Способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 С 12 0 1/ 0."Я7 Б:ьТЕНА АНИЕ ИЗОБРЕТЕ АТЕНТУ Изобретение отн химической генетики определения изоферм гидрогеназ в листьях осится к области био а именно к способам ентов, в частности де ерсикового растения Известен способ геназ в листьях пе включаюгций электро творов из тканей, с и мической окраской обладающих фермент определени рсикового форез белк оследующе для выявл ативной акт я дегидрорастения, овых расй гистохиения зон, и вностью. ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕЕДОМСТВО СССРОСПАТЕНТ СССР)(73) Научно-исследовательский институт садоводства, виноградарства и виноделия Грузинской республики и Всесоюзное научно-производственное объединение по чаю, субтропическим культурам и чайной промышленности(56) Я,Агазе 1 саг, О.Е,Рагид, О/.Веггез, Р.Е.НапзсЬе. лепетсз о 1 паат беЬсго 9 епаз зогутез п йе реасй. ТЬе 1. о 1 Негеббу, 77, р, 49 - 51, 1986.В,Е.ОигЬап, О.А.Мооге апб И/.В.ЯЬагеап. - 1 золупе Вапйп 9 рапегпз апс Фег изеЬпезз аз цепейс тагМегз и реасйе. З,Агпег, Яос, Ной. Зс 1. 112 (6), 1987, р. 1013 - 1018.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗ В ЛИСТЬЯХ ПЕРСИКОВОГО РАСТЕНИЯ(57) Использование: область биохимической генетики, способы определения изоферментов - дигедрогеназ в листьях персиковогб растения. Сущность изобретения: способ включает нанесение препарата ферментов на 200 ь полиакриламидный гель и использование в качестве буферных систем составов - Трис - 215 г, ЕДТА - 18 г, НзВОз - 110 г, Н 20 до 2,5 л с рН 8,3, разведенных водой в соотношении 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера, В качестве красящих растворов используют Трис НС буфер с рН 8,5 в количестве 7 мл плюс 28 мл НзО, НАД - 2 мг, МТТ - 2 мг, ФМС - 3 мг плюс 5 мл спирта для идентификации алкогольдегидрогеназы. Для идентификации лактатдегидрогеназы используют состав: фосфатный буфер 0,5 М с рН 7,4 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н 20, лактат натрия 550 мл, ФМС - 2 мг, МТТ - 15 мг и НАД - 15 мг, 2 ил,Недостатком указанного способа является то. что он позволяет определять сравнительно малую часть иэоферментных систем в растении персика.Известен способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения (прототип), состоящий из приготовления частично очищенного препарата ферментов, нанесения его на гель, проведения электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, 1788969субстрат и систему тетразолюма с присутствием феназин-метасульфата и идентификацию ферментов по окрашенным полосам на геле.Недостатком данного способа является то, что он не дает возможность определения алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы,Цель изобретения - расширение диапазона определяемых изоферментов в персиковом растении.Поставленная цель достигается тем, что частично очищенный препарат ферментов наносят на полиакриламидный гель (20 ). В качестве буферных систем применяют маточную буферную систему в составе:Трис - 215 г, ЕДТА - 18 г, НЗВОз - 110 г, Н 20до 2,5 л при рН 8,3, разводимый в воде 1:7для электродного буфера и 1:3 для гелевогобуфера.При этом для идентификации алкогольдегидрогеназы (АДГ) (Е,С,1.1,1,1) в качествекрасящего раствора используют; Трис НСбуфер рН 8,5 7 мл + 28 мл Н 20, НАД - 25 мл,МТТ - 25 мл, ФМС 3 мг+ 5 мл спирта.Для идентификации лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Е.С,1,1.1.27) применяют фосфатный буфер в составе 0,5 м рН 7,4 - 7 мл+28 мл Н 20, лактат натрия 550 мл, ФМС - 2мг, МТТ - 15 мг, НАД - 15 мг,Заявленный способ отличается от прототипа составом буферных систем и содержанием красящих растворов, что даетвозможность дополнительно к известнымдегидрогеназам прибавить еще два изофермента АДГ (ЕС 1,1.1,1) и ЛДГ (ЕС 1,1,1,27),Э ф ф е к т достигается за счет того, чтообнаружение алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы позволяет расширить генетическую информацию о персиковомрастении и облегчает селекционную работус этой культурой,На фиг,1 изображены электрофоретические спектры АДГ из листьев персика, сорта: "Картули сапоби (1; 2) и "Беставашвили(3; 4); на фиг.2 - электрофоретические спектры ЛДГ из листьев персика, сорта: "Картули сапоби" (1; 2) и "Беставашвили" (3; 4).Способ осуществляется следующим образом: В качестве исходного материала используютт хорошо развитые, зеленые листьяоднолетнего побега 5-го, 6-го порядка, Образцы для исследования используют в 1 - 10дневный срОк, храня их при температуре+4,+5 С.Для гомогенизации используют растворв составе; 36 г сахарозы, 106 г аскорбиновойк-ты, 94 г цистейн гидрохлорида, до 100 мггелевого буфера, Раствор фильтруют. При растирании образцов добавляют битоестекло, Материал центрифугируют в течении 20 - 30 мин. При скорости вращения20000 об/мин.5 Частично очищенные препараты дегидрогеназ листьев персика наносят на полиакриламидный гель (20 ), проводятэлектрофорез при постоянном электрическом токе 220 Вольт при температуре +4,10 +9 С,В качестве буферных систем применяютматочную буферную систему в составе: Трис- 215 г, ЕДТА - 18 г, НЗВОз - 110 г, Н 20 до2,5 л при рН 8,3, разводимый в воде 1:7 для15 электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера.В качестве красителей используют 3 (4,5- диметилтиазолил 1 - 2) 2,5 - дефенил - тетразолий - бромид (МТТ) в присутствии фе 20 назинметасул ьфата (Ф МС),П р и м е р 1. Определение алкогольдегидрогеназы (Е,С,1,1,11). Суммарный препарат на геле помещают в кювету сраствором, содержащим: Трис НС буфер25 рН 8,5 - 7 мл + 28 мл Н 20НАД25 мгМТТ , 25 мгФМС 3 мг+5 мл спирт.Выдерживают в термостате при 37 С в30 течение 12 ч, Окрашенный препарат фиксируют в 10 -ной уксусной кислоте,П р и м е р 2. Определение лактатдегидрогеназы (ЕС,1.1.1.27). Суммарный препарат на геле помещают в кювету с раствором,35 содержащим:Фосфатный буфер 0,5 м рН 7,4-7 мл+ 28мл Н 20Лактат натрия , 550 мгФМС 2 мг40 МТТ15 мгНАД15 мг,Время проявления 1 час, при 37 С втермостате, фиксируют в 10 уксусной кислоте,45 Результаты опыта, Объектом исследования служили Грузинские сорта персика"Картули сапоби" и "Беставашвили". Дляпроведения анализа на участке (в Горийском районе) с каждого сорта выбирали по50 35 - 40 деревьев, Опыты проводились летом(июль) 1989 года и осенью (октябрь) 1990года.На фиг.1 и 2 приведены полученныеэлектрофоретические спектры АДГ и ЛДГ.55 Алкогольдегидрогеназа (ЕС 1,1,1,1) в листьях обоих Грузинских сортов персикапредставлена тремя компонентами; В 1 0,12;0,23 и 0,40 (см, фиг.1). Средние миграционные дистанции от начальной нулевой линиисоставляли 1,2; 2,3; 4,0 см соответственноМ О.И 3 О.Но О. О.б 07 б 0 2. Эи,1 иг.2 оставител ехред М.М Д. Ма градзе ентал Корректс едакт Юрковецкая акэз 83 ВНИИПИ Гос Тираж Подписноевенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент город, ул.Гагарина, 10 для каждой В 1. По числу и подвижности компонентов эти сорта между собой не отличались, Однако активность фермента у сорта "Беставашвили" по компоненту ВГ 0,12 была выше, чем у сорта "Картули сапоби". 5Лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.27) в листьях сорта "Картули сапоби" представлена двумя компонентами (см. фиг.2) ВТ 0,20 и 0,40. Средние миграционные дистанции от начальной нулевой линии составляли 2,0 и 10 4,0 см соответственно. В листьях сорта "Беставашвили" ЛДГ представлена тремя компонентами- В 10,20; 0,33 и 0,44. Средняя миграционная дистанция от начальной линии 2,0; 3,3 и 4,4 см соответственно для 15 каждой ВГ. При изучении индивидуальной изменчивости обнаружено, что различные деревья одного сорта в основном не 20 отличаются по компонентному составу по АДГ и ЛДГ, Электрофоретические спектры были стабильными в течение всего периода вегетации. Осенью активность ферментов уменьшалэсь. 25Предложенный способ позволяет определить дополнительно два изофермента, в частности АДГ и ЛДГ, чем достигается расширение диапазона генетической информации определяемых изоферментов, что имеет 30 большое значение для генетической и селекционной работы с культурой персика.Формула изоб ретения Способ определения дегидрогеназ в листьях персикового растения, включающий приготовление частично очищенного препарата ферментов из листьев, нанесение его на гель, проведение электрофореза с последующей инкубацией в среде, содержащей буферный раствор, субстрат и систему тетразолюма с присутствием феназинметасульфата и идентификацию ферментов по окрашенным полосам на геле, о т л и ч а ющ и й с я тем, что нанесение препарата осуществляют на 20 ф -ный полиакриламидный гель, а в качестве буферных систем используют маточный буфер в составе Трис - 215 г, ЕДТА - 18 г, НзВОЗ - 110 г, Н 20 до 2,5 л с рН 8,3, разводимый водой в соотношении 1:7 для электродного буфера и 1:3 для гелевого буфера, при этом в качестве красящих растворов используют Трис НС буфер с рН 8,5 в количестве 7 мл плюс 28 мл Н 20, НАД - 2 мг, МТТ - 2 мг, ФМС - 3 мг+ 5 мл спирта для идентификации алкогольдегидрогеназы и фосфатный буфер 0,5 М с рН 7,4 в количестве 7 мл+ 28 мл Н 20, лактат натрия 550 мл, ФМС - 2 мг, МТТ - 15 мг, НАД - 15 мг для идентификации лактатдегидрогеназы.