Способ получения иммобилизованных ферментных препаратов

Сею Юпетееа Социалистических Республик.2 С 076 7/О явк с присоединением Государственный комитет Совета Министров СССР по делаи изобретений) Дата опубликования описания 09.05,7) Авторы изобретени С. В, Ельчиц, В, Б. Пичко и В, А, Чугуй иевский технологический институт пищевой промышленност71) Заявит СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ции могут так омбинации пе Изобретение касается технологии ферментных препаратов и может быть использованов пищевой, фармацевтической и химическойпромышленности.Известны многочисленные способы иммобилизации ферментов 1,Все известные способы иммобилизации можно разделить на четыре основных метода: адсорбции, ковалентного связывания с носителем, заключения ферментов в гель и микроинкапсулирование.Кроме того, для иммобилизаже успешно использоваться и кречисленных методов.Прототипом изобретения является способ 15получения им мобилизованных ферментов,представляющий собой комбинацию ковалентной иммобилизации и иммобилизации путемизоляции фермента с помощью полупроницаемой мембраны (микроинкапсулирование) 21. 20Этот способ включает ковалентное связывание фермента в присутствии субстрата с гидрофильным носителем, содержащим реакционноспособные группы и последующее покрытиечастиц носителя с иммобилизованным ферментом полупроницаемой оболочкой, причем носитель получают при взаимодействии гексаметилендиамина и бисульфитного производногокарбоксилсодержащего полимера, напримерполиакролеина, В состав полупроницаемой 30 оболочки, которой покрывают частицы, входят различные производные целлюлозы, например карбоксиметилцеллюлоза, ацетилцеллюлоза и др.Однако такой способ длителен и трудоемок, поскольку процесс получения носителя длится от 18 - 20 ч до 4 дней и ведется в атмосфере азота при повышенных температурах (65 - 75 С). Процесс собственно иммобилизации длится 18 ч. В способе используются высоко- очищенные ферменты и дорогостоящие реактивы, что увеличивает себестоимость получаемых иммобилизованных препаратов.Кроме того, мелкие размеры частиц носителя с ферментом создают большое сопротивление при работе в непрерывно действующих колонках, что ограничивает их применение в технологических процессах.С целью упрощения процесса получения иммобилизованных ферментных препаратов при одновременном снижении себестоимости получаемых препаратов предлагается способ, состоящий из механического связывания фермента в присутствии субстрата с гидрофильным носителем - силикагелем, путем обкатки частиц силикагеля в растворе фермента и последующего покрытия частиц полупроницаемой оболочкой на основе ацетилцеллюлозы.В настоящее время силикагель широко применяется в практике иммобилизации фермен400,2 руб. 2,4 млн. руб./год 0,21 месяца 55 60 65 тов и др. биологически активных соединений как нейтральный носитель, обладающий высокой адсорбционной способностью, химической инертностью, Й хорошими физическими свойствами.; Отечественная промышленность выпускает йесколько видов силикагелей не только с хорошо развитой поверхностью, но и со строго определенным размером пор, что обеспечивает известную изоирательность в отношении молекул иммобилизуемого вещества.Технология способа состоит в следующем, Силикагель в виде сферических частиц с диаметром 2 - 3 мм обкатывают в дражировочном аппарате в водной смеси следующего состава, %;11 репарат фермента 1,0 Субстрат фермента 1,0 Крахмал 1,0Аэросил 0,5 Карбоксиметилцеллюлоза 0,5Субстрат, вводимый в смесь для обкатки, служит .для стабилизации фермента, остальные компоненты служат для более прочного связывания фермента с носителем. При этом аэросил может быть заменен акриламидом, а карбоксиметилцеллюлоза может быть исключена из состава смеси,Нанесение на носитель смеси указанного состава производится путем распыления при вращении дражировочного аппарата со скоростью 50 - 60 об./мин, Распыление смеси производится порциями, затем частицы носителя с нанесенной смесью подсушиваются в течение нескольких минут теплым воздухом (30 - 35"С). После нанесения всего количества смеси частицы подсушиваются и погружаются в охлажденный (О - 2 С) раствор пленкообразователя - 1% ацетилцеллюлозы в смеси ацетона и этанола, и высушиваются теплым воздухом. Операцию покрытия пленкой повторяют дважды и окончательно подсушивают частицы током теплого воздуха.П р и м е р 1, В качестве препарата фермента использован препрат р-галактозидазы, в качестве субстрата - лактоза. Активность препарата по лактозе составляет 150 - 200 ед./г.За единицу активности принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля субстрата за 1 мин при рН 4,2 и 30 С.Для обкатки частиц носителя используют 50 мл водной смеси следующего состава, %:Р-Галактозидаза 1,0Лактоза 1,0 Крахмал 1,0 Аэросил 0,5 Кар боксиметилцеллюлоза 0,5Нанесение смеси на частицы силикагеля (10 г) производится в дражировочном аппарате при постоянном его вращении методом распыления. Распыление производится порциями по 3 - 5 мл, после нанесения каждой порции частицы подсушиваются в течение 2 - 3 мин током теплого воздуха (30 - 35 С), Затем ча 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 стицы с нанесенной на их поверхность смесыд и окончательно подсушенные погружаются на 5 мин в охлажденный (О - 2 С) раствор пленкообразователя, содержащий 1% ацетилцеллюлозы в смеси ацетона и этанола (60: 40) и подсушиваются теплым воздухом. Операции пленкообразования и подсушивания повторяют два раза. Высушенные частицы промывают дистиллированной водой до исчезновения белка в промывных водах и снова высушивают теплым воздухом. Выход активности полученного препарата Р-галактозидазы 64,8%.П р и м е р 2, Аналогично примеру 1 получают иммобилизованный ферментный препарат на основе Р-фруктофуранозидазы (инвертазы) Азр. ачагпог 1 16. В качестве субстрата используют сахарозу. Активность инвертазы по сахарозе 5000 ед./г. За единицу активности инвертазы принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля сахарозы за 1 мин при 30 С. Выход активности полученного препарата инвертазы 68/о.Предлагаемый способ получения иммобилизованных ферментных препаратов обладает следующими технологическими преимуществами:возможность использования для иммобилизации неочищенных ферментных препаратов, выпускаемых промышленностью;максимальное сохранение нативных свойств ферментов;возможность применения для иммобилизации любых ферментов, катализирующих превращение низкомолекулярных субстратов;осуществление процесса с помощью технологических приемов, широко применяемых в промышленности;возможность широко варьировать размеры носителя;низкая себестоимость получаемых препаратов иммобилизованных ферментов.Предварительный технико-экономический расчет для строительства цеха по реализации предлагаемого способа производительностью 20 кг препарата в сутки с активностью 10 ед./г носителя с учетом затрат на строительство цеха, приобретение и монтаж оборудования (в том числе автоматической линии Штайнберг 18,5 тыс. руб.), основное и вспомогательное сырье, производственных рабочих и непроизводственных расходов показал следующее:Полная себестоимостьпрепарата 99,4 руб,/кг.Прибыль на 1 кгпрепаратаОбщая прибыльОкупаемостьРентабельность продукции 401% В настоящее время в нашей стране препараты иммобилизованных ферментов невыпускаются, а цены препаратов, выпускаемых зарубежными фирмами, составляют 30 - 120 руб,/г, т. е. 30000 руб.(кг,608804 Формула изобретения Составитель О. Скородумова Редактор В. Мирзаджанова Техред А. Камышникова Коррсктор А. СтепановаЗаказ 1371/5 Изд.421 Тираж 568 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 Таким образом, полная себестоимость препаратов иммобилизованных ферментов, получаемых целевым способом, составляющая при малых масштабах производства всего100 руб,/кг, в 300 раз ниже цен на аналогичные препараты, выпускаемые зарубежными фирмами. 1. Способ получения иммобилизованных ферментных препаратов, включающий связывание фермента с гидрофильным носителем в присутствии субстрата фермента и последующее покрытие полупроницаемой оболочкой, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве гидрофильного носителя используют силикагель, а связь 1 ваниефермента с гидрофильным носителем осуществляют механически - путем обкатки частицносителя в растворе фермента.5 2, Способ по и. 1, отличающийся тем,что в качестве фермента используют р-галактозидазу, а в качестве субстрата - лактозу,3, Способ по п. 1, отличающийся тем,что в качестве фермента используют инверта 10 зу, а в качестве субстрата - сахарозу.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Кестнер А, И. Иммобилизованные ферменты. - Успехи химии, 1974, т, 43, вып. 8,с. 1480.2. Патент США Мю 3730841, кл, С 07 б 7/02,опублик. 01.05.73,