Способ получения днк-полимеразы 1 еsснеriснiа coli

(51)5 С 12 К 9/14//(С 12 Н 9/14, С 12 К 1:19) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ В качестве продуцентд НКразы 1 используют лиэогенныйЕасЬсгдсЬда со 11 НМ 964 (ВКПинфицированный термоиндуцирулиэогецным флгом 11 имеющимКлетки БасЬегсЬд со 1 Я 1 9шают в 0,01 М калийфосфатномрН 7,4, содержащем 0,001 М /каптоэтанола, 0,0001 М ЭЛТЛ илиэоцима, обломки клеток оса полимек способам на нуклеино пособам поИзобр етение относится я ферментов обме от, а именно к с ЛНК-полимераэы 1 находит применен ых экспериментах изобретения " по дельной активнос об осуществляют с щтдммР), мымец ро 1 Л.4 Разрубуфере с -мер 5 мг/лдают получен вых кис Е.со 11е в геннолучения которая инженер11 ель вьппение выти фермента.ледующим об хода иСпосразом. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЧНРЫТИЯМПРИ ГКНТ ССОР(71) Научно-производственное объединение Фермент" и Всесоюзный научноисследовательский институт особо чистых биопрепаратов(57) Изобретение относится к способам получения ферментов обмена цукле иновых кислот, л именно к способам получения ЛНК-полимераэы 1 1;зсЬег 1- сЬда со 1. инфицированной лиэогенным фагом Л,которая находит применсцце в генцоинженерних эксперимента.11 елЬ изобретения - повыпецие выхода ЯО 1622393 А 1 ги удельной активности дермецта. Изобретение заключается в том, что после разрушения клеток, осаждения Фермента иэ клеточного экстракта полимином 11, Фракционировлния сульфатом аммония и обессолнвлния осуществляют хромлтографическую очистку в три стадии: на солозе КГ О/24, с элюцией в линейном градиенте хлористого калия от 0 до 1,0 М в буферном растворе, на С 1, сефароэе 6 В, связлцной с лиглцдом-красителем красно-коричневым 2 К при соотноюениц 1,2-2,4 мкМ красителя нл 1 мл сефлроэы, при элюциц в линейном грлдиецте хлористого калия от 0 до 08 М в буферном растворе, и на голоэе АГ прц элюцци фермента в аналогичных условиях. При этом на всех стадиях очистки в качестве исходцого используют 0,005 в ,05 М кдлийфосфатцый буфер, содержащий 0,0005-0,005 М /Ъ-мерклцтоэтанолд и 0,05-0,5 мМ ЭЛГЛ рН 7,0-8,0. Изобретение позволяет получить выход ДНК- цолимердэы 1 457, с удельной активностью 16000 ед./мг белка. 1 табл.Получение аффинного сорбента - СЬ сефарозы 6 Я - красно-коричневый 2 К.К 180 мг СЬ сефарозы 6 В прибав"о ляют 40 мл воры, нагревают до 60 С и при перемешивании механической мевалкой прибавляют небольшими порци" ями 478 мг красно-коричневого 2 К, растворенного в 20 мл воды. После перемешивания в течение 30 мин прибавляют 24 г ЮаС 1 и перемешивают при 60 С еще 1 ч. Смесь нагревают до 80 ОС, прибавляют 2,1 г НаСОи, перемешивают 2 ч, фильтруют и отмываютохолодной и горячей (80 С) водой до попучения бесцветного фильтратя. Получается сорбент, содержащий 1,4 мкИ красителя красно-коричневого 2 К ня мл СЬ сефарозы 6 В. Приготовленный сорбент СЬ сефароза 6 В - красно-коричневый 2 К имеет формулу СООНОН.ц / 162239 центрифугированием при 10000 8 е те-чение 1 ч. Осадок отбрасывают, а щентрифугат используют для выделения фермента, Фермент и нуклеиновые кислоты осаздают иэ экстракта 0,6 Х-ньв раствором полимина П с экстракцией из. осадка ДНК-полимераэы 1 0,5 И раствором калия хлористого, фракцнонируют сульфатом аммония, обессоливают и хроО матографируют на колонке с еолоэой КГ О/24 в линейном градиенте КС 1 от 0 до 1,0 М в 0,005-0,05 И калийфосфатном буфере с рН 7,0-8,0,содерзащей 0,0005-0,005 И Р-меркаптоэтанола и 15 0,05-0,5 мИ ЭДТА.Вдальнейшем фермент обессоливают диализом и проводят хромотографию на колонке с СЬ сефарозой 6 В, связанной с лигандом-красителем красно-коричневым 2 К, при соотноше нии 1,2-2,4 мкИ красителя на мл сефароэы, в линейном градиенте КС 1 от О до 0,8 И в аналогичном буфере, как и на солоэе КГ О/24. Фермент обессоливают диализом и проводят хромато графию на колонке с солозой АГ в линейном градиенте КС 1 от 0 до 0,8 И в аналогичном буфере, как и на солоэе КГ О/24, Хроматографическая стадия на солоэе КГ О/24 улучшает очистку ДНК полимеразы 1 от большей части балластных белков: очистка достигает 96 раэ, выход 65-70 Х (в известном способе соответственно в 2,5 раза и 39 Х). Хроматография на С 1. сефарозе 6 В - красно-коричневый 2 К приводит к значительной очистке препарата ДНК-полимеразы 1 от дезоксирибоэндонуклеазных примесей. Вйход фермента на этой стадии 49-50%, очистка - 62,7 раз в иэ вестном способе соответственно 467, и 50 раэ). При хроматографии на солоэе АГ выход фермента составляет 40-45 Х, очистка 880 раэ по известному способу соответственно ЗОХ и 76 раэ). По 45 данным электрофореза на ПААГ в присутствии ЭБ-КА чистота ДНК-полимеразы 1 составляет 83,2 Я. Препарат прак тически своборен от деэоксирибоэндонуклеазных примесей, 50П р и м е р 1. Получение сорбента - солозы КГ О/24. Приготовление дисперсной среды Я реактор, снабженный мешалкой, обратным холодильником и термометром, вводят 325 мп тридекана н стабилизаторы суспензии (9 мл) Зрапи (0,7 мл) Ъгееп, перемешивают при комнатной температуре в атмосфере аргона. Приготовление дисперсной фазы. Я отдельной емкости проводят при перемешивании растворение в смеси 30 мас.ч. диметилформамида и 42 мас.ч. воды следующих компонентов, мас,ч.: метакриловая кислота 4,1, метиленбисакриламид 2,7, персульджт аммония 1,03, при комнатной температуре. Полученный раствор представляет собой дисперсную фазу.Формирование эмульсии н полимериэация. В дисперсионную среду прн перемешивании и барбатахе аргоном вводят дисперсную фазу. Включают обогрев реактора и проводят полимеризацию при 70 С в течение 5 ч. Далее гранулы сорбента отделяют от реактора фильтрованием, отмывают водой и детергентом и зятем дНстиллированной водой. Фракционируют мокрым рассевом на ситах, выделяя фракцию 80- 120 мкм.62Для опреЛеления концентрации красно-коричневого 2 К на сефарозе р элю-,енте измеряют оптическую плотностьпри 525 нм и согласно молярноиу коэффициенту экстинкции красителя(13500 м ф л см ) находят количество непрореагировавщего красно-коричневого 2 К, Из разницы между взятым количеством красно-коричневого 2 Ки найденным в элюенте находят количество лигандд в икмолях нд мл сефароэыПолучение сорбента - солозы АГ.Приготовление лнсперсной срелы.В териостативный реактор емкостью1,5 л, снанбженный механической мешалкой с регулируемым числом оборотов, холодильником и трубкой ллябарбатирования аргона, помещаюттрирекан (600 ч), сорержащнй арап,проводят барбатаж аргоном в течение 0,5 ч.Приготовление дисперсной Фазы. Вотдельной емкости на 0,5 л приготавливают раствор лиэтиламиноэтилметакрилаиила (26 ч .) в 1,7 М растворе ндтрия хлористого (360 ч.) и титруют лорН 7,6 соляной кислотой. В растворвводят метиленбисакрилямил (4 ч.)и инициатор - персульфдт дииония(0,8 ч.), которые растворяют при нд"гревании в течение 2 мин,Полииеризация. В рисперсую средупри переиещивании 300 об./мин в течение 15 мин при комнатной температуре вводят дисперсную Фазу. Включают обогрев реактора при 70 С. Прооцесс полииериэации проводят в течение 3 ч. Иещалку выключают, грднулысорбента отделяют от реактора дельтрованием, отмывают от тридекднд водойс детергентои и многократно водой.фракционируют мокрым рассеяом наситах, выделяя Фракции 50-.100 мкм и100-200 мкм.Вьделение и очистка ДНК- полимераэы 1.а) Для получения Ферментного экстракта 250 г клеток Е.Со 11 КИ 964суспендируют в 1400 мл 0,01 И калийфосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,001 М 5-меркаптоэтанола, 0,0001И ЭДТА и 65 мг/л лизоцииа. Суспенэиюставят в ледяную баню и перемеаиваютстеклянной палочкой до получениягомогенной суспенэии, Суспеиэии кле"ток обрабатывают экструзиоииьи деэинтеграторои. Обломки клеток осаждают центрифугироваиием при 10000 В 2393 Ьв течение 1 ч. Выпавщий осдлок отбрасывают, центрифугят (560 мл) используют для выделения Фермента.б) фракционнрование ферментногоэкстракта полимином 11 и сульфатомаммония. К центрифугату (1560 ил),полученному нд предьдущей стадии,при постояннои перемещивянии в течение 30 мин добавляют 203-ный растворполимина 11 (48 ил) ло конечной концентрации 0,6 г После добавления всего объема полимина 11 переиещиваниепродолжают еще 30 мин, Экстракт цент Рифугируют в течение 10 иин при5000 е. Супернатант сливают, я полученный осадок суспенлируют в 780 ил0,01 М калийфосфатного буфера с рН 7,4содержащего 0,001 М /3 -меркаптоэта- Ю иола, 0,0001 М ЗДТА и 0,05 И КС 1.Суспензию центрифугируют в течение10 мин при 5000 В. Супернатант сливавают, а ДНК-полииеразу. 1 экстрагируютиэ осадка 1200 ил 0,01 И калийфосфат ного буфера с рН 7,4, содержащего0,001 М ф -иеркаптоэтанола, 0,1 мИЗЛТА и 0,5 И КС 1, Суспенэию центрифугируют в течение 10 мин при 5000 р,К супернатанту (1210 мл) лобявляют 30 сухой сульфат аммония ло 70 Х насыщения. Осадок собирают, растворяют в150 мл 0,01 М калийфосфатного буферас рй 7,4, содержащего 0,001 М /5-иеркаптоэтанола и 0,1 иИ ЭДТЛ, помещают З 5 в Лиалиэную трубку и диалиэуют в течение 18 ч против 5 л указанного буфера. Получают 180 мл дидлиздта.в) Хроматография 7 НК-полииеразы 1на колонке с солозой КГ О/24. Диализат 40 фермента (180 мл) подвергают хроматографии на колонке (5 25 си) с солоэойКГ О/24, уравновевенной диализным буфером. После нанесения Фериентногораствора колонку промывают 1000 мп 5 исходного буфера. Элюирование Фермента осуществляют линейным градиентом(3 л) КС 1 от 0 до 1,0 М в исходномбуфере, Собирают Фракции по 20 ил,ДНК"полимераэа Е элюируется в преде лах 0,25-0,30 И КС 1. Активные Фракцииобъединяют. Получают 98 кь Фермент-.ного раствора, который диалиэуют втечение 18 ч против 3 л 0,01 И калийфосфатиого буфера с рН 7,4, солержа щего 0,001 И (-меркаптоэтанола иО, мИ ЭДТА. Получают 100 ил диалиэатйг( Хроматография ДНК-полииераэы 1иа колонке с СЕ, сефарозой 6 В - красно 7 1622393коричневый 2 К. Диализат ДНК-полимеразы 1 Е.со 1 (100 мл) подвергают хроматографии на колонке (1,5 ю 25 см) сСЬ сефароэой 6 В " красно-коричневый 2 К, содержащий 1,4 мкМ красителя5в 1 мл сефарозы, уравновешенной диализным буфером. После нанесения Ферментного раствора, колонку промывают100 мл исходного буфера. Элюирование 10фермента осуществляют линейным градиентом (400 мл) КС 1 от 0 до 0,8 М висходном буфере. Собирают Фракции по8 мл. ДНК-полимераза элюируется впределах 0,20-0,25 М КС 1. Активныефракции объединяют и диалиэуют в течение 18 ч против 2 л 0,01 М калийфосфатного буфера с рН 7,4, содержащего 0,001 М-меркаптоэтанола иО, 1 мМ ЭДТА, Получают 40 мл диализата.д) Хроматография ДНК-полимеразы 1на колонке с солозой АГ. Диализатфермента (40 мл) подвергают хроматографии на колонке (110 см) с солозой АГ, уравновешенной диализным ,буфером. После нанесения Ферментного раствора колонку промывают 30 мл исходного буфера, Элюирование Фермента осуществляют линейным градиентом (100 мл) КС 1 от 0 до 0,8 М в исходном буфере. Собирают Фракции по 2,5 мл. ДНК-полимераза 1 элюируется в пределах 0,25-0,3 М КС 1. Активные фракции объединяют и используют для концентрирования.е) Концентрирование конечного препарата. Объединенные Фракции (17 мл) диализуют против 1 л 0,1 М калийЬосфатного буфера рН 7,4, содержаще го 0,001 М дитиотрейтола и 507, глицерина (по обему). Диалиэ продолжают в течение 16 ч, Препарат помещают в предварительно охлажденную емкость и хранят при -20 С. Выход ДНК-полномеразы 1 составлят 457 с удельной активностью 16000 ед/мг белка.Активность ДНК-полимеразы 1 определяют по включению в активированную тимусную ДНК (обработанную панкре 50 атической дезоксирибонуклеазой). За единицу активности принимают то количество ДНК-полимеразы 1, которое при 37 С за 30 мин включает 10 наномолей дезоксирибонуклеозидфосфатов в55ДНК-матрицу.Основным показателем качества ДНК- полимеразы 1 является отсутствие дезоксиэндонуклеазных примесей. П р и м е р 2, Способ получения ДНК-полимеразы 1 осуществляют аналогично примеру 1, однако при хромато-графии на колонках с солозой КГ О/24 СЬ сефарозой 6 В - красно-коричневый 2 К, содержащей 1,2 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,005 И калийфосфат с рН 7,0, 0,0005 М /5-меркаптоэтанола и 0,05 мм ЭДТА. Выход фермента составляет 443 с удельной активностью 15500 едмг белка.П р и м е р 3. Способ получения ДНК-полимеразы 1 осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солоэой КГ О/24, СЬ сефарозой 6 В - красно-коричневый 2 К, содержащей 2,4 мкМ красителя/мл сефароэы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,05 И калийфосфат с рН 8,0, 0,005 М /3-меркаптоэтаноля и 0,5 мМ ЭДТА. Выход фермента составляет 427 с удельной активностью 15000 ед/мг белкаП р и м е р 4. Способ получения ДНК-полимеразы 1 осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солозой КГ О/24, СЬ сефарозой 6 В - красно-коричневый 2 К, содержащей 3 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,1 М калийфосфат с рН 8,5, 0,01 М-меркаптоэтанола и 1 мИ ЭДТА. Выход фермента составляет 357, с удельной активностью 10000 ед/мг белка.П р и м е р 5. Способ получения ДНК-полимеразы 1 осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонках с солозой КГ О/24, СЬ сефарозой 6 В - красно-коричневый 2 К, содержащей 1 мкМ красителя/мл сефарозы, и солозой АГ используют исходный буфер, содержащий 0,001 М калийфосфат с рН бу 5 у Оу 0001 М У-мер - каптоэтанола и 0,01 мИ ЭДТА, Выход фермента составляет 257 с удельной активностью 8000 ед./мг белка.Результаты представлены в таблице,Таким образом, преимущество предлагаемого способа заключается в том, что получают высокоочищенный препарат с выходом 45 Х (по известному способу 307,)у удельной активностью 16000 ед./мг белка (по известному способу 8394 ед./мг) и концентрацией фермента 31,8 ед,/мкл (по извест" ному способу 1 О ед./мкл). По сравне1622393 нию с известным способом выход увеличивается в 1,5 разя, удельная активность почти в 2 раза, а концентрация активности более, чем в три разя,Хроматогряфическую очистку проводятна отечественных сорбентях. ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Выхол и якти меразы 1 Выход фермента, Х Пример Удельнаяактивность,ел/мгбелка Концентрация фермента, ед/мкл Из" вестный 1 2 3 4 5 30 8394 45 16000 44 15500 43 15360 35 10000 25 8000 1031,831312010 Составитель Е. ВоробьеваТехрел Д.Олийнык Корректор М.Демчик Редактор Н.Яцола Заказ 88 Тирах ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по иэоорниям и открытиям пртиям п и ГКНТ СССР13035, Москва, В, Раувская наб., д. 4/5 П оизводственио-издательский комбинат Патент , г.уагор д, у . р1 ф У о л. Гага ина 101Р Способ получения ЛНК-полимерязы 1 ЕесЬет 1 сИа со 11, прелусмятривяющий использование пролуцентя, инифицированного тврмоинлуцируемым лизогенным фагом 9, раэрувение клеток, центрифугирование, осветление фермента и нуклеиновых кислот из экстракта поли- мином 11, фракционирование сульфатом аммония и обессоливание с последующей очисткой хроматографией с концентрированием конечного продукта,о т л ич а ю Ю и й с я тем,что,с целью ловы",фермента, очистку хроматографиейосуществляют ня колонке с солозойКГ О/24 с использованием исходного0,005-0,05 И калийфосфатнлго буфера,содержащего 0,0005-0,005 И /3-мер"каптоэтанола и 0,05-0,5 мМ-ом ЭДТАрН 7,0-8,0 к элюции в линейном градиенте хлористого калия от 0 Ло1,0 М в буферном растворе, зятемпроводят хроматографию на колонке сС 1, сефароэой 68, связанной с лигандом-красителем красно-коричиевыю 2 К 5 при соотновении 1,2-2,4 мкИ красителя на 1 мл сефярозы, с использованиемтого ае исходного буфера и элюции влинейном градиенте хлористого калияот 0 до 0,8 И в буферном растворе, и 20 хроматографию ия колонке с солоэойАГ с тем ме исходным буфером и в аналогичных условиях элюции.вность /НК-поли