Способ получения -аминокислот

пас; ю . э чфблис 76,д 1;д ОПИСАНИЕ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 4,01,76 (21) 230 с присое)анненнем заявки ряа Я) М. Кл. С 07 С 101/02 7 306/2 3-0 Гаеударетвеяяы% яваяте Савета Мяяяетрае СССР яа делая яавбретеябд я атярытяй23) Приоритет 43) Опубликовано 0502,78.Бюллетень рая 545) Дата опубликования описания 26.01,78(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ). -АМИНОКИСЛОТ Иэоб оме е относится к успособу полуироко применяеской., медицинсконности.й промышленностиолучают в процесидролиза рацемичминокислот с помой на носителе соверчениямых в шенствованному. Х -ацил нммобилиэован е асимских щьюаминоаци 0 лазы особы гидэы,иммобиносителях, юлозе 1, ства по о их неей спо- действию. ой нестаолученВЬ-амизы,м носи иммобите- " естен способ, в ко вмииоацилазу, вааоиост эльз Известны в частности сп ролиза с помощью аминоацил лиэованной на органически например на бромацетилцелл на ДЭАЭ - сефадексе 21,Но использование больши добных материалов ограниче удовлетворительной Фильтрующ собностью, подверженностью микроорганизмов, механическ бильностью.. Известны также способы п -аминокислот иэ М-ацилкислот с помощью аминоацил лиэованной на неорганическо леВ част и иэвтором исп уют билнэованную на силохр или силикагеле (3) .По этому способу (.-аминокислотыполучают многократно (5 раэ) иэ 0,5 М 5 растворов исходныхК-ацнл- П(- -аминокислот в присутствии .аминоацилазы,адсорбированной на силохроме.Однако и этот способ имеет ряд существенных.недостатков, основными из 1 которыхявляются сложность процессаввиду того, что требуется .сильное сгу-щение реакционной смеси при выделении .целевого продукта, так как концентрация исходной К-ацил- а)(. -аминокислоты: Ь ограничена (0,5 М) применением адсорбированной аминоацилазы,. которая может вымываться из носителя при повышенных концентрациях субстрата; относительно, низкий выход целевого.продук-. т(а та, так как иэ-эа низкой стабильности.адсорбированной аминоацилазывозможио осуществление лишь 5-кратного полу.чения ( -аминокислоты с одной и тойже порции нерастворимого фермента.Цель изобретения - повышение выхода целевого продуктаи упрощение про,цесса. Поставленная цель достигается,тем, что в качестве катализатора ис- З(1 пользуют аминоацилазу,ковалентно свя-,-аминокислот заключается в следующем:катализатор с ацилаэной активностью,приготовленный сяланизированием силохрома яли силикагеля 4 -аминопропилтриэтоксясиланом и присоединениемаминоацялазы через производное .дихлор-симм-тряазяна, например активного красителя ярко-голубого КХ или ярко-оранжевого, хранящегося при 4-9 Св растворе И -ацетиламииокислоты,отфильтровывают, промывают 0,1 И Фосфатным буфером с рН 7,2 и еще влажный помещают в сосуд для проведения. реакции,Иэ предназначенного для превращения количества рацемической Н -ациламинокислоты готОвят ВОдный раствору 20рН которого устанавливают концентрированным водным аммиаком на 7-8,что-.бы концентрация исходной И-ацилааминокислоты была от 0,5 до 1,0 Ия вводятв сосуд с катализатором.Реакционную смесь выдерживают при37-40 С, изредка перемешивая до завершения реакции получения-аминокислоты, прячем молярная концентрацияОбразующейся-амянокислОТЫ дОСТИгает половины концентрации исходнойрацемяческой М-ациламинокяслоты,Отфильтровывают катализатор от ре-акционной смеси, промывают 0,1 И ФосФатньы буфером с рН 7,2, после чегоего можно испольэовать повторно; такое использование без снижения ферментатявной активности катализатора можно повторять не менее 10 раэ. Растворполучаемой реакционной смеси концентрируют в вакууме при 0-50 С, образующуюся-аминокислоту выделяют известными приемами.Повышенная устойчивость ковалентносвязанного Фермента по сравнению с адсорбированным позволяет работать сболее концентрированными растворамисубстратов и увеличить кратность использования ковалентно яммобилизованной аминоацилазы тем сам: 1 повысиввыход целевого продукта примерно вдвое 0Пример 1. 20 г силохрома С(Фракция 0,1-0,16 мм), б мл-амино-:".ропилтряэтоксисялана и 200 мл абсолютного этанола кипятят при перемешиВании 30 ч. Силаниэированный силохромотфильтровывают, промывают 1 л абсолютного этанола. Продукт сушат сначала на воздухе в течение 12 ч, потом1 ч над пятиокисью Фосфора в вакууме( 5 мм рт. ст. ) пря 180-190 С.Количество аминогрупп 600 мкмоль/г 60НОСИТЕЛЯ,4 г силанизированногосялохрома смешивают с раствором 0,15 г активногокрасите ярко-голубого КХ в 60 млдиметилформамида и оставляют на 12 ч 65 при коМнатной температуре, Продукт отФильтровывают, промывают 30 мл диметнлФормамяда и сушат в вакуум-эксикаторе. ьК 1 г активированного носителя прибавляют 1 мл экстракта ацетоновогопорошка свиных почек в 0,1 н. Фосфат.- ном буФере (рН 7,2) с общей ацилазной активностью 2000 мкмоль/час Ь -аланина и 4 мл 1 М Я -ацетил-ПЬ -аланина, выдерживают 10 мин при комнатной: температуре. Иммобилизованную аминоацилазу отфильтровывают, промывают дважды 20 мл 1 М раствора хлористого натрия, 20 мл 0,1 М Фосфатного буфера ( рН 7,2) .Получают катализатор с общей ацилаэой активностью 1000 мкмоль/час аланина.Полученную иммобилиэованную аминоацилазу хранят в растворе К -ацетилаланина при 4-9 фС.Пример 2. 2 г катализатора с ацилазной активностью 1000 мкмоль/часЬ -аланина, полученного согласно ме-.тодике примера 1, загружают в колбус 100 мл 1 И раствора рацемическогоМ -ацетилаланина рН которого устанавливают. концентрированным аммиакомна 8,0.я выдерживают в термостате при37-40 С в течение 24 ч. После окончания реакции катализатор отфильтровывают, промывают 0,1 М Фосфатным буфером с рН 7,2 и используют вторично.Полученный раствор. обрабатывают активированным углем, упаривают в вакууме до сиропа при 45 фС. После охлаждения до комнатной температуры добавляют. 100 мл зтанола и останавливаютна 16 ч при 4 С для кристаллизации.Кристаллы-аланина отфильтровывают,промывают спиртом и высушивают при50 С до постоянного веса,Выход ).-аланина 3,9 г (87,5 Ъ).А 1 з =1 ч,2 ЧС:1; 5 н. соляная кислота).Вычислено,Ъ: С 40,44; Н 7,92;Я 15,72.Йайдено,В: С 40,49; Н 8,04," Я 15,74,Пример 3. Гядролиэ К-ацетилаланинаосуществляют, как в примере 1, с многократным введением в процессе катализатора, использованного в примере 2(2 г катализатора с ацилазной активностью 1000 мкмоль/час Ь -аланина)Катализатор в процессе гядролиэаиспользуют 9 раз без снижения ацилазной активности.Общий выход Ь -аланяна 39. г на10 процессов.Выход .-аланина на 1 .г катализато-;ра 19,5 г.Прймер 4. 2 г катализатора с ацялаэной активностью 1200 мкмоль/час1. -метионина загружают в колбу с100 мл 1 М растнора рацемическогб Кацетилметяонина, рН которого устанав 15 Формула изобретения Составитель С,ПлужновГехред М.келемеш Корректор,М,Демчик Редактор Т.Шарганова Заказ 527/20 Тираж 559. Подписное ЦНИИПИ ГосударствЕнного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035 р Иосквар Жу Раушская наб,у дв 4/5Филиал ППП ффПатеитф, г.ужгород, ул. Проектная, 4 ливают концентрированным аммиаком наВ,О, и выдерживают в термостате при37-40 С в течение 21 ч. После окончания реакции катализатор отФильтровывают, промывают 0,1 М ФосФатным буФером с рН 7,2,используют вторично.Полученный раствор обрабатывают активированнцм углем, упаривают в вакуу-.ме до сиропа при 45 С.После охлаждения до комнатной температуры добавля- (Оют 100 мл этанола и оставляют на 16 чпри 4 С для кристаллизации. Кристаллы1- -метионина отФильтровцвают, промывают спиртом и сушат при 50 С до постоянного веса,Выход Ь -метионина.6,54 г (883),А в -+25(с:О, 5-2, О; 5 н, солянаякислота) .Вычислено,4:С 40,25; Н 7,43; Я 9,39.Найдено, в Ъ: С 40,16; Н 7,51;М 9,62.Пример 5. Гидролиз И -ацетилметионина осуществляют по методике приме, ра 4 с многократным введевюем в процесс катализатора, использованного впримере 4 (2 г катализатора с ацилаэной активностью 1200 мкмоль/час-метионина).Катализатор в процессе гидролиэаиспользуют девятикратно без сниженияацилаэной активности, . 30Общий выход Ь -метионина 65,4 г за10 процессов Выход (. -метионина на1 г катализатора 32,7 г. Пример 6. 2 г катализатора с аци азной активностью 940 мкмоль/час . -серина загружают в колбу с 100 мл 1 М.раствора рацеьщческого (. -ацетилсерина, РН которого устанавливают концентрированным аммиаком на 8,0, и вы держивают в термостате при 30-40 С в течение 27 ч. После окончания реакции катализатор отФильтровывают, промывают О, 1 И ФосФатным буФером срН 7,2 и используют вторично, Полученный раствОР обрабатывают активированным углем, упаривают в вакуумедо сиропа прк.45 фС. После охлажпения до комнатной температуры добавляют 100 мл этанола и оставляют на 16 чпри 4 фС для кристаллизации. Кристаллы (.-серина отФильтровывают, промывают спиртом и высушивают при 50 Сдо постоянного веса.Выход (. -серина 4,6 г (90).Ь.4.1)=:+13,5 (с 0,5-2; 5 н. соляная кислота).Вычислено,%: С 34,29;Н 6,71; И 13,38Найдено,%: С 34,40 1 Н 6,51," Ы 13,71.Пример 7. Гидролиэ М-ацетилсерина осуществляют по методике примера6 с многократным введением в процесскатализатора, использованного в примере 6 (2 г катализатора с ацилазнойактивностью 940 мкмоль/час ) -серина),Катализатор в процессе гидролиэаиспользуют девятикратно без сниженияацилаэной активностиОбщий выход 1.-серина 46 г за 1.0процессов, Выход 1,-серина на 1 гкатализатора 23 г,Способ получения Ь -аминокислот путем асимметрическОго гидролиэа рацемических К -ациламинокислот в присутствии катализатора-иммобилизоваяной амияоацилазы,о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, в качестве катализатора используют аминоацилазу, ковалентно связанную с силанизкрованным носителем через симм-триазиновый циклИсточники инФормации, принятые во внимание при экспертизе:, патент ФРГ ( 2105009,кл.12 ф 6/01, 15.11.73.2. Патент Англии 9 1072876 кл . С 2 С, 21,06,76.3, Авторское свидетельство СССР В 523892, кл.С 07 С 101/02, 1976.