение карбоксипептидазной фракции иэ проназы - ферментного комплекса актиномицета ЫгерФофицсеьрйвеиь (зйг . дгтьеаэ ) путем осаждения белков со лями, например сульфатом аммония, и органическими растворителями, фракциОнирования белков на ионообменных смолах и молекулярных ситах с выделением смеси ферментов, входящих в состав 30 2проказы, и их хроматографированил на колонке с амберлитом.Белок карбоксипептндазной фракции осаждают нз раствора сульфатом азвюоння, осадок растворяют в буфере и дат лее диализуют с получением фермента в виде раствора.Х недостаткам известного способа относятся низкий выход целевого продукта н получение фермента с низкие удельными активностью и стабилъноотъф при хранении.Цель изобретения - повюение стабильности фермента, его уделъной активности и выхода - достигается тем, то нз культуральной жидкости актнно мицета Ь, рЧьеоз после фильтрова" ння осаждают белки добавлением сульфата аммония до полного насыщения, а полученную после диалнэа карбоксипепт тидазу лиофилизируют в ацетатном буфере, содержащем ионы кальция, пред" почтительно в 0,05 М ацетатноМ буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальцияПример. 1,5 л культуральной жидкос тн -ктиномицета Я. Д 1"(зевав штаьм Сполученной с Киевского завода медпре паратов, Фильтруют, добавляют к филъз рату сульфат аммония до полного насы. щения (700-720 г соли на 1 л фильтра575353 10 формула изобретения Составитель А БочаровТехред С, Беца Корректор А.Кравченко Редактор Т.Шарганова т е т теет ее ттеет т тт те ттттеееетттттттт3988/18 Тираж 553 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Заказ филиал ППП Патент, г,ужгород, ул.Проектная, 4 та), центрифугируют (4000 т 6000 об/мин)на холоду в течение 1 час и суспендируют осадок в 50 мл воды, содержащей0,001 М ацетат кальция. Затем смесь диалиэуют 4-5 час против проточной воды и 12 час противдистиллированной воды с добавлением0,001 М ацетата калъция. Обаем жидкости после диалиэа увеличивается до100 мл,Диалиэат наносят ма колонку (5 хх 40 см), заполненную натрийкарбоксиметилцеллюлозой с емкостью 0,7 мг-экв,Белковые фракции влюмруют линейнымградиентом хлорида натрия (в одномсосуде 0,005 М ацетатный буфер, содержащий 0,001 М ионов кальция, а вдругом 500 мл 0,35 М раствора хлорида натрия в буФере).,39Полученную после хроматограФии тре тью фракцию осаждают насыщенным рас" твором (98) сульфата аммония, центрифугируют на холоду, растворяют в минимальном количестве 0,05 М ацетат 5 ного буфера, содержащего 0,01 М ацетат кальция, и дмализуют 2 час против проточной воды 12 час против буфера,Полученный диалиэат наносят на колонку (2 х 30 см) с амберлитом СУ в Ма - Форме, уравновешенную тем же буфером, и элюируют белковые Фракцюи лмнеймым градиентом ацетата натрия ( в одном сосуде 500 мл 0,05 М аце татного буфера, содержащего 0,01 М ионов кальция, в другом 1 М раствор ацетата натрия в этом же буфере).Полученную после хроматографий третью фракцию, содержащую карбоксипептидаэу, осаждают сульфатом аммония, дмализуют против ацетатного буфера и лиофилиэируют в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальция.Получают препарат карбоксипептидазы,гомогенной при рехроматографни на колонке с амберлитом СУ, при элект"рофореэе в полиакриламидном геле и пой-концевому анализу (аланин).7К преимуществам предлагаемого способа относятся получение высокоактивного, стабильного (лиофилизированныйпрепарат, содержащий 5-10 белка,сохраняет свою активность в течениенескольких лет) препарата карбоксит.пептидаэы с высоким выходом (выходпо белку от белков культуральной жикости 4 т 5, по активности 10 т 20) имикробного сырья, являющегося отход мпрм производстве антибиотиков,1.Способ получения карбоксипептида,эы иэ белкового сырья актиномицета Ыгароюусев рйвеюз, включающий извлечение из сырья белков осаждением сульфатом аююния, Фракционирование белков ионообменной хроматографи(ей с последующим диалиэом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения стабильности фермента, его уделъной .активности и выхода в качестве белкового сырья используют культуральную жидкость актиномицета, иэ которой после фильтрования осаждают белки добавлением сульфата аммония до полного насыщения, а полученную после диалмэа карбоксипептидазу лиофилизируют в ацетатиом буфере, содержащем ионы кальция.2.Способ по п.1, о т л и ч а вщ и й с я тем что лиофилизацмю проводят в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальция,