Способ получения l-триптофана

О П И С А Н И Е 24735ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Сова Соеетеаиа Социалистичеокиа РеопубликЗаявлено 25.Х 11,1967 ( 1206055/28-13)с присоединением заявкиПриоритетОпубликовано 04.Л 1.1969. БюллетеньДата опубликования описания 22,Х 11.196 МПК С 071 С 12 д УДК 663.132:576.8.097Комитет по делам изобретений и открыт при Совете Миниотро У 4 минняЦд" 0Т 1 Х 11 ИЧИЕАЯ БИБЛИОТИА Авторыизобретен. К, Озолин Е, Л. Рубан, Л. Б. Лобырева, Т. К. Аболи Бекер, Ю. О. Якобсон, С. Э, Селга, У. Эи М. И. Верховцева Кирхен шт Институт микробиологии имени Августа Заявитель ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1.-ТРИПТОФ состоит в следуи 1111 з 295 поддагаре. Готовятем составе:85,0 г/47,2%узам ещенньш ющем.рживают питательСущность способаКультуру Сапд 1 дна скошенном суслоную среду в следующМел ассаФосфат калия дСульфат мапп 1 яХлористый кальМочевинаВода сахар ,1 г ,05,1 ,01 л рилизуют от атм, а ми ати, рН мочевинултин при30 лин п 7,5 - 8,2. Причем мелассу и дельно в течение 20 теральную среду - среды устанавливаю Известны способы получения 1.-триптофанапутем глубинного выращивания продуцирующих его дрожжей штамма Сапд 1 да ц 1111 з 295 вводной питательной среде, содержащей источник углевода, с добавлением необходимыхдля роста минеральных солей фосфора, магния, кальция, азота в присутствии антраниловой кислоты как предшественника триптофана,с последующим выделением триптофана изкультуральной жидкости одним из известных 10способов,Предлагаемый способ сокращает процесс иувеличивает выход 1.-триптофана. Для этогопроцесс выращивания 1.-триптофана ведут вдве стадии. В первой стадии производят максимальное накопление биомассы при аэрациисреды, а во второй - непосредственный биосинтез 1.-триптофана при снижении расходакислорода воздуха и дробном добавлении антраниловой кислоты как предшественника 20триптофана.Для интенсификации процесса келательнопервую стадию проводить при интенсивностиаэрации не,ниже 120 мг О,/л,хин, температуре28 - 30 С и рН среды 7,5 - 8,0, а вторую - приинтенсивности аэрации 60 - 80 лг О /л.,яин,той же температуре и том же значении рН.В качестве источника углеводов для ростабиомассы и биосинтеза 1.-триптофана предлагается использовать свекловичную мелассу. С целью получения 1.-триптофана для кормовых целей полученную культуральную жидкость после окончания процесса выращивания можно обезвоживать одним из известных способов.Для уменьшения объема культуральной жидкости, получеой в процессе выращивания, и повышения концентрации 1.-триптофана после первой стадии целесообразно концентрировать биомассу одним из известных способов, например сепарированием, а микробную суспензию антисептировать, например, при помощи этилового спирта с последующим разбавлением стерильной средой.Сапд 1 да цИ 1 з 295 с сусло-агатового косяка переносят в колбы, круговой качалки для размножения культуры, после чего максимальное накопление биомассы - первую стадию - проводят в заранее простерилизованных ферментаторах с питательной средой для осуществления глубинного культивирования. Количество засевного материала при последовательных посевах составляет не менее 8% абсолютно сухой биомассы от концентрации перераба тываемого сахара. Температура ферментации 28 - 30 С, рН 7,5 - 8,0, Интенсивность аэрации не менее 120 мг О,/л.мин (ло,сульфитному методу). После размножения необходимого количества биомассы (не менее 18 г/л абсолют но сухого вещества дрожжей) ведут вторую стадию процесса - биосинтез Е-триптофана.К дрожжевой суспензии равномерными порциями добавляют 40% по объему раствора мелассы или глюкозы с содержанием 2% са хара. Длительность интервала подачи раствора при периодическом процессе 6 - 24 час. К суспензии через 0,5 - 2 час после каждой задачи сахара порциями добавляют 0,3 - 0,4%антраниловой кислоты в виде 5%-ного спир тового раствора или 5%-ного водного раствора антранилата натрия и 0,8 - 0,9% мочевины в виде водного раствора, рН культуральной жидкости во время процесса поддерживают 7,5 - 8,0, температуру 28 - 30 С, интенсивность З 0 аэрации 60 - 80 мг О.,/л.мин. Общая продолжительность ферментации 6 - 8 суток.Культуральную жидкость сепарируют из фугата при помощи ионнообменных смол, выделяют 1.-триптофан в кристаллическом виде. З 5 Выход продукта в неочищенном виде 90%, лосле перекристаллизации 65 - 70%.П р и м е р, Пример составлен для работы в 100-литровом ферментаторе. Активный штамм дрожжей Сапд 1 да цИ 1 з 295 сохраняют на ско шенном сусло-агаре и пересевают один раз в месяц. После пересева выдерживают 48 час в термостате при 28 - 30 С, а затем сохраняют в холодильнике. Далее проводят подготовку посевного материала для ферментации. Куль туру смывают с косого агара в пробирку 3 мл стерильной ниже указанной средой и высевают на чашки с сусло-агаром по 0,1 - 0,2 мл на чашку, размазывают шпателем и выдерживают в термостате при 28 - 30 С 48 час. Вырос шие на сусло-агаре дрожжи снимают с по верхности чашек стеклянной лопаточкой и переносят в колбу со стерильной средой, Полученную густую суспензию дрожжей с соблюдением условий стерильности переносят в коли честве 15 - 20 мл в конические колбы емкостью 250 мл, содержащие по 10 мл питательной среды следующего состава (в г/л): меласса 104, мочевина 5, К 2 НРО 4 0,1; МАЗО 0,05, СаС 1, 0,1, рН 7,5 - 8,0, Колбы выдерживают на ка чалке 24 час при 28 - 30 С. После 24 час выращивания содержимое колб в стерильных условиях переносят в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие по 100 мл питательннои среды вышеуказанного состава. На качалке колбы выдерживают 24 час при 28 - 30 С. После 24 час выращивания на качалке биомасса дрожжей используется для дальнейшего, накопления дрожжевой массы в ферментаторе.Процесс ферментации в ферментерах проводят следующим образом, Производственную питательную среду следующего состава (в г/л): меласса 62,3, мочевина 5, К 2 НРО 4 0,1, СаС 12 0,1, Мд 304 0,05 стерилизуют при 1 атм 30 мин, рН среды 7,5 - 8,0.После охлаждения до 30 С туда в стерильных условиях переносят посевной материал, который составляет не менее 3 - 5 г/л сухого вещества. В ферментере в течение 24 час дрожжи культивируются при аэрации не менее 120 мг О/л.мин,В качестве пеногасителя можно использовать подсолнечное масло, кашалотовый жир или кремнийорганическое соединение.Через 24 час в культуральную жидкость добавляют антраниловую кислоту в виде 5%- ного спиртового раствора в количестве 175 мл и мочевину в виде 50%-ного раствора 50 мл. После дооавки антраниловой кислоты начинается вторая стадия ферментации - биосин.тез 1-триптофана. Уровень аэрации снижается до 50 мг О,/л.мин. После добавления в среду антраниловой кислоты или мочевины через 4 час добавляют мелассу в виде 25%-ного раствора до 840 мл. На дальнейшем этапе ферментации добавки проводят в следующем порядке: мелассный раствор добавляют через каждые 12 час ферментации, антраниловую кислоту одновременно с источником азота добавляют через каждые 6 час ферментации, Все растворы добавляются по вышеуказанным количествам.Через 144 час ферментацию прекращают. Биомассу отделяют, культуральную жидкость используют для выделения кристаллического триптофана. Предмет изобретения1. Способ получения 1.-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующих его дрожжей штамма Сапд 1 да ц 1111 з 295 в водной питательной среде, содержащей источник углевода, с добавлением необходимых для роста минеральных солей фосфора, магния, кальция, азота в присутствии антраниловой кислоты как предшественника триптофана, с последующим выделением 1-троптофана из культу- ,ральной жидкости одним из известных способов, отличающийся тем, что, с целью увеличения,выхода 1 -триптофана и сокращения времени для его,получения, выращивание дрожжей ведут в две стадии, в,первой из которой производят максимальное накопление биомассы при аэрации среды, а во,второй - непосредственный биосинтез 1.-триптофана при снижении расхода кислорода воздуха и дробном добавлении антраниловой кислоты как предшественника триптофана,247315 Составитель В. ДуньеРедактор В, Смирягина Текред А. А. Камышникова Корректор О. Б, Тюрина Заказ 3428/19 Тираж 480 По 1 пнсносЦНИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРМосква, Ж, Раушская наб., д. 45 Типография, пр. Сапунова, 2 2, Способ по п, 1, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, первую стадию проводят при интенсивности аэрации не ниже 120 мг Ол,мин, а вторую - при интенсивности аэрации б 0 - 80 мг О./л,мин. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем,что первую стадию проводят при температуре 28 - 30 С и рН среды 7,5 - 8,0, а вторую - при той же температуре и том же значении рН. 5