Способ получения биологически активной фракции из спермы животных

(51)5 А 61 К 35/ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНВЕДОМСТВО СССР% Е ч сс ЕНТУ я к биотехнолоолучения биолоств из сырья(71) Инженерный центр "Биотрон" Института биоорганической,химии и нефтехимии АНУССР и Институт биоорганической химии инефтехимии АН УССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ФРАКЦИИ ИЗ СПЕРМЫЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относитсгии, а именно, к способам игически активных сред Изобретение .относится к биотехнологии, а именно к способам получения биологически активных средств из сырья животного происхождения.Целью изобретения является повышение качества целевого продукта за счет устранения иммуногенных свойств средства, получаемого из спермы, путем удаления вы. сокомолекулярной составляющей,Для достижения цели в способе пблучения биологически активного средства,из спермы, которую сначала подвергают термической обработке, затем получают растворимую фракцию, которую. разделив на высокомолекулярную и низкомолекулярную фазу, стерилизуют и концентрируют до получения целевого продукта, предложено в ка. честве сырья использовать как нативную, так и криоконсервированную сперму, кото 2животного происхождения, Цель изобретения - устранение иммуногенных свойств целевого продукта, получаемого из спермы, Способ включает следующие операции: термическая обработка спермы, получение растворимой фракции, разделение на высоко- и низкомолекулярные составляющие, стерилизация и концентрирование до получения целевого продукта. Новым в способе является использование в качеств сырья не только нативной, ко и крмоконсервированной спермы, которую инкубируют при температуре 80-90 ОС в течение 0,5-1 ч пои перемешивании, отстаивание 5-15 ч при 15 - 25 С, разделение на высоко- и йизкомолекулярные составляющие путем диализа или коло- Я ночной хроматографии, причем в качестве целевого продукта стерилизуют соответственно диализат или низкомола куля рную составляющую.гф рую сначала инкубируют при температуре 80-90 С в течение 0,5-1 часа при перемешивании и отстаивают в течение 5-15 часов при температуре 15-25 С, а растворимую фракцию разделяют методом диализа или колоночной хроматографии, причем в качестве целевого продукта стерилизуют соответственно диализат или низкомолекулярную фракцию.Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения способа (примеры 1-5) и испытаний нового биологически активного средства (пример 6).П р и м е р 1. 50 мл нативной спермы, полученной от быков-производителей, вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и инкубируют в течение 30 мин. при температуре 80 С, Скорость перемешивания. 120 об/мин, После окончания нагревасмесь выдерживают при температуре 25 С в течение 5 часов при периодическом перемешивании. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием при 5000 об/мин. Полученную растворимую фракцию помещают в целлофановый мешок (гидратцеллюлозные мембраны для гемодиализа "Диацелл" ТУ 6-06-475-80 производства Балаковского ПО "Химволокно"), Диализ проводят против дистиллированной воды, в соотношении 1;1 при температуре +4 С, в. течение 24 часов, Диализат, содеркащий вещества с молекулярной массой не более 1 кДа, стерилизуют ультрафиолетовым облучением и лиофильно, высушивают,П р и м е р 2, 250 мл спермодоз (50 мл); разбавленной в защитной среде спермы, вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и разморакивают при комнатной температуре. Размороженныф спермодозы инкубируют при перемешивании со скоростью 120 об/мин. в.течение 60 мин, при температуре 90 С. После прекращения нагрева смесь выдерживают при температуре 15 С при периодическом слабом перемешивании . в течение 15 часов, Образовавшийся творокистый осадок уда ляют центрифугированием при 5000 об/мин. Полученную растворимую фракцию диализуют, как описано в примере 1, а диализат, содержащий вещества с молекулярной массой не более 1 кДа, облучают ультрафиолетовым светом и лиофильно высушивают,П р и м е р 3. 250 спермодоз (50 мл) разбавленной в защитной среде спермы вносят в стеклянный стакан, снабженный мешалкой, и подвергают размораживанию при комнатной температуре. Размороженные спермодозы инкубируют при перемешивании со скоростью 120 об/мин, в течение 60 мин, при температуре 90 С. После прекращения нагрева, смесь выдерживают при температуре 15 С, при периодическом слабом перемешивании 15 часов. Образовавшийся творожистый осадок удаляют фильтрованием. Фильтрат лиофильно высушивают, растворяют в физиологическом растворе до концентрации 100 мг 7 мл и наносят на колонку, заполненную сефадексом марки 0-15 (РЬагпаса), Элюцию проводят физиологическим раствором. Высокомолекулярную составляющую, выходящую со свободным объемом колонки, отбрасывают, Низкомолекулярную составляющую (элюат) с молекулярной массой ниже 1 кДа стерилизуют ультрафиолетовым облучением и лиофильно высушивают, 45 50 лей, прошедших иммунизацию диализатомспермы. В периферические лунки - серию разбавлений исходного раствора диализата спермы, Антисыворотку и диализат спермы разбавляют физиологическим растЬором.Это делается для подбора оптимального соотношения их концентраций. Иммунодиффузию ведут во влажной камере при комнатной температуре в течение 2 дней. По окончании процесса иммунодиффузии полосы преципитации обнаружены не были как визуально, так и при окрашивании красителями типа Кумасси ярко-голубой бриллиантовый В. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии иммунного ответа организма на диализат спермы. ПреП ример 4, 250 спермодоз (50 мл)размораживают, инкубируют, отстаивают, фильтруют и концентрируют как указано в примере 3. Колоночную хроматографию осуществляют на молселекте марки 6-10 (Веапа), Стерилизацию и лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют как указано в примере 3.П р и м е р 5. 250 спермодоз (50 мл) "0 размораживают, инкубируют, отстаивают,фильтруют и концентрируют как указано в примере 3.Колоночную хроматографию осуществ-ляют на биогеле марки Р(Во-Вад),Стерилизацию и лиофильное высушивание целевого продукта осуществляют как указано в примере 3.Пр и м е р 6. Для проверки иммуногенности полученного средства из диализата 20 спермы проводят иммунизацию кролейспермой и диализатом ее с адъювантом Фрейнда. Инъекции осуществляют внутри- кожно во множественных местах с двухнедельным интервалом в течение 2 месяцев, Забор крови проводят на 8-й день после последней инъекции из ушной артерии или вены. С помощью метода двойной радиальной иммунодйффузии в теле было проведено тестирование полученных 30 антисывороток. 1,5% ный раствор агара в0,05 М трис-барбитуратном буфере.(рН 8,0) с 0,15 М йаС заливают на обезжиренные, строго горизонтальные стекла, до получения слоя толщиной примерно 1,5 мм, В за твердевшем теле по шаблону вырезаютцентральное отверстие - "лунку", а вокруг него еще 6 "лунок", так чтобы расстояния между ними составляли 5 - 10 мм. Лунки вырезают трубочками с острыми краями диа 40метром 3-4 мм гель из них удаляют отстаиванием, Лунки до края заполняют соответствующими растворами. В центральную лунку наливают разбавленную антисыворотку, полученную из крови кро181 б 211 Формула изобретения Способ получения биологически активной фракции из спермы животных, включающий термическую обработку сырья, центрифугирование, фильтрацию надосадочной жидкости с последующей стерили Составитель А. ИвановТехред М,Моргентал Корректор Г. Кос Редактор Заказ 1646 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 имущество нового способа по сравнению с известными аналогами заключается в создании простого способа получения из нативной и криоконсервированной спермы биологически активного средства, которое не вызывает иммунногенных реакций, что экспериментально доказано,зацией и концентрированием целевого продукта, отл и ч а ю щи йс ятем, что, с целью повышения качества целевого продукта зэ счет устранения иммуногенной активности, 5 в качестве сырья используют дополнительно криоконсервированную сперму, термическую обработку проводят при температуре 80 - 90 С в течение 0,5 - 1 ч при перемешивании, отстаивают при 15 - 25"С в 10 течение 5-15 ч, надосадочную жидкость разделяют на фракции путем диализа или колоночной хроматографии, выделяют фракцию, содержащую целевой продукт. с мол. мас, не более 1000 дальтон,