Способ получения нуклеозид-5-диили тирфосфатов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 ц 60880 б Союз Йоеетсник Социалистических Республик(22) Заявлено 09 исоединением заявк Государственный комитетСовета Вйинистров СССРао делам изобретенийи открытий(45) Да вания описания 07.06.78 публР, И, Ефимова, С. Н. Загребельный, В. А. С. Левина, Э. Г. Лубенец, С. А. Поздн С, М. Яснецкая, М. П, Ковале Новосибирский государственный университ органической химии Сибирского отделени конструкторско-технологическое бюро биол и Кемеровский научно-исследовательск промышленности, Д. Г. Кнорре,Г, Хмельницкийузик Ф. Зарытовякович, А.ва и В. С.ет, Новоси я АН ССС огически а ий институИзобретение относится к синтезу биологически активных веществ, а именно к усовершенствованному способу получения нуклеозид-ди- и -трифосфатов, и может быть использовано при получении рибо- и дезоксирибонуклеозид-ди- и -трифосфатов, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот 1 п иго при иепользовании ферментативных систем и создании новых медпрепаратов.Известны способы получения нуклеозид- 10 ди- и -трифосфатов, основанные на превращении нуклеозид-монофосфатов с использованием дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в более реакционноспособные нуклеозид-фосфамиды, которые затем обрабатывают соля ми орто- или пирофосфорной кислоты. Целевой продукт получают через нуклеозид-фосфоморфолиды. Как возможный вариант предполагаются нуклеозид-фосфоанилиды, -пиперидиды, -имидазолиды и некоторые другие 20 нуклеозид-фосфамиды, После выделения из реакционной смеси нуклеозид-фосфамиды обрабатывают солью орто- или пирофосфорной кислоты в диметилсульфоксиде (диэтилсульфоксиде) . Целевой продукт выделяют 25 анионообменной хроматографией (1. Однако такие способы сложны, нетехнологичны и требуют особых условий проведения процесса, так как включают работу с ДЦК, который является сильным аллергеном.Прототипом изобретения является способ получения нуклеозид-ди- или -трифосфатов, заключающийся в обработке пуклеозид-монофосфата раствором ДЦК в трет-бутаноле при температуре не менее 100 С, Полученный продукт отделяют от реакционной смеси и очищают осаждением, а затем нуклеозид- фосфамид взаимодействует с трибутиламмонийной солью орто- или пирофосфорной кислоты в среде сухого диметилсульфоксида, смесь хроматографируют на анионообменной смоле с последующим выделением целевого продукта из элюатов (21.Однако в этом способе используют ДЦК, который является сильным аллергеном; его применение требует соблюдения особых условий производства, специально оборудованных помещений, спецодежды. Первая стадия известного способа проходит при температуре не менее 100 С. Кроме того, на стадии получения промежуточного продукта последний отделяют из реакционной смеси и дополни.тельно очищают осаждением перед фосфорцлированием, что удлиняет процесс и значительно усложняет его технологию.С целью упрощения процесса предлагаетсяспособ получения нуклеозид-ди- или -трифосфатов, в котором ацилированный нуклеозид-монофосфат в абсолютном пиридинепоследовательно обрабатывают полистиролсульфохлоридом и амином с последующимснятием ацильной защиты. При этом обычноиспользуют полистиролсульфохлорид, предварительно набухший в пиридине в течение 3 -6 ч, Полученный нуклеозид-фосфамид обрабатывают солью орто- илн пирофосфорнойкислоты в среде органического растворителяпри 35 - 40 С.В качестве органического растворителяобычно используют абсолютный диметилформ амид,Полистиролсульфохлорид получают из сополимера стирола с дивинилбензолом (4/одивинилбензола, 0,6% изооктана).П р и м е р 1. Синтез уридин-дифосфата.1 г (1,6 ммоль; нуклеотидное содержание78% ) 2,3-0-ацетилуридин-монофосфата и6 г полистиролсульфохлорида, предварительно набухшего в течение 5 ч при комнатнойтемпературе в 80 мл абсолютного пиридина,встряхивают 14 ч при комнатной температуре. Полистиролсульфохлорид отделяют фильтрованием, промывают 50 мл абсолютного пиридина (5 Р,10 мл), а маточный раствор добавляют в 20 мл очищенного пиперидина. Через 20 мин смесь упаривают до масла, которое упаривают последовательно с абсолютным пиридином (ЗХ 15 мл) и с абсолютнымбензолом (5 К 15 мл), Полученный стекловидный остаток вводят в реакцию с трибутиламмонийной солью ортофосфор ной кислоты(8 ммоль) в 16 мл абсолютного диметилформамида, смесь термостатируют при 37 С18 ч, затем обрабатывают 20 мл 5%-ного водного раствора аммиака для снятия ацетильной защиты. Через 1,5 ч аммиак удаляютупариванием на ротационном испарителе исмесь хроматографируют на анионообменнойсмоле, ДЭАЭ-молселекте-Ав линейномградиенте концентраций бикарбоната аммония (О - 0,5 моля). Фракции основного пикаобъединяют, концентрируют, бикарбонат аммония удаляют упариванием с водой. Полученный остаток растворяют в 50 мл воды, лиофилизуют и получают 0,55 г (75%) уридиндифосфата, нуклеотидное содержание 98%(1,2 ммоль).УФ-спектр: Хманс 261 нр, Амин 230 нр.Продукт хроматографически однородный.По данным бумажной хроматографии (БХ) всистеме этанол - 1 М раствор ацетата аммония (5;2) одно пятно Я 0,15.П р и м е р 2. Синтез уридин-дифосфата.Аналогично примеру 1, но применяя вместо пиперидина 20 мл очищенного морфолина, из 1 г (нуклеотидное содержание 78%;1,6 ммоль) 2,3-О-ацетилуридин-монофос 5 1 О 15 20 25 зо 35 40 45 50 55 60 65 4фата получают 0,53 г (70/о) уридин-дифосфата с нуклеотидным содержанием 92%. Поданным БХ продукт хроматографически однородный,П р и м е р 3. Синтез тимидин-трифосфата.Аналогично примеру 1, но применяя вместо2,3-О-ацетилуридин-монофосфата 3-О-ацетилтимидин-монофосфат, а вместо трибутиламмонийной соли ортофосфорной кислотыиспользуя ту же соль пирофосфорной кислоты, из 1 г 3-О-ацетилтимидин-монофосфата(нуклеотидное содержание 89/о, 2,0 ммоль)получают 0,86 г (66/о) тимидин-трифосфата с нуклеотидным содержанием 93/о.УФ-спектр: Амане 267 нр,.По данным БХ в системе изомасляная кислота - концентрированный аммиак - вода(66: 1: 3) продукт содержит одно пятно сК 0,15, соответствующее тимидин-трифосфату и следы тимидин-дифосфата (К 0,25).В предложенном способе синтез нуклеозид 5-ди- или -трифосфатов проводят без ДЦК,что значительно упрощает процесс и увеличивает его безопасность, так как ДЦК обладает сильно выраженными аллергенными свойствами, особенно опасны его пары и растворы.При получении целевых продуктов по предлагаемому способу отпадает необходимостьвыделения из реакционной смеси и дополнительной очистки промежуточного соединения,что значительно упрощает процесс, делает егоболее технологичным. Снижается также температура проведения процесса на стадии образования промежуточного нуклеозид-фосфамида до комнатной.Таким образом целевой способ значительно сокращает количество операций в процессе синтеза нуклеозид-ди- или -трифосфатов,Формула изобретения1. Способ получения нуклеозид-ди- или-трифосфатов, включающий получение нуклеозид-фосфамида, обработку его солью орто- или пирофосфорной кислоты в среде органического растворителя, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения процесса, промежуточный нуклеозид-фосфамид получают путем последовательного взаимодействияацилированного нуклеозид-монофосфата всреде абсолютного пиридина с полистиролсульфохлоридом и амином с последующимснятием ацильной защиты.2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что используют полистиролсульфохлорид,предварительно набухший в пиридине в течение 3 - 6 ч.3, Способ по п. 1, отличающийся тем,что обработку нуклеозид-фосфамида проводят в среде абсолютного диметилформамида при 35 - 40,Источники информациипринятые во внимание при экспертизе1. Патент США Хо 3534017, кл. 260 в 2.5,опублик. 13,10.70,608805 Составитель Е. НиколаеваРедактор В, Мирзаджанова Техред А. Камышникова Корректор Т. Добровольская Заказ 688/12 Изд, Мю 428 Тираж 568 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 5 2. Мо 11 а 1 д. б. апд К 11 огапа Н. б. Ьупйе 818 апд Ьогпе геасйоп 18 о 1 пцс 1 ео 1 Ые-рЬоарЬо 6когпогрЬоЫа 1 еа. - 5. Агпег. Спегп. Ьос.,1961, 83, с. 649.