Способ получения фосфолипазы

МИТЕТИй И ОТН НИЕ ИЗОБРЕТ ПИ ОТО ЬСТИ В,В.Кулене и А.-С.А.Глемжа1) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (53) 57.15(088.8)(56) 1. 01 саюа 7., , Уаща 8 исЬд Т.Згпй 1 ез оп рЬоврЬо 1 разев Егош ЗГгерГоаусез .11. РогхЫсаГ 1 оп апй ргореггхеу ой Зггергошусев ЬасЬ 11 оепздз рЬоврЬо 11 раве Р.-"7.В 1 осЬеш.", 1975, В 2, т.8, с. 363-372.2Стрейкувене И.К., Некрашайте Г.И, и другие. Хроматография фосфолипазы 1). Зггергошусез сЫпашошецв на аииноалкилзамещенных сефарозах. "Прикладная биохимия и микробиология". Т. 18, вып. 1, 1982, с. 41-47,(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПА.ЗЫ 1) из бесклеточной культуральнойжидкости Зегерговусев с 1.ппашотеив,включающйй диализ и последующуюхроматографию, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличениявыхода и удельной активности целевого продукта, а также удешевленияспособа, хроматографию проводят насилохроме С, содержащем силанольные группы, осуществляя элюцию целевого продукта 8-12 мМ трис-НС 1буфером с рН 7,9-8 1 содержащим1,4-1,6 М хлористый натрий.11252Изобретение относится к микробиологической промышленности точнеек способам получения и очисткиФерментных препаратов, и может бытьиспользовано в технологии производ-.ства высокоочищенных ферментов.Известен способ очистки фосфолипазы П из Яггерговусея ЬасЬЦоепяя,включающий хроматографирование фильт.рата культуральной жидкости на ДЭАЭ- Оцелчюлозе, лиофилизацию, гельфильтрацию через сефадекс Г, лиофилизацию и препаративное изоэлектрофокусирование. Выход фосфолипазы Осоставляет 53,3 Х от активности фильтрата культуральной жидкости, удельная активность 630 ед/мг белка1 за . единицу активности фосфолипазыЮ принимают количество фермента,отщепляющее 1 вМ этанМамина за 201 мин при 37 С Я .Недостатками этого способа являются многостадийность и применениепрепаративного изоэлектрофокусирования на заключительной стадииочистки. Препаративное изоэлектрофокусирование является .сложнымметодом, требующим дорогостоящейимпортной аппаратуры, а последующая1отмывка пРепарата фермента отамфолинов ведет к снижению Ферментативной активности и препятствуетего применению для получения большихколичеств высокоочищенной фосфолипазы Э,35 46 3фосфолипазной активности на 1 г сорбента 21 .Недостатками известного способаявляются невысокий выход и удельнаяактивность целевого продукта, атакже высокая стоимость полученнойФосфолипазы 2 , так как для выделения фермента необходимо синтезировать специальный сорбент.Целью изобретения является увеличение выхода и удельной активностицелевого продукта, а также удешевление способа.Поставленная цель достигаетсятем, что согласну способу полученияфосфолипазы П из бесклеточной культу-ральной жидкости Яегерговусея схппавовецявключающему .диализ и последуюпрю хроматографию, хроматографиюпроводят на силохроме С, содержащем силанольные группы, осуществляяэлюцию целевого продукта 8-12 мМтрис-НС 1 буфером с рН 7,9-8,1,содержащим 1,4-1,6 М хлористый натрий.Сущность способа заключается втом, что хроматографию проводят наколонке с силохромом С, содержащим силанольные группы и характеризующимся удельной поверхностью 7090 м /г, диаметром пор 400-500 А,2ообъемом пор л,1,2-1,4 см/г, размеромзерен 80-160 мкм,.неправильной формой зерен, При хроматографии диалиэата культуральной жидкости на этомсорбенте сорбированная фосфолипазаэлюируется 8-12 мМ трис-НСбуфером, содержащем 1,4-1,6 М ЕаС 1,при рН 7,9-8,1.П р и м е р 1. Способ очисткифосфолипазы 3 из культуральнойжидкости Яггерговусея сьппавовеияв оптимальных условиях.Получение бесклеточной культуральной жидкости, содержащей фосфолипазу 3 . Продуцент фосфолипазыП.Яггерговусея сдппавовеия шт.11 02 Скультивируют на жидкой питательнойсреде следующего состава, г/л: соевая мука 30; фруктоза 1; КНауР 042;ИНЕС 3, при рН 7,2 в течение 48 чпри 30 С и скорости вращения качалкио"12,5 с . Клетки микроорганизмовотделяют центрифугированием при12000 Х у и температуре 2 С в течение 30 мин. 2530 Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения фосфолипазы П из бесклеточной культуральной жидкости40 ЯГгеровусея сппавовеця, включающий . высаливание бесклеточной культуральной жидкости сернокислым аммонием до 807.-ного насьпцения с последующим диализом против 20-ти кратного объ ема 10 мМ трисС 1 буфера рН 8,0 у содержащегоМ НаС 1, в течение 18 ч при 4 С и хроматографию на нонилОГ аминооксипропилсефарозе. Выход фермента 543 от общей активности фосфолипазы 3 в культуральной жидкости, удельная активность препарата 1700 ед/мг белка(за единицу активности фосфолипазы 2 принимают количество Фермента, которое выделяет 1 р 9 55 титруемых щелочью кислот за 1 мин при 37 Ср Сорбционная емкость нонилО Ъаминооксипропилсефарозы 1300 ед. Диализ. Бесклеточную культуральную жидкость в объеме 34 мл диализируют против 10 мМ трисбуфсра рН 8,05246Сорбция фосфо-.липазы по акУсловия сорбции Условия элюции Элюция Удельная активность, мкг.экв/мг рН МолярностьНаС 1, мМ,Молярность буфера, мМ Выход по акрН тивности, впроцентахот нанесенной тивности,% гЗаказ 8435/18 Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д.4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 112в течение 18 ч при 4 С. Выпавшййосадок отделяют центрифугированиемпри 2000 Х я и 2 оС в течение30 мин. Активность диализата культуральной жидкости 32,7 ед/мл, белка0,23 мг/мл, удельная активность142,2 ед/мг белкафктивность определяют по методу прототипа),Хроматография диализата культуральной жидкости на силохроме С.Хроматографию проводят на стекляннойколонке размером 0,5 х 5 см, содержащей 0,33 г силохрома С, уравновешенного 10 мМ трис-НС 1 буферомрН 8,0. Скорость протекания во времясорбции и промывки 0,2 мл/мин. 34 млдиализата культуральной жидкости,содержащего 7,84 м белка и 1112 ед.активности фосфолипазы 3 , накосятна колонку. Несорбированные белкиотмывают 50 мл исходного буфера,сорбированную фосфолипазу 1 элюиру-.ют 10 мМ трис-НС 1 буфером рН 8,О,содержащим 1,5 М НаС со скоростьюпротекания 2,5 мл/мин. Выход фосфолипазы 3 90,6%, удельная активностьпрепарата 2664 ед/мг белка,П р;и м е р 2. Получение бесклеточной жидкости и диализ проводятпо примеру 1. Для сорбции и элюциииспользуют буфер с молярностью 8 или12 мМ. Выход и удельная активностьфосфолипазы при замене 1 О мМ буфера1 на 8 или 12 мМ практически не изменяется. Влияние рН буфера и молярностихлористого натрия на эффективностьразделения фосфолипазыи примесныхбелков при хроматографии., иа силохроме С, приведены в таблице,Приведенные примеры показывают, чтодля достижения положительного эффектанеобходимо использовать для элюцииб 8-12 мМ трис-НС 1 буфер с рН 7,9-8,1,содержащий 1,4-.1,6 М хлористый натрий.Снижение рН буфера приводит кдестабилизации фермента, а увеличение рН не позволяет осуществить сорбцию за счет приближегий к .иэоэлектрической точке(8,44),Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта в 1,7 раза, а удельнуюактивность в 1,6 раз, по сравнениюс известным способом. Следует такжеотметить, что сорбционная емкостьсилохрома Св 7 раз выше сорбциоиной емкости нониламинооксипропилсефа-.25розы, используемой для очистки фосфо.- липазы З по известному способу.Кроме того, предлагаемый для очистки .фосфолипазы З силохром Сявляетсядешевым широкодоступным сорбентом,30который можно успешно использоватьв технологии очистки больших количеств фосфолипазы 0